Metabolismo y Bioquímica de LAB y Especies Asociadas A Lácteos

6 Metabolismo y bioquímica de LAB y especies
asociadas a lácteos
Palmiro Poltronieri1, Giovanna Battelli2 y
Nicoletta Pasqualina Mangia3
1Instituto de Ciencias de la Producción de Alimentos (CNR-ISPA), CNR, Consejo Nacional de
Investigación de Italia, Lecce, Italia
2 ISPA-CNR, Instituto de Ciencias de la Producción de Alimentos, Milán , Italia
3 Departamento de Agricultura, Universidad de Sassari, Italia
6.1 INTRODUCCIÓN
Las bacterias del ácido láctico (LAB) son ampliamente utilizadas para la producción
industrial de productos lácteos fermentados y forman unaserie de bacterias Gram
positivas relacionadas con bajo contenido de GC. Las LAB tienen la capacidad de
producir ácido láctico durante el metabolismo homo‐ o heterofermentativo. La
acidificación y los procesos enzimáticos que acompañan el crecimiento de LAB afectan
el sabor, la textura y lascualidades reservativas. Las aplicaciones lácteas industriales de
especies LAB dependen de Lactococcus lactis (Lc. lactis), Lactobacillus (Lb.) spp.,
Leuconostoc (Ln.) spp., Pediococcus (Pd.) spp. y Streptococcus (S.) thermophilus .
Las cepas LAB tecnológicamente relevantes se aplican como cultivos iniciadores o se
encuentran como principales especies no iniciales, o se agregan como probióticos
administrados a través de productos lácteos. Los beneficios incluyen una influencia
positiva en la microbiota normal, la exclusión competitiva de patógenos y la
modulación de lainmunidad de la mucosa.
La composición de la pared celular difiere ligeramente en varias especies de LAB.
Las diferencias de peptidoglicano se encuentran en los aminoácidos utilizados en las
secuencias peptídicas unidas a través de enlaces peptídicos entre cadenas y en ácidos
teicoicos, dando fuerza y rigididad a través de la unión de iones de magnesio. La
presencia de ácido meso-diaminopimélico en la pared celular de Lactobacillus
plantarum es una de las diferencias clave con respecto a las otras especies. El tipo Lys‐
d‐Asp es predominante en el género Lactobacillus y es útilpara diferenciar, a nivel de
especie, Weissella de otras LAB y Lactobacillus reuteri de Lactobacillus fermentum
(Orn‐d‐Asp) (Dellaglio y Felis, 2005).
Este capítulo revisa la bioquímica de las especies de LAB, el uso de carbohidratos
para la producción de energía y la proteólisis de LAB. Se presenta la producción de
sabor y el origen de compuestos específicos.
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Microbiología en el procesamiento de lácteos: desafíos y oportunidades, primera edición.

Editado por Palmiro Poltronieri.
© 2018 John Wiley & Sons Ltd y el Instituto de Tecnólogos de Alimentos.
Publicado en 2018 por John Wiley & Sons Ltd y el Instituto de Tecnólogos de Alimentos.
Microbiología en el procesamiento de lácteos
6.2 SUSTRATOS DE CARBOHIDRATOS, GLUCÓLISIS Y PRODUCCIÓN

DE ENERGÍA
Las especies de LAB pueden utilizar un amplio conjunto de fuentes de carbono, una
capacidad que probablemente contribuya a su capacidad de adaptación. La adaptación
a nichos ambientales ha influido en el genoma de las especies de LAB, con lacapacidad
de utilizar azúcares no disponibles en el entorno lácteo y explotar la vía Embden -
Meyerhof-Parnas (EMP) así como la vía del fosfato de pentosa (PPP).
Las especies LAB metabolizan la glucosa a fosfoenolpiruvato (PEP) a través de la
glucólisis. La PEP puede servir como punto de ramificación en la vía productora de
formiato, acetato y etanol (vía C3).
En Lactobacillus brevis, Lb. reuteri y otras especies que dependen de la
heterofermentación facultativa (Tabla 6.1), los sistemas fosfotransferasa (PTS) y
glucolíticos e nzymes permiten que los azúcares se metabolicen a través de la vía EMP
(Saier et al., 1996). La fructosa se utiliza como aceptor externo de electrones para la
reoxidación de NAD(P)H producida en la fermentación de pentosa (Zaunmüller et al.,
2006; Kang et al., 2013a, 2013b): la presencia de fru ctosa-1,6-bisfosfato aldolasa,
fosfofructoquinasa y fosfoglucoisomerasa aseguran la explotación de la vía glucolítica
(Arsköld et al., 2008).
La absorción de carbohidratos puede ocurrir en LAB a través de PTS, bombas de
cassette de unión a ATP (ABC) o transpós rters de glucósidos(Lorca et al., 2010). En
Bifidobacterias, se demostró que las cepas probióticas adaptadas al tracto
gastrointestinal poseen transportadores de carbohidratos específicos de tipo ABC para
oligosacáridos, que se metabolizan a acetato (Fukuda et al., 2012).
La glucólisis se caracteriza por laformación de fructosa-1,6-difosfato (FDP), que es
dividida por la aldolasa FDP en dihidroxiacetona-fosfato (DHAP) y Tabla 6.1 LAB
metabolismo y tipo de fermentación.
Un Homofermentativo Heterofermentativo
Glucosa fermentada ≥85% 50%
Producido:CO2, acetato, etanol – +
Glucosa‐CO2 − +
Fructosa difosfato Aldolasa + −
B Homofermentativo Heterofermentativo aHeterofermentativo

facultativo obligado
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Hexosa: lactato + + −
Hexosa: lactato, acetato, − − +
etanol,CO2
Lactato, acetato, formiato, Dependiente de la cepa +
etanol, bajo limitación de
glucosa
Pentosa fosfocetolasa − + +
Gluconato fermentado − + +
a
Fuente: Hammes y Hertel (2003).
Metabolismo y bioquímica de LAB y especies asociadas a lácteos
gliceraldehído-3-fosfato (GAP). GAP se convierte en piruvato en una secuencia

metabólica que incluye la fosforilación a nivel de sustrato. Un mol de glucosa resulta
en 2 moles de ácido láctico y una ganancia neta de dos ATP.
Es necesario señalar que la glucólisis puede conducir a la fermentación heteroláctica
bajo ciertas condiciones, y algunas BAL, consideradas homofermentativas, utilizan el
PPP al metabolizar ciertos sustratos (Axsellson y Ahrné, 2000).
La vía EMP (glucólisis) no es utilizada porlactobacilos heterofermentativos
obligados, Leuconostoc, Weissella spp. y algunas otras especies de LAB.
La lactosa se absorbe a través del PTS dependiente de fosfoenolpiruvato y entra en
el citoplasma como fosfato de lactosa, que es escindido por la fosfo-β-d-galactosidasa
para producir glucosa yd galactosa-6-fosfato. El operón de lactosa puede estar
localizado en plásmidos. La inestabilidad de varias propiedades fenotípicas de las BAL
está relacionada con la presencia de plásmidos. Los sistemas enzimáticos de lactosa-
PTS y P-β-gal son generalmente inducibles y reprimidos por la glucosa.
La glucosa es fosforilada por la glucoquinasa y metabolizada a través de la vía
glucolítica o PPP. La galactosa-6-fosfato se metaboliza a través de la vía tagatosa-
6fosfato, mientras que la vía de Leloir es utilizada por las BAL de fermentación de
galactosa, que atraviesan galactosacon una permeasa y carecen de galactosa-PTS
(Grossiord et al., 2003).
Algunos de lactobacilos termófilos, como Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, Lb. delbrueckii subsp. lactis y Lactobacillus acidophilus sólo metabolizan
la fracción de glucosa después del transporte de lactosa y la actividad β-gal, mientras
que la galactosa se excreta en el medio.
6.2.1 Vía de la pentosa fosfato

En el PPP, el paso clave es la división de la fosfocetolasa (PK) de xilulosa-5-fosfato a
GAP y acetilfosfato. GAP se convierte en lactato y acetilfosfato en acetato y etanol.
La fermentación heteroláctica da 1 mol de ácido láctico, etanol y CO2 y 1 ATP por mol
de glucosa.
En general, los lactobacilos heterofermentadores facultativos y obligatorios utilizan
pentosas para la producción de energía. Las permeas específicas transportan azúcares
intracelularmente, donde las pentosas son fosforiladas y convertidas por epimerasas e
100
isomerasas en ribulosa-5-fosfato o xilulosa-5-fosfato, que pueden ser metabolizadas
por la mitad inferior del PPP.
6.2.2 Fermentación del citrato

El citrato sirve como fuente de energía para LAB. Las especies de BAL poseen un
plásmido que contiene genes que codifican para el transportador de citrato (Bandell et
al., 1998). El citrato es convertido por citrato liasa en acetato yoxa loacetato, luego
descarboxilado a piruvato (Wagner et al., 2005). Esto puede convertirse en acetil-CoA
(a través de piruvato deshidrogenasa), que conduce a acetato (a través de acetato
quinasa) y acetaldehído / etanol (a través de alcohol deshidrogenasa), o a formiato (a
través de piruva te formiato liasa), o a α-acetolactato (a través de acetolactato sintasa),
que conduce a acetoína (acetolactato descarboxilasa), a diacetilo y 2,3 butanodiol (a
través de diacetil / acetoína reductasa), y a lactato (a través de lactato deshidrogenasa).
Metabolismo y bioquímica de LAB y especies asociadas a lácteos 101
La energía se produce mediante la conversión de acetil-CoA en acetato: el citrato

actúa como aceptor de electrones, lo que resulta en una alta producción de acetato y
ATP a través de la vía de la quinasa de acetato.
Energy se produce durante la descomposición inicial del citrato en piruvato. En Lc.
lactis subsp lactis biovar diacetylactis la captación de citrato está acoplada a la
generación de una fuerza motriz protónica lo suficientemente fuerte como para impulsar
la síntesis adicional de ATP. El diacetilo, la acetoína yel acetaldehído tienen
propiedades aromáticas distintas. El diacetilo da aroma al queso fresco, leche
fermentada, mantequilla y crema. Además, se produce CO2, que aumenta la textura de
los productos lácteos fermentados (Kimoto et al., 1999).
La producción de succinato a partir de citrate se debe a la presencia de citrato liasa,
malato deshidrogenasa, fumarasa y succinato deshidrogenasa. Se estudió un supuesto
ciclo de ácido cítrico (PCAC) en Lb. casei (Diaz‐ Muñiz et al., 2006). Esto puede
conducir a dos ATP por molécula de citrato. Al analizarlos productos finales durante el
crecimiento en un medio definido y queso cheddar, estos autores identificaron varios
ácidos orgánicos. Además, Lb. casei produjo ácido d-láctico, acetoína, ácido fórmico,
etanol y diacetilo, pero no butanodiol o ácido málico.
6.3 PROTEÓLISIS, SUSTRATOS DE PROTEIN Y DISPONIBILIDAD DE

AMINOÁCIDOS QUE INFLUYEN EN LA EXPRESIÓN GÉNICA
La proteólisis se considera uno de los procesos bioquímicos más importantes
involucrados en la fabricación de muchos productos lácteos fermentados (Fox, 1989)
porque las cepas LAB han evolucionado paraadaptarse a las proteínas de la leche
(caseínas, proteínas de suero).
En la fabricación de queso, la proteólisis de la caseína desempeña un papel esencial
porque los aminoácidos resultantes de la proteólisis son los principales precursores de
compuestos de sabor específicos debido a los cambios catabólicos secundarios (por
ejemplo, desaminación,descarboxilación, transaminación, desulfuración, catabolismo
de compuestos aromáticos); cambios en la matriz del queso, cambios en la textura de la
cuajada del queso, disminución de la actividad del agua (a w) a través de la unión al
agua por los grupos carboxilo y amino, unaumento del pH a través de la liberación de
aminas y NH3 (McSweeney y Sousa, 2000).
En la mayoría de las variedades de queso, la hidrólisis inicial de las caseínas es
causada por el coagulante y, en menor medida, por la plasmina. Los coagulantes son
responsables de la proteólisis primaria porque desestabilizan la estructura coloidal de
la caseína al cortar el enlace peptídico entre Phe 105 y Met 106 en la fracción de κ-
caseína, mientras que la proteólisis secundaria resulta de la actividad de las proteasas y
peptidasas de bacterias iniciadoras o no iniciadoras que convierten la casein en péptidos
de menor peso molecular y aminoácidos libres (FAA) (Ozer y AkdemirEvrendilek,
2015).
El papel principal de LAB es la actividad acidificante; Las BAL proporcionan las
enzimas proteolíticas, incluyendo oligoendopeptidasa, di-peptidasas y tri-peptidasas,
102 Microbiología en el procesamiento de lácteos
aminopeptidasa y una serie de peptidasas específicas de prolina que contribuyen a la

maduración del queso con la proteólisis secundaria en el queso.
Las proteasas y peptidasas son liberadas por microorganismos en su lisis, y sus
actividades dependen de las condicionesambientales que prevalecen en la cuajada (es
decir, la actividad del agua, el pH, el contenido mineral y el potencial redox), así como
de las condiciones proporcionadas durante la maduración (es decir, temperatura, tipo
de adición de sal, naturaleza de la microbiota secundaria añadida o natura). lly en
desarrollo) (Law y Wigmore, 1983; Christensen y otros, 1999; Pereira et al. 2010;
Hayaloglu y McSweeney, 2015).
Muchos autores informaron la influencia de las BAL proteolíticas en la fabricación
de queso (Oommen et al., 2002; Madrau y otros, 2006; Di Cagno y otros, 2010; Chaves‐
López et al., 2014; Poveda et al., 2015; Pedersen et al., 2016), destacando la importancia
de la selección de cepas proteolíticas para fabricar quesos con funcionalidad definida
(Oommen et al., 2002).
Las caseínas se clasifican como αs1‐, αs2‐, β‐ y κ‐caseínas; cada tipo contiene un
gran número de residuos de prolina que previenen la formación de α hélices y láminas
de β y promueven la formación de bobinas aleatorias. Juntas, las características de la
estructura secundaria conducen a una molécula op en no estructuradasusceptible a la
acción de las proteinasas de la envoltura celular (CEP) (Fox, 1989, 1993).
Los CEP contribuyen a la formación de péptidos pequeños en el queso hidrolizando
péptidos más grandes producidos a partir de αs1-caseína por quimosina o de β-caseína
por plasmina.
6.3.1 Proteinasas de la envoltura celular: el sistema Prt

El complejo sistema proteolítico de LAB comprende una proteinasa de envoltura
celular (CEP), que tiene una fuerte preferencia por las caseínas hidrófobas (Savijoki et
al., 2006; Strahinic y otros, 2010; Sadat‐Mekmene et al., 2011), produciendo
oligopéptidos; sistemas específicos de transporte de péptidos, que afectan la ingesta de
péptidos en las células; diversas peptidasas intracelulares; y diferentes enzimas que
convierten los aminoácidos en compuestos de sabor.
Los CEP se clasifican sobre la base de la señal para exportar al espacio extracelular,
dependiendo del mecanismo de anclaje. Por ejemplo, el gen CEP de Lactobacillus
buchneri carece de la señal de anclaje, por lo que la proteasa se libera en el espacio
extracelular (Sun et al., 2015).
En Lc. lactis, dos tipos de proteinasa (P I y P III) se anclan a la pared celular, siendo
liberadas por tratamiento con lisozima o agentes quelantes de Ca 2+: P I degrada solo β-
caseína, mientras que P III es activo principalmente en αs1-caseína. β-caseína se escinde
en un centenar de oligopéptidos diferentes que van de 4 a 30 residuos de aminoácidos,
y la κ-caseína es escindida en menor medida por la enzima de tipo P I, mientras que la
enzima de tipo PIII es capaz de escindir αS1‐, β‐ y κ‐caseínas igualmente bien (Pritchard
y Coolbear, 1993). Los PrtP se clasifican además en siete grupos (a, b, c, d, e, f y g) por
su especificidad hacia el α fragmento de caseína S1‐de las posiciones 1 a 23 (f1-23)
(Kunji et al., 1996). En Lb. casei la proteinasa extracelular es una serina proteasa,
sensible al fluoruro de fenil m etilsulfonilo. Se han descrito varias proteinasas en Lb.

delbrueckii subsp. bulgaricus. Una de ellas es una metaloenzima, inhibida por EDTA,
y una segunda es una cisteína proteasa. S. thermophilus se considera menos
proteolíticamente activo que los lactobacilos. La actividad caseinolítica se estudió en
Bifidobacterias, en Enterococcus faecalis y, utilizando extractos libres de células, en
Leuconostoc mesenteroides y en Pediococci lácteos.
Mientras que muchas cepas LAB contienen CEP, varias cepas, es decir, LAB no
inicial, no lo son. Por lo tanto, confían en el LAB inicial para la producción de péptidos
y aminoácidos; Los péptidos son absorbidos por las células a través de sistemas
específicos de transporte de péptidos.
6.3.2 Permeasas de oligopéptidos y otros transportadores de péptidos y

aminoácidos
Losoligopéptidos son transportados en el interior por la permeasa oligopeptídica (OPP).
Al analizar la cinética de OPP hacia diferentes péptidos (Detmers et al., 1998, 2001),
se encontró un segundo transportador ABC de oligopéptidos, el llamado sistema Opt,
presente en cepas de tipo salvaje como Lc. lactis SK11 y Wg2, mientras que las cepas
libres de plásmidos MG1363 e IL-1403 sintetizan cada una un solo sistema, Opp y Opt,
respectivamente (Charbonnel et al., 2003, Lamarque et al., 2004).
La absorción de péptidos se produce a través de sistemas de transmisión de
oligopéptidosy transportadores de di-/tri-péptidos. Además, se han identificado varios
sistemas de transporte de aminoácidos con una alta especificidad para aminoácidos
estructuralmente similares (Schweikhard y Ziegler, 2012; Trip et al., 2013).
En Lc. lactis, el sistema Opp Ll posee sólo una proteína de unión (OppA), mientras
que los sistemas de transporte de S. thermophilus y Lb. bulgaricus están compuestos
de tres y dos proteínas de unión a oligopéptidos (OBPs), respectivamente (Peltoniemi
et al., 2002).
OppA es capaz de unirse a péptidos con hasta 35 residuos de aminoácidos (aa), de
los cuales sólo los seis residuos N-terminales de los péptidos quedan atrapados en el
bolsillo de unión de OppA, mientras que el resto del péptido interactúa con la superficie
de la proteína de unión en un gestor no oportunista. Sin embargo, un estudio reciente
ha demostrado que la proteína de unión OppA no es el único determinante de la
especificidad del transporte de péptidos en Lc. lactis (Doeven et al., 2005).
Un segundo sistema de transporte de oligopéptidos llamado "sistema Opt" difiere del
conocido sistema Opp L en su organización genética y en el número de OBP
sintetizados.
Los transportadores Di‐ y tripéptidos transportan péptidos más pequeños en el
interior a través de mecanismos activos, el transportador ABC Dpp y el transporter
DtpT impulsado por la fuerza motriz del protón.
GlnPQ es un transportador ABC de glutamina, asparagina y ácido glutámico, con
energía proporcionada por hidrólisis de ATP. El sistema es esencial en varias bacterias
Gram-positivas, incluyendo Lc. lactis (Fulyani et al., 2015).
6.3.3 Peptidólisis yaminoácidos libres

Intracelularmente, las amino‐ y carboxipeptidasas, endopeptidasas, tripéptidos y
dipeptidasas producen aminoácidos libres que son sustratos para la producción de
compuestos de sabor (Smit et al., 2005b). Las enzimas proteolíticas bacterianas tienen
unaparticipación particularmente intensa durante las primeras semanas de producción
lechera, así como en la segunda mitad del período de maduración del queso (30-60 d).
Las peptidasas capaces de actuar sobre oligopéptidos se describen en la Tabla 6.2
(Kunji et al., 1996; Christensen yotros, 2003). Hasta la fecha, no se informó ninguna
enzima con actividad carboxipeptidasa para ninguna LAB. Sin embargo, se han descrito
productos de degradación originados a partir de la actividad de la carboxipeptidasa,
mientras que los péptidos fosforilados permanecieron débilmente hidrolizados, lo que
indica una alta resistenciatrínseca a la actividad peptidasa (Deutsch et al., 2000). β-
caseína es degradada en mayor medida por Lc. lactis (Kunji et al., 1996) y Lactobacillus
helveticus (Christensen et al., 1999), mientras que Lb. delbrueckii subsp. lactis y S.
thermophilus son menos proteolíticos, con este segundo incapaz de liberar prolina de
péptidos.
Se demostró una especificidad en αs1‐caseína f1-23 para PepO de Lb. rhamnosus
HN001, y en residuos post-prolina de β-caseína f203-209 se demostró para PepO2 de
Tabla 6.2 Peptidasas LAB.
Peptidasas Tipo de actividad enzimática
Aminopeptidasas
Metalopeptidasa, con una
PepA1, en L. lactis
cisteína sensible a la TDT Glutamil/aspartil aminopeptidasa específica,
posiblemente implicada en liberando residuos ácidos N-terminales de
el plegamiento péptidos de tres a nueve residuos
PepA2 en L. delbrueckii Metalopeptidasa No inhibido por el ditiothreitol (DTT), ni por su
producto glutamato
PepC Cisteína peptidasa
PepL Serina peptidasa
Metionina aminopeptidasa Metalopeptidasa, con preferencia Escinde N-terminal Met en péptidos con Gly, Ala,
MetAP por cationes divalentes Co, Mn Ser, Val, Pro o Thr penúltimo aminoácido. La
enzima es activa en tetrapéptidos (en L. lactis, S.
thermophilus)
PepN aminopeptidasa Metalopeptidasa
general
PepP aminopeptidasa Metalopeptidasa
general
Peps Metall peptidasa Muestra preferencia por péptidos que contienen de
dos a cinco residuos con Arg o residuos de
aminoácidos aromáticos en la posición N-
terminal, actividad desamargante en péptidos
amargos
PepX Serina peptidasa X-prolil dipeptidil peptidasa
Endopeptidasas PepD
Cisteína peptidasa Dipeptidasa
PepE (E1, E2) Metalopeptidasa
endopeptidasa
PepF (F1, F2) Metalopeptidasa Escinde oligopéptidos

en el intervalo de 7‐ a 17‐residuo‐ de longitud
PepG Cisteína peptidasa
PepIP Serina peptidasa Prolina iminopeptidasa, actúa sobre secuencias que

contienen prolina en la penúltima posición
PepO (O1, O2, O3) Metalopeptidasa La PepO2 en L. helveticus tiene especificidad para
los enlaces peptídicos C terminal a residuos Pro,
degradando α S1-caseína (f1-9) y β-caseína
(f193-209)
PepQ, prolidasa Metalopeptidasa Escisión de dipéptidos que transportan prolina en la
segunda posición
PepR Serinepeptidasa Prolinasa, actúa sobre los dipéptidos que contienen
prolina en la penúltima posición
PepT tripeptidasa Metalopeptidasa Prefiere péptidos que contengan aminoácidos
hidrófobos como leucina, metionina, fenilalanina
o glicina
PepV dipeptidasa Metalopeptidasa
Lb. helveticus CNRZ32 (Christensen et al., 2003). Además de escindir oligopéptidos

de 7‐ a 17‐residuo‐ largo, PepF también es importante para el recambio de proteínas en
condiciones de falta de nitrógeno en Lc. lactis (Monnet et al., 1994). Para identificar
los sustratos de Opp presentes en el hidrolizado de caseína, se puso a disposición de
los mutantes que carecen de proteinasa, pero que contienen Opp, y la desaparición de
péptidos del medio de cultivo, así como la acumulación intracelular de aminoácidos y
péptidos semonitorizó en peptidasa positiva y peptidasa negativa genética. Fondos. Los
resultados mostraron que (i) el extremo carboxilo-terminal de la β-caseína se degrada
preferentemente a pesar de la amplia especificidad de la proteinasa; ii)no se formen in
vivo péptidos sm más de cinco residuos; iii) se utilizan oligopéptidos de 5 a 10 residuos
después de la absorción por Opp; (iv) de los péptidos generados por PrtP, sólo se utiliza
un número limitado.
Savijoki et al. (2006) utilizaron herramientas proteómicas para caracterizar el
proceso de maduración del queso Emmental. Este enfoque proporcionó información
sobre las peptidasas liberadas en el queso por las bacterias iniciadoras Lb. helveticus y
S. thermophilus durante la maduración. Diferentes peptidasas se originaron a partir de
Lb. helveticus (PepN, PepO, PepE y PepQ) y S. thermophilus (PepN, PepX y PepS).
La diferente composición en las fracciones de nitrógeno liberadas, como péptidos
pequeños y aminoácidos libres, se relacionó con la actividad proteolítica de Lb.
helveticus y Lb. bulgaricus (PepA) (Stressler et al., 2010). Se encontró una actividad
peptidasa más fuerte de los lactobacilos en comparación con los estreptococos y una
aceleración de la maduración del queso pasteurizado de la oveja, con liberación de
enzimas proteolíticas Lb. helveticus y Lb. bulgaricus en la matriz (Candioti et al.,
2010). La alta actividad de transformación del nitrógeno soluble en pH 4,6 en nitrógeno
soluble en ácido tricloroacético (TCA) fue directamente proporcional a la actividad
proteolítica de la cepa Lb. casei RP5. En el queso salmuero caliente, el 80% de
lasproteasas bacteriales mantuvieron su actividad después de la salmuera caliente y
participaron activamente en la maduración del queso. Las concentraciones de
aminoácidos libres liberados por Lb. bulgaricus 2-11 fueron similares a las de
Lactobacillus casei RP5. Se encontró que esta cepa possesses aminopeptidasas capaces
de liberar ácido glutámico. Se han realizado estudios sobre el efecto de las cepas
entrantes y no iniciadoras en la maduración de varios tipos de queso, como Parmigiano
Reggiano (Qian y Reineccius, 2002), gorgonzola (Moio et al., 20 00), mozzarella (Moio
et al., 1993), y en modelos de queso de laboratorio (Randazzo et al., 2007; Ruggirello
et al., 2014).
Las enzimas LAB mesófilas y termófilas tienen una participación particularmente
intensa durante la proteólisis del queso, especialmente en la segunda mitad del período
de maduración del queso. En diferentes tipos de queso, la capacidad de LAB para
transformar nitrógeno soluble en compuestos de bajo peso molecular y nitrógeno
sugiere una alta actividad de peptidasa y aminopeptidasa de las cepas mesófilas y
termófilas (Simov e Ivanov, 2005; Madrau y otros, 2006; Candioti y otros, 2010; Tabet
et al., 2016).
En particular en la fabricación de queso, cepas mesófilas, como Lc. lactis ssp. lactis
(LMG S 19870), Lb. brevis (LMG 6906) y Lb. plantarum (LMG S 19557), fueron
capaces de hidratarpéptidos de ólisis en FAA (Pereira et al., 2010).
Las características distintivas del queso maduro se determinaron por las
concentraciones de aminoácidos libres individuales. El empleo de LAB con peptidasa
específica de prolina tiene una importancia crucial ya que las caseínas son ricas en este
residuo de aminoácido (Ozer y Akdemir-Evrendilek, 2015).
Los quesos suizos son ricos en prolina libre, que se asocia con el sabor dulce. En el
queso Emmental, S. thermophilus participa en la degradación peptídica, con la
producción de aminopeptidasa general PepN, PepX y aminopeptidasa PepS (Gagnaire
et al., 2004). Dado que S. thermophilus no puede liberarlo, la cantidad de prolina libre
depende directamente de la actividad de las ptidasas (PepIP y PepQ) de los lactobacilos
termófilos y de su disponibilidad en la matriz del queso después de la lisis bacteriana
(Deutsch et al., 2000).
6.3.4 Peptidólisis y represión catabolítica
El represor transcripcional CodY detecta el conjunto interno de aminoácidos de cadena
ramificada (isoleucina, leucina y valina) (Guédon et al., 2001); utilizando estos residuos
como cofactores, CodY reprime la expresión de Opp y de los genes del sistema
proteolítico en Lc. lactis. En varias especies de LAB se describió un regulador de la
transcripción sensible a aminoácidos de cadena ramificada (BCAA), BCARR, que
reprime la expresión de los genes en el sistema proteolítico, en varias especies de LAB
(Klaenhammer et al., 2007) y en Lb. helveticus (Wakai y Yamamoto, 2013). La
disponibilidad de BCAA aumenta la inhibición de la expresión de los genes del sistema
proteolítico. En S. thermophilus, CodYSt reprimió la transformación de la vía
metabólica central al metabolismo de aminoácidos y mejoró la utilización de la lactosa
(Lu et al., 2015).
Aunque los péptidos y aminoácidos tienencaracterísticas de sabor específicas, como
dulce, amargo o malta, se cree que el sabor básico del queso ya está definido. La
estimulación o sobreexpresión de varias enzimas proteolíticas y también la adición de
aminoácidos al queso no influyeron en lapercepción positiva del sabor del queso. Sin
embargo, la proteólisis desequilibrada puede conducir a un exceso de péptidos amargos
(Lemieux y Simard, 1992), lo que puede conducir a una disminución de la percepción
del sabor del queso. Se han seleccionado cultivos específicos con capacidad para
degradarpéptidos de sabor amargo. Estos cultivos se utilizan en el procesamiento de
queso y cuajada. Los aminoácidos libres son entonces sustratos para sucesivas
reacciones formadoras de sabor. Por lo tanto, la proteólisis y la peptidólisis contribuyen
a la formación de sabores, pero no controlan la velocidaden la formación de sabores.
Sin embargo, el proceso de maduración puede acelerarse mediante la adición de
enzimas exógenas, el uso de cepas complementarias o iniciadores con altas actividades
proteolíticas, iniciadores atenuados (choque por calor o congelación) o inactivados, y
lodos de queso, o mediante la adición de aminoácidos libres (Fox et al., 1996).
6.3.5 Biosíntesis de aminoácidos y auxotrofia

Un conjunto de aminoácidos (arginina, cisteína, ácido glutámico, lisina) son esenciales
en ciertas cepas de BAL que son auxotróficas para ellos, y necesitan liberaraminoácidos
fr ee de péptidos. La mayoría de los lactobacilos necesitan algún aminoácido libre
(arginina, cisteína) para permanecer vivos durante condiciones difíciles, como el
almacenamiento a baja temperatura o el estrés ácido y de oxígeno. El sistema de
captación de cisteína se demostró esencial en la alimentación de oxígeno en Lb.
fermentum (Turner et al., 1999). La l-cisteína podría mejorar el crecimiento anaeróbico
de los lactobacilos, proporcionar nitrógeno amino como factor que favorece el
crecimiento y comportarse como un factor de estrés antioxidante (Sutula et al., 2012).
Los lactococos utilizados enlas fermentaciones tienen un requerimiento nutricional
complejo y requieren al menos glutamato, valina, metionina, histidina, serina, leucina
e isoleucina para su crecimiento, y el número de aminoácidos esenciales depende de la
cepa. Lc. lactis industrial subsp. Las cepas de CremoRis requieren diferentes
aminoácidos para su crecimiento. Lc. lactis silvestre subsp. Las cepas de cremoris
generalmente requieren de dos a tres aminoácidos, mientras que algunas Lc. lactis
subsp. Las cepas de lactis solo necesitan uno o dos aminoácidos.
Se sabe que varias cepas de LAB difierenen las capacidades de conversión de
aminoácidos y que estas actividades están relacionadas con la capacidad de sintetizar
aminoácidos (Dudley y Steele, 2001; Smit y otros, 2005a). Las cepas con mayor
actividad son las cepas de Lc. lactis aisladas de fuentes naturales yambientes no lácteos,
los llamados 'lactococos silvestres' (Ayad et al., 2000). Por ejemplo, muchas cepas no
degradan las caseínas, producen compuestos antimicrobianos y/o tienen una baja
actividad acidificante. Sin embargo, cuando se determinó la dependencia de estas cepas
para los aminoácidos en el medio de crecimiento utilizando la técnica de omisión ún ica,
se encontró que estas cepas tenían un potencial mucho mayor para sintetizar sus propios
aminoácidos en comparación con las cepas industriales. La ausencia de algunos
aminoácidos biosintéticos en los lactococos lácteos podría ser una consecuencia de su
adaptación a los productos lácteos, ya que en la leche, los aminoácidos están fácilmente
disponibles a partir de la degradación proteolítica de las caseínas. Las cepas silvestres
no se asocian naturalmente con un ambiente rico en such como la leche, lo que las hace
más dependientes de su propia biosíntesis de aminoácidos en comparación con las cepas
industriales.
La proteólisis de caseína y los péptidos derivados, las fracciones de urea y nitrógeno
no proteico (NPN) liberadas por el tratamiento térmico de la leche pueden inducir la
expresión de genes como las vías biosintéticas para la cisteína y la metionina en
Bifidobacterium bifidum (Ferrario et al., 2015). El análisis transcripcional con B.
bifidum PRL2010 cultivado en proteínas de suero o hidrolizado de caseína reveló que
las vías biosintéticas para la cisteína y la metionina están moduladas por la presencia
de hidrolizado de caseína (Ferrario et al., 2015).
La auxotrofia o prototrofia de aminoácidos en Bifidobacterias y lactobacilos
depende de especies (Deguchi y Morishita, 1 992) y está vinculada a la presencia en el
genoma de genes que codifican transaminasas y vías metabólicas de aminoácidos
(Ferrario et al., 2015). Una aminotransferasa de cadena ramificada (ilvE) de Lc. lactis
LM0230 (Atiles et al., 2000; Ganesan y Weimer, 2004) sepropuso sintetizar Ile y Val a
partir de cetoácidos precursores (Santiago et al., 2012).
La metilación de la homocisteína, el paso final de la biosíntesis de metionina, puede
ser catalizada por dos enzimas no homólogas, es decir, una homocisteína
metiltransferasa dependiente de cobalamina (MetH) o una metionina sintasa
independiente de cobalamina (MetE).
La biosíntesis de metionina a partir de homoserina puede ser iniciada por homoserina
quinasa (HSK), homoserina trans-succinylasa (HSST) y homoserina O-
acetiltransferasa (HSAT). En los enomas LAB g secuenciados, HSK y HSST están bien
distribuidos.
HSST y HSAT comparten poca similitud de secuencia, pero tienen una especificidad
de sustrato similar (Liu et al., 2008). El gen ortólogo en Lb. plantarum se localiza en el
mismo operón que los genes que codifican O-acetilhomoseri ne sulfhidrilasa (AHSH)
y homoserina deshidrogenasa (HSDH), con correlación funcional entre HSDH, HSST
y AHSH. Debido a que Lb. plantarum es una especie que carece de un ciclo de ácido
tricarboxílico para producir succinilCoA, necesita usar acetil-CoA para sintetizar
metionueve (Liu et al., 2008).
6.4 LIPÓLISIS, LIPASAS, ESTERASAS

Además de la enzima cuajo, las lipasas del estómago de cordero o cerdo se utilizan en
la transformación de la leche de oveja, contribuyendo a la liberación de sabores en los
quesos de oveja y cabra. Las lipasas y lasesterasas influyen en este tipo de productos
queseros.
Las lipasas y esterasas de las BAL son intracelulares, por lo tanto, las enzimas
pueden liberarse en la matriz del queso después de la lisis celular. Los iniciadores
adjuntos y los LAB no iniciadores (NSLAB) se consideran responsables de la
producciónde ácidos grasos libres (AGF) y AGF de cadena corta (Dherbécourt et al,
2010; Wolf et al., 2016), que tienen propiedades volátiles y proporcionan

aromatizantes.
La lipólisis da lugar a la formación de AGL, que pueden ser precursores de
compuestos de sabor comometilcetonas, alcoholes secundarios, ésteres y lactonas. Las
BAL contribuyen relativamente poco a la lipólisis, pero los cultivos adicionales, como
en el caso de los quesos madurados en superficie, a menudo tienen altas actividades en
la conversión de grasa. Los sabores derivados de la conversión de grasa son
particularmente importantes en quesos blandos como Camembert y Roquefort.
El moho azul Penicillium roqueforti y otras lipasas fúngicas liberan FFA y las
convierten en alk-2‐ones en el queso azul (McSweeney, 2004). Se han descrito diversos
aromas en la aplicación de especies fúngicas en productos lácteos: Penicillium
casicolum Beiner, Penicillium candidum, Penicillium camemberti, Penicillium album,
Penicillium nalgiovense, Penicillium glaucum, Penicillium cyclopium (Saint Nectaire),
Geotrichum ca ndidum. Su actividad favorece el crecimiento de levaduras, como
Torulopsis, Candida, Kluyveromyces y Debariomyces spp. Una interacción compleja
con microorganismos de superficie, como Micrococci, implica el uso de lactato como
sustrato, el crecimiento a temperatura de bodega y el requisito de concentración de sal
por debajo del 1%. Después de la lipólisis, los AGL se convierten en β-cetoácidos y
dimetilcetonas.
En estudios sobre aceleración de la maduración (Wallace y Fox, 1997), se probaron
lipasas Mucor miehei, P. roqueforti y P. candidum lipasas con buenos resultados (Fox
et al., 1996). El producto FlavorAge contiene una lipasa única de una cepa de
Aspergillus oryzae con alta especificidad para los ácidos grasos C6-C8, y aplicada al
queso, produjo perfiles FFA similares a los encontrados en los quesos de control. El
queso feta producido a partir de leche de vaca utilizando una mezcla de Lb. casei y Lc.
lactis como entrantes, y una mezcla deesterasa pregástrica (PGE) de cabrito y l amb
(PGE), desarrolló un cuerpo, sabor y textura similares al auténtico queso feta.
Los ésteres, como el etilbutirato, contribuyen al sabor del queso cheddar y del gouda,
aunque un exceso de ésteres en proporción a otros compuestos de sabor podría ser
responsable de los defectos afrutados. En Camembert, el fenilacetaldehído, el 2-
feniletanol y el éster acetato de feniletilo, que resultan de la degradación de la
fenilalanina, se identifican en fracciones con olor floral a rosa, produciendo la nota
floral.
Los ésteres se forman en una reacción entre un alcohol y un ácido orgánico, que
también podría activarse mediante el acoplamiento al CoA. Además del metabolismo
de los aminoácidos, también el metabolismo del azúcar y la grasa proporcionan
sustratos para la formación de ésteres. Aunque la formación de ésteres generalmente
seconsidera una reacción catalizada enzimática, la reacción entre el acetilCoA y el
metanotiol es espontánea. Las esterasas son serina hidrolasas capaces de sintetizar o
hidrolizar ésteres, dependiendo de las condiciones ambientales, mientras que las acetiltr
ansferasas de alcoholsolo catalizan la síntesis de ésteres. Al eliminar el gen de la
esterasa Lc. lactis (estA), se demostró que era responsable de la actividad de hidrólisis
del éster y de la formación de ésteres de ácidos grasos de cadena corta in vitro.
Liu et al. (2008) describieron unareacción alternativa para la formación de ésteres

por laboratorio lácteo. El proceso se denominó lisis de alcohol, en la que una acil-
transferasa reacciona con grupos acilo grasos y grupos acilo de derivados de acil-CoA
que se transfieren directamente a los alcoholes.
6.5 AROMA Y FLAVOUR PRODUCTOS DEL METABOLISMO

Un tema intrigante de LAB es que son una fábrica de sabores, y este aspecto tiene una
importancia dramática en el procesamiento de alimentos y la evaluación de la calidad.
El sabor caracteriza a un queso, define su especificidad sensorial y, en algunos casos,
un defecto. De hecho, el paso final del catabolismo de los tres componentes principales
de la leche (carbohidratos, proteínas y lípidos) es la formación de muchas moléculas de
baja masa molecular (44-200 Da), la mayoría de las cuales son olores activos e impactan
fuertemente en el fla vour, junto con las moléculas derivadas directamente por la
alimentación y / o el medio ambiente (es decir, terpenos). Cuando la maduración de un
queso en particular sigue su desarrollo "normal", los compuestos de sabor expresan su
tipicidad, mientras que una producción anormal de algunos compuestos debidoal
crecimiento de una microbiota indeseable, causa defectos de sabor desagradable y
posiblemente de textura (soplado).
El sabor lácteo implica olor y sabor en una proporción de aproximadamente 75:25.
Esto significa que el sabor, aunque en menor medida, también tiene un papel
importanteen el sabor. En cuanto al sabor, los compuestos involucrados son
principalmente aminoácidos, ácidos orgánicos, aminas biógenas, péptidos con bajo
peso molecular y sales minerales que son solubles en agua. Los aminoácidos, junto con
pequeños péptidos (300-400 Da) son típicamente responsables de un sabor amargo. Los
compuestos aromáticos que involucran receptores nasales son principalmente
lipofílicos y se derivan no solo de la descomposición lipídica sino también del
catabolismo de aminoácidos y carbohidratos. Estas moléculas se caracterizan por
diferentes kinds de aromas que en diversas combinaciones forman un bouquet que
puede ser simple, como en la leche fermentada, el yogur y el queso quark con un período
de maduración muy corto (pocos días), o muy complejo, como en el queso madurado
con moho y el queso madurado durante mucho tiempo, como Parmigiano Reggiano (>2
años). Además, el impacto olfativo de un compuesto volátil está relacionado con la
actividad del olor y el efecto de la matriz más que con su concentración.
Para los quesos madurados poco tiempo, los compuestos de sabor más importantes
derivan del metabolismo de los carbohidratos (lactosa y citrato) por laboratorio
mesófilo que proporciona acetato, diacetilo, acetaldehído, acetoína, etanol, 2,3-
butanodiol, que son fuertemente activos en olor. Por ejemplo, el diacetilo y la acetoína
se derivan del cometabolismo del citrato y el carbohidratoen Ln. mesenteroides
(Schmitt et al., 1997).
Para los quesos de un período de maduración más largo, también se produce la
descomposición de lípidos y proteínas, lo que resulta en la producción de numerosos
compuestos, que a su vez pueden reaccionar produciendo otros volátiles dando al queso
un sabor más compacto. La lipólisis es responsable de la producción de ácidos grasos

de cadena corta que son fuertemente activos en olor y dan un sabor picante. Los ácidos
grasos saturados pueden oxidarse a β-cetoácidos, luego descarboxilados a metilcetonas
con un carbono menos, que puede reducirse a alcoholes secundarios. Tanto las cetonas
de metilo como los alcoholes secundarios poseen un umbral de olor muy bajo y son
típicos de los quesos madurados con moho.
Los AGF pueden reaccionar con los alcoholes, dando ésteres, caracterizados por un
olor suave y floral. Losácidos grasos droxilados libres pueden sufrir transesterificación
intramolecular entre los grupos ácido e hidroxilo, formando lactonas.
La proteólisis y particularmente el catabolismo de aminoácidos es un tema más
complejo durante la maduración y es responsable de muchos compuestos importantes
delavado. Los BCAA (leucina, isoleucina y valina) pueden sufrir desaminación
produciendo ácidos grasos iso, aldehídos y alcoholes secundarios que pueden ser
esterificados por ácidos grasos. Los aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina,
triptófano e histidina) pueden transaminarse y reducirse a aldehídos (bencilaldehído,
fenilacetaldehído), ácidos (ácido benzoico, ácido fenilacético) y alcoholes (feniletanol)
que pueden esterificarse con ácidos (acetato de fenilo etilo, benzoato de etilo). La
degradación de los aminoácidos aromáticostambién es responsable de los sabores
fecales, quemados y de naftalina (indol, escatol). El aminoácido azufre metionina puede
dar metanotiol que puede oxidarse a sulfuro de dimetilo (DMS), disulfuro de dimetilo
(DMDS) y trisulfuro de dimetilo (DMTS) (Fernandez et al., 2002). Estos compuestos
de azufre son activos de olor fuerte y son típicos de los quesos de corteza en flor como
Brie y Camembert. Otro aminoácido de azufre, la cisteína, da sulfuro de hidrógeno, que
se encuentra en el cheddar. Los aromas procedentes de aminoácidos se describenen los
cuadros 6.3, 6.4 y 6.5. En la Tabla 6.4 se informan los compuestos volátiles, solubles
en aceite o en agua, junto con sus umbrales de percepción.
Tabla 6.3 Principales compuestos volátiles activos en olores en productos lácteos.

Volátil Principales
Compuestos precursores
Descripción de olores Producto lácteo
Ácidos
Acéticos Carbohidratos Vinagre, pimientos, verde, agrio Cheddar, Parmesano,
Camembert
Propanoico Carbohidratos Acre, rancio Suizo
2-metilpropanoico Proteínas Rancio
Butanoico Carbohidratos / Sudor, calcetín fecal, rancio, Cheddar, Parmesano, Azul

lípidos
sucio
3-metilbutanoico Proteínas Queso, sudor, fruta rancia, Gouda
podrida
Hexanoico Lípidos Sudor, cabra, mal aliento Cheddar, Gouda, Parmesano
Octanoico Lípidos Queso, rancio, sudor Gouda, Parmesano
Decanoico Lípidos Rancio, mantequilla, herbáceo, Cheddar, Gouda
graso, queso,
Fenilacético Proteínas Miel, flor
Alcoholes Etanol
Carbohidratos Seco, polvo, alcohol Suizo
2-Propanol Carbohidratos Afrutado, etéreo, vinícola Suizo
1‐Butanol Carbohidratos Plátano, vino, fueloil Parmesano
2‐Butanol Proteínas Dulce, afrutado, fueloil, similar al Suizo
vino
2‐Methy‐1‐lbutanol Proteínas Malteado, vino, cebolla Suizo
3-metil-1-butanol Proteínas Queso fresco, alcohólico, afrutado, Mozzarella, Gouda
similar a un disolvente
2‐Pentanol Proteínas Verde, alcohólico, afrutado, fresco Parmesano
2-Heptanol Proteínas Alfombra afrutada, terrosa, verde, Camembert
dulce, seca y polvorienta
1‐Octen‐3‐ol Proteínas Parecido a un hongo, mohoso, Camembert
terroso
2‐Nonanol Proteínas Verde graso Camembert
Feniletanol Proteínas Inmundo, rosa, violeta, miel, floral Mozzarella, Camembert, azul
Esteres
Acetato de etilo Carbohidratos Disolvente, afrutado, piña Parmesano, Suiza
Butirato de etilo Lípidos Afrutado, verde, manzana, plátano Cheddar, Gouda, Parmesano,
Suiza
Caproato de etilo Lípidos Piña, dulce, afrutado, plátano Cheddar, parmesano, azul
Octanoato de etilo Lípidos Pera, albaricoque, dulce, afrutado, Parmesano
plátano, piña
Acetato de fenilo de Proteínas Floral, rosa, lirio-jazmín, miel Camembert
etilo
Acetato de 3-metil-1- Proteínas
butanol
(continuación)
Cuadro 6.3 (continuación)

Volátil Principales
Compuestos precursores
Descriptor de olor Producto lácteo
Compuestos
carbonílicos
Acetona Dulce, afrutado, etéreo, pulpa de
Carbohidratos madera, heno Suizo
Acetaldehído Carbohidratos Etéreo, fresco, verde, picante Yogur
Acetoína Carbohidratos Leche agria y mantecosa Mantequilla, Cheddar, Gouda

Diacetyl Carbohidratos Fuerte mantecoso, caramelo, Mantequilla
caramelo
2-Butanona Lípidos Dulce, etéreo, ligeramente Suizo
nauseabundo
2‐Pentanona Lípidos Cáscara de naranja, dulce, afrutada Gouda, Parmesano,
Camembert, Suiza
2-Heptanona Lípidos Queso azul, picante, Roquefort, Cheddar, Camembert Suizo
afrutado
1‐Acetato‐3‐ona Lípidos Parecido a un hongo Cheddar, Camembert
2-Nonanona Lípidos Malteado, fruta podrida, leche Gouda, parmesano,
caliente, verde, terroso camembert, suizo, azul
2‐Undecanone Lípidos Floral, afrutado, verde, mohoso, Gouda, Camembert, azul
sebo
Fenilacetaldehído Proteínas Miel, rosado, violeta, estireno Cheddar
3-metilbutanal Proteínas Malteado, potente, queso, verde, Cheddar, Gouda, Parmesano,

chocolate negro Camembert, Suizo, azul
Otros
Sulfuro de hidrógeno Proteínas Huevo podrido Cheddar
Metional Proteínas Patata al horno Cheddar, Parmesano,
Camembert
Metanotiol Proteínas Repollo podrido, queso, vegetativo, Camembert
azufre
Sulfuro de di-metilo Proteínas Azufre, repollo, granada Camembert
Di-metil-disulfuro Proteínas Verde, agrio, cebolla Camembert

Di-metil-trisulfuro Proteínas Sulfuroso, ajo, pútrido, parecido a Cheddar, Gouda, Parmesano,
la col Camembert
Tetra-metil pirazina Proteínas Al horno, frijoles, papa cruda Parmesano
d-Decalactona Lípidos Coco, melocotón, cremoso, grasa Cheddar, Gouda, Camembert

láctea
d-Dodecalactona Lípidos Queso, coco, dulce, jabonoso, Gouda
mantecoso, melocotón,
c-Dodecalactona Lípidos Melocotón, almendras, hierbas, Gouda
lilas, frutas, caramelo
6.5.1 Aldehídos, alcoholes y ácidos carboxílicos

La alcohol deshidrogenasa (AlcDH) y la aldehído deshidrogenasa (AldDH) catalizan la
conversión de aldehídos en alcoholes y ácidos carboxílicos. α-cetoácidos intermedios
se pueden convertir en ácidos aldehídos carboxílicos y ésteres de CoA a través de la
descarboxilación oxidativa, o pueden reducirse a hidroxiácidos por hidroxiácido
deshidrogenasas (HADH). En las BAL se producen deshidrogenasas que desempeñan
114 Microbiología en Procesamiento de productos lácteos
un
papel importante en el mantenimiento del equilibrio redox intracelular, y son necesarias
para restaurar el NAD del NADH enexceso. Los hidroxiácidos
Tabla 6.4 Descripciones de algunos componentes importantes del sabor y sus umbrales.
Umbral de olor en ppb (μM)

Compuesto de sabor Descripción En el agua En aceite
2-metilpropanal Plátano, malta, chocolate 0.1–2.3
3-metilbutanal Malta 13 (0.15)
3-metilbutanal Queso fresco, impresionante, alcohólico 250 (2.8) —
Ácido 3-metilbutírico Sudoroso, queso 120–700 (1.2–6.9) —

Ácido butírico Mantequilla, queso, fuerte, ácido 240 (2.7) —
Ácido propiónico Leche picante, agria, queso 2× 104 (270) —
Etilbutirato Afrutado, mantecoso, fruta madura 1 (0.008) —
Diacetyl Mantecoso, fuerte 2.3 (0.026) —
Acetaldehído Yogur, verde, nuez, picante 15 (0.34) —
Metional Patata cocida, carne como, azufre 0.05–10 —
1× 10−4
Metanotiol Repollo "podrido", queso, azufre 0.02–2 —
(3 × 10−4)
Benzaldehído cerezo silvestre 350 (3.3) —
Acetato de fenilo Jazmín áspero con nota metálica 25 (0.5) —
Datos según la Tabla 2 en: Smit, G., Smit B.A., Engels, W.J.M., 2005. Formación de aromas por bacterias lácticas y perfiles
bioquímicos de aromas de productos queseros. FEMS Microbiol. Apocalipsis 29, 591–610. Derechos de autor por Oxford
University Press. Licencia 4101330821266, factura RLNK502301863, servicio RightsLink ® del Centro de
Autorización de Derechos de Autor .
Tabla 6.5 Compuestos aromatizantes a partir de aminoácidos por transaminación y formación de α-cetoácido.
Aminoácido Alcohol o tiol
cetoácido
Aldehído Ácido orgánico Esteres
Con α-ceto-3- 2-metilbutanal Ácido 2- 2-metilbutanol
metilpentanoico metilbutírico
ácido
Leu α-Ácido 3-metilbutanal Ácido 3- 3-metilbutanol Etil-
cetoisocaproico metilbutírico 3metilbutanoato
Leu 2-metilpropanal Ácido 2- 2-metilpropanol
metilpropanoico
Val α-Ácido 2-metilpropanal Ácido 2- 2-metilpropanol Isobutanoato de

cetoisovalérico metilpropanoico etilo
Phe Piruvato de fenilo Benzaldehído Ácido benzoico Fenilmetanol Benzoato de etilo

Phe Fenilacetaldehído Ácido Feniletanol Acetato de
fenilacético feniletilo
Trp Indol-3-piruvato Indol-3acetaldehído Ácido indol-3-
acético
Con α-Keto metiltio Metional Ácido metiltiobutírico metionol Propionato de
butirato etilo-3-metiltio
Con Metiltioacetaldehído Metanotiol Metiltioacetato
derivados de BCAA, ArAA y metionina, observados en muchas fermentaciones lácteas,

pueden conducir a bajas concentraciones de α cetoácidos, afectando negativamente el
flujo hacia compuestos de sabor como los aldehídos. Las 2-hidroxiácido
deshidrogenasas mejor estudiadas son la lactato deshidrogenasa (LDH) y la
hidroxiisocaproato deshidrogenasa (HicDH), caracterizadas en varias BAL (Broadbent
et al., 2004). Varias enzimas se denominan hidroxiisocaproato deshidrogenasa
(HicDH), debido a lapreferencia por el α-cetoisocaproato. Las enzimas tienen una
amplia especificidad de sustrato y catalizan la hidrogenación estereoespecífica de α-
cetoácidos, utilizando NADH como donante de hidrógeno.
6.5.2 Aminoácidos como compuestos aromatizantes precursores

Varias enzimas están involucradas enla conversión de aminoácidos en compuestos de
sabor. El análisis de la secuencia del genoma de las especies de LAB proporcionó
información sobre las vías metabólicas que involucran aminoácidos (Engels et al.,
2000; van Kranenburg et al., 2002; Do Carmo et al., 2011, 2012). La enzimacataliza
reacciones de transaminación, desaminación, descarboxilación y escisión de las
cadenas laterales de aminoácidos.
Las enzimas aminotransferasas (AT); La transferasa de aminoácidos de cadena
ramificada (BCAT), la AT aromática (ArAT), el aspartato AT (AspAT), el glutamato
deshidrogenadose (GDH), la hidroxiácido deshidrogenasa (HADH), el alcohol DH, el
aldehído DH, la cadena ramificada α-cetoácido descarboxilasa KdcA, la lisina/ornitina
descarboxilasa y la esterasa A (EstA) están involucradas en la formación del sabor
(Nardi et al., 2002). Varias enzimas pertenecen a grandes familias de proteínas. Por
ejemplo, las aminotransferasas ArAT, AspAT, y las cistationina liasas CBL/CGL
pertenecen a la misma familia I de aminotransferasas (Liu et al., 2008). Algunas de las
enzimas exhibieron especificidades de sustrato superpuestas, por ejemplo, ArAT,
AspAT y BCAT (Yvon et al., 2000). α-cetoglutarato es generalmente el aceptor de
grupos amino preferido (co-sustrato) para
reacciones de transaminación (Yvon et al., 1998; Banks y otros, 2001). Se ha
demostrado que la absorción de α-cetoglutarato por los transportadores de citrato es
importante para mantener la necesidad intracelular (Pudlik y Lolkema, 2012, 2013). En
LAB, la reacción de transaminasas relacionada con la desaminación de glutamato a α-
cetoglutarato es catalizada por la glutamato deshidrogenasa (GDH). La falta de
actividad GDH es común en las cepas utilizadaspara la fabricación de queso (Tanous et
al., 2002). La actividad de la glutamato deshidrogenasa es un criterio para la selección
de cepas LAB productoras de sabor (Tanous et al., 2002). α-cetoglutarato sirve como
aceptor de aminoácidos en la reacción de transaminación de leucina, fenilalanina de pH
y otros aminoácidos, y la adición de α-cetoglutarato aumenta fuertemente la conversión
de aminoácidos de Lactobacillus sakei y Lb. plantarum (Larrouture et al., 2000). La
actividad de LAB GDH se ejerce de una manera específica de la cepa. La
enzimacataliza el reciclaje dependiente de NAD(P)H de glutamato a α-cetoglutarato.
Los BCAA pueden transaminarse a cetoácidos, que sufren degradación espontánea
o se convierten enzimáticamente en aldehídos o ácidos carboxílicos correspondientes
(Smit et al., 2004b).
El metanotiol y otros compuestos aromáticos sulfúricos clave como el sulfuro de
dimetilo (DMS), el disulfuro de dimetilo (DMDS) y el trisulfuro de dimetilo (DMTS)
tienen un impacto significativo en los perfiles sensoriales del queso (Weimer et al.,
1999). Los compuestos clave de sabor que contienen azufre son el 4-metiltio-2-
oxobutanoato (KMBA) y el ácido 2-hidroxi-4-metilsulfanilbutírico (HMBA).
Los genes cbs de LAB codifican para la cistationina β-sintasa. Se predijo que otras
enzimas catalizarían diferentes tipos de reacciones; por ejemplo, las proteínas de la
subfamilia CBL / CGL pueden llevar a cabo reacciones de eliminación α,β (cistationina
β-liasa, CBL) y α,γ eliminación (cistationina γ-liasa, CGL) (Liu et al., 2008). En el
último paso en el metabolismo de la metionina y la cisteína, el CBL convierte la
cistationina en homocisteína(Weimer et al., 1999).
Las proteínas de la cistationina γ-sintasa (CGS) y O-acetil homoserina sulfhidrilasa
(AHSH) subfamiles pueden mostrar actividad CGS y AHSH (Liu et al. 2008).
Entre las enzimas implicadas en la síntesis de sabores,se identificaron cisteína serina
acetiltransferasas (CysE, CysK). La degradación de la metionina implica la vía de
transaminación iniciada por las aminotransferasas y la vía de eliminación iniciada por
las liasas C-S.
La treonina aldolasa, perteneciente a otra clase de liasa, es capaz de convertir la
treonina directamente en acetaldehído.
La descarboxilación oxidativa del complejo α-cetoácido deshidrogenasa (DH) en
Lactococcus spp. y en especies relacionadas es relevante para la formación de sabores
en el queso. La descarboxilación oxidativa de α-cetoácidosda como resultado la
formación de ácidos orgánicos. Los ácidos carboxílicos, como el ácido isovalérico, son
compuestos de sabor importantes. Además, los ácidos carboxílicos son precursores de
otros compuestos aromáticos, como ésteres, tioésteres, cresol y escatolé. El cresol y el
skatole pueden formarse química y enzimáticamente a partir de tirosina y triptófano.
En particular, la enzima α-cetoácido descarboxilasa en la vía que conduce a la 3-
metilbutanal fue profundamente estudiada (Smit et al., 2004b, 2004c).
6.6 PRODUCCIÓN NO ENZIMÁTICA DE AROMAS

Se ha descubierto que las conversiones no enzimáticas para producir compuestos
activos en sabor tienen un papel importante en el queso. Se han descrito algunos pasos
de conversión química no enzimática, como la formación de benzaldehído a partir del
ácido fenilpirúvico. Los aldehídos formados pueden ser deshidrogenados o
hidrogenados a sus correspondientes alcoholes o ácidos orgánicos, que a su vez son
sustratos para esterasas y aciltransferasas, dando lugar a (tio)ésteres. Una de las
funciones biológicas de estas vías de degradación de aminoácidos es la generación de
precursores, que son necesarios, por ejemplo, en la síntesis de esteroles y ácidos grasos
de cadena ramificada. Por otro lado, la hidrogenación de los α-cetoácidos puede actuar
como un sumidero para el potencial redox excesivo (NADH). La conversión de
aminoácidos a α-cetoácidos y a alcoholes para producir alcoholes de cadena ramificada
corta, se descubrió en la levadura y se denominó "vía de Ehrlich".
Las reacciones de conversión química son una categoría de reacciones formadoras
de sabor. Una variedad de reacciones químicasse producen en las condiciones suaves
del proceso de maduración del queso y, por lo tanto, contribuyen a la formación del
sabor. Las BAL pueden influir en las reacciones químicas al influir en las
características ambientales como el pH, el cofactor y la disponibilidad de oxígeno.
Los α-cetoácidos de la phenilalanina (ácido fenilpirúvico) y la metionina pueden
convertirse de forma no enzimática en compuestos de sabor como el benzaldehído y el
metiltioacetaldehído. Se demostró la existencia de la conversión química del ácido
fenilpirúvico (Nierop Groot et al., 1998; Smit et al., 2004c), así como la conversión de
indol-3‐piruvato y ácido α-cetoisocaproico y la conversión a metiltioacetaldehído.
Todas estas conversiones parecen proceder a través de un mecanismo de reacción
similar. También se produce la degradación espontánea del hidroxifenifenolpiruvato a
hidroxibenzaldehído, y tanto el benzaldehído como el hidroxibenzaldehído se
encontraron en cantidades significativas en quesos semiduros. La reacción es catalizada
por iones metálicos divalentes. Los productos de conversión de indol-3-piruvato (ácido
indolacetic, indol-3-acetaldehído y escatol) se han identificado como sabores
desagradables en algún tipo de queso.
Esta conversión química de α-cetoácidos, especialmente el α-cetoácido de la leucina,
se estudió en detalle (Smit et al, 2004c). Por lo tanto, el 2-metilpropanal puede
seralimentado por dos mecanismos: una conversión enzimática originada por valina y
una conversión química no enzimática con leucina como sustrato. La reacción está
fuertemente influenciada por la disponibilidad de sustratos (α-cetoácido y oxígeno),
manganeso y por el pH. En presencia de 10 mM MnCl 2, se produjo la conversión
química. El pH en la maduración del queso parece ser óptimo. El oxígeno se consume
rápidamente en el proceso de fermentación en quesos semiduros, quedando a partir de
entonces casi ausente. Por otro lado, en el as del surf del queso frotis y el queso
madurado por hongos, la situación favorece tales conversiones.
Una reacción química importante de los aminoácidos que conduce a compuestos de
sabor es la degradación de Strecker (Dunn y Lindsay, 1985; Urbach, 1993). La
degradación de Strecker se describe como la reacción del grupo amino de un
aminoácido con un α-dicarbonilo como un azúcar reductor, y es un paso importante en
la reacción de Maillard. Sin embargo, a altas temperaturas, la descarboxilación
oxidativa directa de aminoácidos también puede conducir a los mismos aldehídos. Estas
reacciones son especialmente intensas a altas temperaturas, y contribuyen al sabor de
los productos horneados. Sin embargo, incluso a temperaturas más bajas, las reacciones
continúan, como en el caso de la producción de queso y cerveza. La gradación de
Strecker de leucina puede resultar en 3-metilbutanal, pero también la conversión de
valina da como resultado este aldehído.
6.7 MÉTODOS DE ANÁLISIS DE AROMAS EN LÁCTEOS

PRODUCTOS: HPLC, CROMATOGRAFÍA DE GASES/
ANÁLISIS DE MASAS (GC/MS)
Las técnicas de detección de cepas productoras de sabor se logran mediante ensayos de
alto rendimiento y perfiles sensoriales (Smit et al., 2004a; Licitra y Carpino, 2014),
genotipado, por análisis enzimático, o por análisis físico-químico como lacromatografía
líquida (HPLC) o la cromatografía líquida de ultra rendimiento nanoflow electrospray
ionization tandem mass spectrometry (UPLC‐nano‐ESI‐MS), por GC/MS ( Bosset et
al., 1993; Rychlik y Bosset, 2001) o plataformas metabolómicas y nariz electrónica
(Marilley y Casey, 2004 ).
Los compuestos de sabor más potentes son los aldehídos, alcoholes, ácidos
carboxílicos y ésteres. Especialmente importantes son los aldehídos, alcoholes, ácidos
carboxílicos y ésteres derivados de los aminoácidos metionina, fenilalanina, treonina
yBCAA. La importancia de estos aminoácidos para el sabor del queso es una
combinación de su abundancia, sus tasas de conversión y el umbral de olor de los
compuestos derivados de ellos.
6.8 BIODIVERSIDAD NATURAL DE CEPAS EN PRODUCCIONES
LÁCTEAS
Laseguridad del cultivo iniciador durante la fermentación del queso se ve reforzada por
la presencia de un rico consorcio de microbios. Los iniciadores naturales son consorcios
de microbios sin duda más ricos que los entrantes seleccionados. Entre los entrantes
naturales, los entrantes de suero natural (NWS) son los cultivos más comunes que se
utilizan actualmente para producir diferentes variedades de quesos. Los NWS
indefinidos se usan típicamente para quesos italianos cocidos, de larga maduración, de
leche cruda extra duros, como Parmigiano Reggiano y Grana Padano. Junto con la leche
cruda microbiota, los NWS son responsables de la mayoría de las características del
queso (Smid et al., 2014). La ecología microbiana de las dos variedades de queso se
basa en una compleja interacción entre las LAB de inicio (SLAB) y las LAB no
iniciadoras (NSLAB), que se caracterizan por susdiferentes capacidades para crecer en
un sustrato cambiante. La dinámica de SLAB, que surgen principalmente de NWS, y
NSLAB, que surgen principalmente de leche cruda, determinan las características de
los quesos Parmigiano Reggiano y Grana Padano. Las propiedades microbiológicas y
químicasdel queso madurado dependen de las variables del proceso de elaboración del
queso, ya que estas variables pueden afectar el crecimiento microbiano. La microbiota
de la leche cruda se ve afectada por tratamientos específicos de la leche, desde el ordeño
hasta el llenado de la cuba de leche de queso. Lamicrobiota del NWS y la dinámica
microbiana desde la cuajada hasta el queso maduro contribuyen a la funcionalidad
microbiana en el queso.
Cuando se utiliza como iniciadores adjuntos, NSLAB contribuye positivamente con
una proteólisis secundaria más intensa y rápida a través de la liberación de aminoácidos
libres y acelera la maduración del queso (Lane y Fox, 1996; Lynch y otros, 1996).
También se ha informado que algunos NSLAB poseen enzimas clave para la
formación del sabor del queso a través del catabolismo de los aminoácidos libres. Otros
autores observaron que NSLAB utilizado como iniciadores adjuntos en la fabricación
de
queso cheddar está involucrado en la liberación de aminoácidos y péptidos
(McSweeney et al., 1994).
Se han descrito múltiples interacciones entre S. thermophilus, Lb. helveticus y Lb.
delbrueckii durante el marey del queso en un queso cocido (Charlet et al., 2009). Hubo
antagonismo entre Lb. helveticus y Lb. delbrueckii. Los lactobacilos tuvieron un efecto
positivo sobre S. thermophilus, que fue recíproco para Lb. helveticus. Lb. helveticus
tuvo un efecto negativo en la cultivabilidad de S. thermophilus. Y la combinación de
S. thermophilus inoculado en grandes cantidades y Lb. helveticus cepa H2 tuvo un
efecto negativo en el crecimiento de la cepa D2 de Lb. delbrueckii. Si bien el efecto
positivo de Lb. delbrueckii sobre S. las interacciones rmophilus en la leche ya se ha
descrito (Rajagopal y Sandine, 1990; Courtin y otros, 2002; Herve‐Jiménez et al., 2009;
Sieuwerts y otros, 2010; Thevenard y otros, 2011; Sasaki et al., 2014), otras
interacciones se han dado a conocer recientemente. Estas interacciones son de gran
importancia para la cinética de crecimiento de estreptococos y lactobacilos termófilos
durante la elaboración del queso (Charlet et al., 2009).
Sanna et al. (2005) reportaron una interacción negativa entre S. thermophilus y los
lactobacilos termófilos sobre la producción de folato; en particular, la baja cantidad de
folato producido por cultivo mixto (en comparación con el cultivo único) en leche de
cabra fermentada podría deberse a algún efecto inhibitorio de los lactobacilos hacia S.
thermophilus.
En los quesos Pecorino Sar do (Madrau et al.,2006) y Pecorino Romano DOP
(Mangia et al., 2011), tradicionalmente elaborados a partir de cultivos iniciadores
naturales (suero y scotta), cuando se producen con cepas autóctonas y seleccionadas,
los quesos dieron lugar a mejores características tecnológicas y nuciones.
La evolución de diferentes especies durante la maduración de Fiore Sardo mostró
que, cuando está presente, Lb. paracasei/casei persiste y domina la microbiota del
queso en el último período de maduración, lo que sugiere que esta especie, más
resistente a las limitaciones del queso maduro, podría estar involucrada en la proteólisis
y en otros procesos enzimáticos que ocurren durante el queso maduro. Maduración de
eese, según Mangia et al. (2008). Los mismos autores (Mangia et al., 2016) informaron
la persistencia de Lb. paracasei, así como de otros LAB, de leche a queso en queso
Casizolu pasta hilada, calificando la leche cruda como un reservorio de biodiversidad
microbiana. En contraste, el paso de estiramiento típico del queso 'pasta hilada', como
Ragusano, indujo una simplificación de los perfiles de leche cruda, permitiendo la
persistencia de solo algunas especies predominantes, como S. thermophilus, Lb.
delbrueckii subsp. lactis, Lc. lactis y S. macedonicus.
En los quesos Roncal (Ortigosa et al., 2006) y Fiore Sardo (Mangia et al., 2008),
ambos elaborados con leche de oveja, se ha descrito una posible interacción entre
lactococos mesófilos y lactobacilos. En Fiore Sar do, en particular, el efecto sinérgico
parecía particularmente evidente para las tasas de crecimiento y parecía ser más
relevante para las varillas y para Lb. plantarum en particular.
Se demostró que los números viables de Lc. lactis ssp. lactis (ya sea inoculada alone
o en cocultivo con una cepa de Lactobacillus) disminuyó gradualmente hasta el final
de la maduración. Esto implica la autólisis, lo que resulta en la liberación de enzimas
intracelulares que contribuyen a la liberación libre de AA (Kieronczyk et al. 2003, Gatti
et al., 2014).
Las diferentescepas podrían influir mutuamente en la formación de componentes del
sabor (Ayad et al., 2000). La combinación de cepas de Lc. lactis B1157 y SK110 dio
lugar a la formación de altos niveles de 3-metilbutanal. En SK110, una cepa altamente
proteolítica de origen industrial, la vía completa desde la caseína a través de la leucina
hasta el 3-metilbutanal no puede continuar debido a la falta de una enzima. Lc. lactis
cepa B1157, por otro lado, es una cepa silvestre no proteolítica y, por lo tanto, incapaz
de producir aminoácidos como sustrato paralas reacciones de transaminación y
descarboxilación. Cuando se cultivan juntas, las cepas B1157 y SK110 se
complementan entre sí con respecto a sus actividades enzimáticas, lo que resulta en
altos niveles de producción de 3-metilbutanal. Esta protocooperación entrecepas ofrece
nuevas posibilidades para la construcción de cultivos iniciadores a medida, ya que no
todas las actividades enzimáticas deseadas en una determinada vía de sabor que
conduce al sabor deben estar presentes en una cepa.
6.9 CONCLUSIONES
Las BAL aisladas denichos naturales y productos lácteos tienen un mayor potencial de
explotación, gracias a la variabilidad de los fenotipos, las diferencias en los requisitos
de aminoácidos y las matrices de enzimas codificadas en sus genomas. Su aplicación
puede permitir la producción de una amplia gama de componentes de sabor y perfiles
de sabor. Esta biodiversidad natural podría ofrecer un mayor potencial para producir
nuevos tipos de queso y productos lácteos.
Referencias
Arsköld E, Lohmeier‐Vogel E, Cao R, Roos S, Rådström P, van Niel EW. 2008. La vía de la fosfocetolasa
domina en Lactobacillus reuteri ATCC 55730 que contiene vías duales para la glucólisis. J Bacteriol
190(1):206–212.
Atiles MW, Dudley EG, Steele JL. 2000. Gen eclonación, secuenciación e inactivación de la
aminotransferasa de cadena ramificada de Lactococcus lactis LM0230. Appl Environ Microbiol
66(6):2325–29.
Axelsson LT, Ahrné S. 2000. Bacterias del ácido láctico. En: Priest F, Goodfellow M (eds). Sistemática
microbianaaplicada. Nueva York: Springer, pp 367-88.
Ayad EHE, Verheul A, Wouters JTM, Smit G. 2000. Aplicación de cultivos iniciadores silvestres para el
desarrollo de sabores en la fabricación de queso de planta piloto. Int Dairy J 10:169–79.
Bandell M, Lhotte ME, Marty‐Teysset C, Veyrat A, Prevost H, Dartois V, Divies C, Konings WN, Lolkema
JS. 1998. Mecanismo de los transportadores de citrato en carbohidratos y cometabolismo de citrato en
especies de Lactococcus y Leuconostoc. Appl Environ Microbiol 64:1594–1600.
Banks JM, Yvon M, Gripon JC, de la Fuente MA, Brechany EY, Williams AG, Muir DD. 2001. Mejora del
catabolismo de aminoácidos en queso cheddar usando alfa-cetoglutarato: Degradación de aminoácidos
en relación con compuestos volátiles y carácter aromático. Int Dairy J 11:235–43.
Bosset JO, Gauch R. 1993. Comparación delos compuestos de sabor volátiles de seis quesos europeos
«AOC» utilizando un nuevo método dinámico de espacio de cabeza GC-MS. Int Dairy J 3:359–77.
Broadbent JR, Gummalla S, Hughes JE, Johnson ME, Rankin SA, Drake MA. 2004. Sobreexpresión de
Lactobacillus casei d‐hydroxyisocaproic acid dehydrogenase in cheddar cheese. Appl Environ
Microbiol 70:4814–20.
Candioti, M, Bergamini C, Palma S, Brusetti M, Mainardi C, Salazar C. 2010. Caracterización del perfil de
proteólisis del queso ovino argentino elaborado mediante dosmétodos de producción diferentes. J Sci
Food Agric 90:36–42.
Charbonnel P, Lamarque M, Piard J, Gilbert C, Juillard V, Atlan D. 2003. Diversidad de la especificidad
del transporte de oligopéptidos en especies de Lactococcus lactis: una herramienta para desentrañar el
papel de OppA en la especificidad de la absorción. J Biol Chem 278:14832–40.
Charlet M, Duboz G, Faurie F, Le Quéré J‐L, Berthier F. 2009. Las múltiples interacciones entre
Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus y Lactobacillus delbrueckii afectan
fuertemente su cinética de crecimiento durante el making de quesos cocidos. Int J Food Microbiol
131:10–19.
Chaves‐López C, Serio A, Paparella A, Martuscelli M, Corsetti A, Tofalo R, Suzzi G. 2014. Impacto de los
cultivos microbianos en la proteólisis y liberación de péptidos bioactivos en leche fermentada. Food
Christensen JE, Broadbent JR, Steele JL. 2003. La hidrólisis de los péptidos derivados de caseína alfa(S1)‐
caseína(f1‐9) y beta‐caseína(f193‐209) por mutantes de deleción de peptidasa de Lactobacillus
helveticus indica la presencia de una endopeptidasa previamente no detectada. Appl Environ Microbiol
69(2):1283–6.
Christensen JE, Dudley EG, Pederson JA, Steele JL. 1999. Peptidasas y catabolismo de aminoácidos en
bacterias del ácido láctico. Ant Leeuwenhoek 76:217–46.
Courtin P, Monnet V, Rul F. 2002. Las proteinasas de la pared celular PrtS y PrtB tienen un papel diferente
en los cultivos mixtos de Streptococcus thermophilus/Lactobacillus bulgaricus en la leche.
Microbiología 148(Pt 11):3413–21.
Deguchi Y, Morishita T 1992. Requerimientos nutricionales en múltiples bacterias auxotrofas del ácido
láctico; lesiones genéticas que afectan a las vías biosintéticas de aminoácidos en Lactococcus lactis,
Enterococcus faecalis y Pediococcus acidilactici. Biosc Biotechn Biochem 56:913–918.
Dellaglio F Felis GE. 2005. Taxonomía de lactobacilos y bifidobacterias. En: Tannock, GW (Ed).
Probióticos y prebióticos. Aspectos científicos. Norfolk: Caister Academic Press, pp. 25–49.
Detmers FJ, Kunji ER, Lanfermeijer FC, Poolman B, Konings WN. 1998. Cinética yespecificidad de la
captación de péptidos por el sistema de transporte de oligopéptidos de Lactococcus lactis. Biochemistry
37(47):16671–79.
Detmers FJM, Lanfermeijer FC, Poolman B. 2001. Péptidos y transportadores de péptidos de casete de
unión a ATP. Res Microbiol 152(3‐4):245–58.
Deutsch SM, Molle D, Gagnaire V, Piot M, Atlan D, Lortal S. 2000. La hidrólisis de péptidos beta-caseína
secuenciados proporciona una nueva visión de la actividad peptidasa de las bacterias termófilas del ácido
láctico y destaca la resistencia intrínseca de los fosfopéptidos. Appl Environ Microbiol 66(12):5360–67.
Dherbécourt J, Falentin H, Jardin J, Maillard MB, Baglinière F, Barloy‐Hubler F, Thierry A. 2010.
Identificación de una esterasa lipolítica secretada en Propionibacterium freudenreichii, una bacteria del
proceso de maduración implicada en la lipólisis del queso Emmental. Appl Environ Microbiol
76(4):1181–8.
Díaz‐Muñiz I, Banavara DS, Budinich MF, Rankin SA, Dudley EG, Steele JL. 2006. Lactobacillus casei
metabolic potential to utilize citrate as an energy source in ripening cheese: a bioinformatics approach.
J Appl Microbiol 101:872–82.
Di Cagno R, De Pasquale I, De Angelis M, Calasso MP, Buchin S, Gobbetti M. 2010. Contribución de
lactobacilos no iniciadores adjuntos o atenuados seleccionados a la maduración del queso caciotta
italiano. Austr J Dairy Technol 65:188–91.
Do Carmo AP, Borges AC, de Moraes CA, de Carvalho AF. 2012. Desentrañando la genómica de las
bacterias del ácido láctico y la formación de sabores en productos lácteos. En: Perez Campos AI, Leon
Mena A (Eds). Lactobacillus. Clasificación. Usos e implicaciones para la salud. Hauppauge, NY: Nova
Biomedical, pp 203-22.
Do Carmo AP, da Silva DF, de Oliveira MNV, Borges AC, de Carvalho AF, de Moraes CA. 2011. Genes
implicados en el metabolismo proteico de la bacteria probiótica del ácido láctico Lactobacillus
delbrueckii UVFH2b20. Microbio beneficiosoes 2:27–38.
Doeven MK, Kok J, Poolman B. 2005. Determinantes de especificidad y selectividad del transporte de
péptidos en Lactococcus lactis y otros microorganismos. Mol Microbiol 57(3):640–49.
Dudley E, Steele J. 2001. Lactococcus lactis LM0230 contiene una sola minotransferasa involucrada en la
biosíntesis de aspartato, que es esencial para el crecimiento de la leche. Microbiol 147(Pt 1):215–24.
Dunn HC, Lindsay RC. 1985. Evaluación del papel de los compuestos aromáticos microbianos derivados
de Strecker en sabores de tipo impuro del queso Cheddar. J Dairy Sci 68:2859–74.
Engels WJM, Alting AC, Arntz MMTG, Gruppen H, Voragen AGJ, Smit G, Visser S. 2000. Purificación
parcial y caracterización de dos aminotransferasas de Lactococcus lactis subsp. cremoris B78 implicado
en el catabolismo de la metionina y aminoácidos de cadena ramificada. Int Dairy J 10:443–452.
Fernandez M, Kleerebezem M, Kuipers OP, Siezen RJ, Van Kranenburg R. 2002. Regulación del operón
metCcysK, implicado en el metabolismo del azufre en Lactococcus lactis. J Bacteriol 184:82–90.
Ferrario C, Duranti S, Milani C, Mancabelli L, Lugli GA, Turroni F, Mangifesta M, Viappiani A, Ossiprandi
MC, van Sinderen D, Ventura M. 2015. Explorando la auxotrofia de aminoácidos en Bifidobacterium
bifidum PRL2010. Microbiol frontal 6:1331.
Fox PF. 1989. Proteolysis durante la fabricación y maduración del queso. J Dairy Sci 72(6):1379–14.
Fox PF (Ed). 1993. Queso: química, física y microbiología. Londres: Chapman & Hall.
Fox PF, Wallace JM, Morgan S, Lynch CM, Niland EJ, Tobin J. 1996. Aceleración de la maduración del
quesog. Ant Leeuwenhoek 70:271–97.
Fukuda S, Toh H, Taylor TD, Ohno H, Hattori M. 2012. Las bifidobacterias productoras de acetato protegen
al huésped de la infección enteropatógena a través de transportadores de carbohidratos. Gut Microbes
3(5):449–54.
Fulyani F, Schuurman‐Wolters GK, Slotboom DJ, Poolman B. 2015. Las tasas relativas de importación de
aminoácidos a través del transportador ABC GlnPQ determinan el rendimiento de crecimiento de
Lactococcus lactis. J Bacteriol 198(3):477–85.
Gagnaire V, Piot M, Camier B, Vissers JP, Jan G, Léonil J. 2004. Estudio de las proteínas
batemáticasliberadas en el queso: un enfoque proteómico. Int J Food Microbiol 94(2):185–201.
Ganesan B, Weimer BC. 2004. Papel de la aminotransferasa IlvE en la producción de ácidos grasos de
cadena ramificada por Lactococcus lactis subsp. lactis. Appl Environ Microbiol 70:638–41.
Gatti M, Bottari B, Lazzi C, Neviani E, Mucchetti G. 2014. Evolución microbiana en quesos de leche cruda
y larga maduración producidos con iniciadores de suero natural indefinidos. J Dairy Sci 97:573–91.
Grossiord BP, Luesink EJ, Vaughan EE, Arnaud A, de Vos WM. 2003. Caracterización, expresión y
mutación de los genes Lactococcus lactis galPMKTE, implicados en la utilización de galactosa a
través de la vía Leloir. J Bacteriol 185(3):870–78.
Guédon E, Serror P, Ehrlich SD, Renault P, Delorme C. 2001. El represor ional de transcripción
pleiotrópicaCodY detecta el conjunto intracelular de aminoácidos de cadena ramificada en Lactococcus
lactis. Mol Microbiol 40(5):1227–39.
Hammes WP, Hertel C. 2003. Los géneros Lactobacillus y Carnobacterium. En: Dworkin M. The
prokaryotes: an evolving electronic resource for the microbiological community. Nueva York: Springer‐
Verlag, pp 320–403.
Hayaloglu AA McSweeney PLH. 2015. Eventos bioquímicos primarios durante la maduración del queso,
Capítulo 7. En: Ozer BH Akdemir‐Evrendilek G (Eds). Microbiología y bioquímica láctea: desarrollos
recientes. Boca Raton: CRC Press, pp 134-39.
Herve‐Jimenez L, Guillouard I, Guedon E, Boudebbouze S, Hols P, Monnet V, Maguin E, Rul F. 2009.
Análisis postgenómico de Streptococcus thermophilus cocultivado en leche con Lactobacillus
delbrueckii subsp. Bulgaricus: Participación del metabolismo del nitrógeno, las purinas y el hierro.
Appl Environ Microbiol 75:2062–2073.
Kang TS, Korber DR, Tanaka T. 2013a. Regulación de las vías glucolíticas duales para el metabolismo de
la fructosa en Lactobacillus panis PM1 heterofermentativo. Appl Environ Microbiol 79(24):7818–
26.
Kang TS, Korber DR, Tanaka T. 2013b. Contribuciones del citrato en el mantenimiento del potencial redox
y la producción de ATP: vías metabólicas y su regulación en Lactobacillus panis PM1. Appl Microbiol
Biotechnol 97(19):8693–703.
Kieronczyk A, Skeie S, Langsrud T, Yvon M. 2003. Cooperación entre Lactococcus lactis y lactobacilos no
iniciadores en la formación del aroma del queso a partir de aminoácidos. Appl Environ Microbiol
69:734–39.
Kimoto H, Nomura M, Suzuki I. 1999. Crecimiento energética de Lactococcus lactis subsp. Lactis Biovar
diacetylactis en cometabolismo de citrato y glucosa. Int Dairy J 9(12):857–63.
Klaenhammer TR, Azcarate‐Peril MA, Altermann E, Barrangou R. 2007. Influencia del medio lácteo en la
expresión génica y la utilización del sustrato en bacterias del ácido láctico. J Nutr 137(3 Suppl 2):748S–
50S.
Kunji ERS, Mierau I, Hagting A, Poolman B, Konings W N.1996. Los sistemas proteolíticos de las bacterias
del ácido láctico. Ant Leeuwenhoek 70:187–221.
Lamarque M, Charbonnel P, Aubel D, Piard J‐C, le Atlan D, Juillard V. 2004. Un transportador ABC
multifunción (Opt) contribuye a la diversidad de la especificidad de absorción de péptidosen el género
Lactococcus. J Bacteriology 186(19):6492–6500.
Lane CN, Fox PF. 1996. Contribución de lactobacilos iniciadores y adjuntos a la proteólisis en queso
cheddar durante la maduración. Int Dairy J 6:728–51.
Larrouture C, Ardaillon V, Pepin M, Montel MC. 2000. Capacidad de los cultivos iniciadores de carne para
catabolizar la leucina y evaluación de los productos de degradación mediante el uso de un método de
HPLC. Food Microbiology 17:563–70.
Law BA, Wigmore A. 1983. Maduración acelerada del queso Cheddar con proteinasa comercial y enzimas
intracelulares a partir de estreptococos iniciadores. J Dairy Science 50(5):519–25.
Lemieux L, Simard RE. 1992. Sabor amargo en productos lácteos. II. Una revisión de péptidos amargos de
caseínas: su formación, isolati e identificación, enmascaramiento de la estructura e inhibición. Lait
72:335–82.
Licitra G, Carpino S. 2014. Las microfloras y perfiles sensoriales de quesos italianos seleccionados con
denominación de origen protegida. Microbiol Spectr 2(1):CM‐0007‐2012.
Liu M, Nauta A, Francke C, Siezen RJ. 2008. Genómica comparativa de enzimas en vías formadoras de
sabor a partir de aminoácidos en bacterias del ácido láctico. Appl Environ Microbiol 74:4590–600.
Lorca G, Reddy L, Nguyen A, Sun EI, Tseng J, Yen M‐R, Saier MHJr. 2010. Bacterias lácticas:análisis
genómicos comparativos de sistemas de transporte. En: Mozzi F, Raya RR, Vignolo GM (Eds).
Biotecnología de bacterias lácticas. Aplicaciones novedosas. Ames, IA: Wiley Blackwell, pp 73-87.
Lu WW, Wang Y, Wang T, Kong J. 2015. El regulador global CodY en Streptococcus thermophilus controla
la red metabólica para aumentar el crecimiento en el entorno de la leche. Appl Environ Microbiol
81(7):2349–58.
Lynch CM, McSweeney PLH, Fox PF, Cogan TM, Drinan FD. 1996. Fabricación de queso cheddar con y
sinlac tobacilos adjuntos en condiciones microbiológicas controladas. Int Dairy J 6:851–67.
Madrau MA, Mangia NP, Murgia MA, Sanna MG, Garau G, Leccis L, Caredda M, Deiana P. 2006. Empleo
de microflora autóctona en la fabricación de queso Pecorino Sardo y evoluciónde parámetros
fisicoquímicos durante la maduración. Int Dairy J 16:876–85.
Mangia NP, Fancello F, Deiana P. 2016. Caracterización microbiológica utilizando enfoques combinados
dependientes del cultivo e independientes del queso Casizolu pasta hilada. J Appl Microbiol 120:329–
45.
Mangia NP, Murgia MA, Garau G, Deiana P. 2011. Propiedades microbiológicas y fisicoquímicas del queso
Pecorino Romano producido con un cultivo iniciador seleccionado. J Agric Sci Technol 13:585–600.
Mangia NP, Murgia MA, Garau G, Sanna MG, Deiana P. 2008. Influencia de cultivos LAB seleccionados
en la evolución de aminoácidos libres, ácidos grasos libres y microflora de queso Fiore sardo durante la
maduración. Food Microbiol 25:366–377.
Marilley L, Casey MG. 2004. Sabores de los productos queseros: vías metabólicas,herramientas alíticas e
identificación de cepas productoras. Int J Food Microbiol 90(2):139–59.
McSweeney PLH. 2004. Bioquímica y maduración del queso. Int J Dairy Technol 57:27–144.
McSweeney PLH, Sousa MJ. 2000. Biochemical pathways for the production of flavoyour compounds in
cheeses during maduraening. Lait 80:293–324.
McSweeney PLH, Wash EM, Fox PF, Cogan TM, Drinan FD, Castelo‐Gonzalez M. 1994. Un
procedimiento para la fabricación de queso Cheddar bajo condiciones bacteriológicas controladas y el
efecto de los lactobacilos adjuntos en la calidad del queso. Irish J Agric Food Res 33:183–92.
Moio L, Langlois D, Etievant PX, Addeo F. 1993. Potentes odorantes en búfalo de agua y queso mozzarella
bovino mediante el uso de análisis de inhalación por dilución de extracto. It J Food Sci 3:227–37.
Moio L, Piombino P, Addeo F. 2000. Compuestos de impacto olfativo del queso Gorgonzola. J Dairy Res
67:273–85.
Monnet V, Nardi M, Chopin A, Chopin MC, Gripon J‐C. 1994. Caracterización bioquímica y genética de
PepF, una oligopeptidasa de Lactococcus lactis. J Biol Chem 269:32070–73.
Nardi M, Fiez Vandal C, Tailliez P, Monnet V. 2002. La esterasa EstA es responsable de la capacidad
principal de Lactococcus lactis para sintetizar ésteres de ácidos grasos de cadena corta in vitro. J Appl
Nierop Groot MN, De Bont JAM. 1998. Conversión de fenilalanina a benzaldehído iniciada por una
aminotransferasa en Lactobacillus plantarum. Appl Environ Microbiol 64:3009–3013.
Oommen BS, McMahon DJ, Oberg CJ, Broadbent JR, Strickland M. 2002. Especificidad proteolítica de
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus: influye en las propiedades funcionales del queso
mozzarella. J Dairy Sci 85:2750–58.
Ortigosa M, Arizcun C, Irigoyen A, Oneca M, Torre P. 2006. Efecto de los cultivos adjuntos de lactobacillus
sobre las características hemicales microbiológicas y fisicoicasdel queso de leche de oveja tipo Roncal.
Food Microbiol 23:591–98.
Ozer BH, Akdemir‐Evrendilek G (Eds). 2015. Microbiología y bioquímica láctea: desarrollos recientes.
Boca Ratón: CRC Press.
Pedersen TB, Vogensen FK, Ardo Y. 2016 Efecto de las bacterias heterofermentativas del ácido láctico de
los iniciadores de DL en la maduración inicial del queso semiduro. Int Dairy J 57:72–79.
Peltoniemi K, Vesanto E, Palva A. 2002. Caracterización genética de un sistema de transporte de
oligopéptidosde Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Arch Microbiol 177:457–67.
Pereira CI, Neto DM, Capucho JC, Gião MS, Gomes AMP, Malcata FX. 2010. How three adventiciious
lactic acid bacteria affect proteolysis and organic acid production in model Portuguese cheeses
manufactured from several milk sources and two alternative coagulants. J Dairy Sci 93:1335–44.
Poveda JM, Chicon R, Cabezas L. 2015. Contenido de aminas biógenas y proteólisis en queso manchego
fabricado con Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei como complemento y otras cepas autóctonas
como iniciadores. Int Dairy J 47:94–101.
Pritchard G, Coolbear T. 1993. La fisiología y bioquímica del sistema proteolítico en bacterias del ácido
láctico. FEMS Microbiol Rev 12:179–206.
Pudlik AM, Lolkema JS. 2012. Redireccionamiento del metabolismo del citrato en Lactococcus lactis a la
transaminación impulsada por citratos. Appl Environ Microbiol 78 (18):6665–73.
Pudlik AM, Lolkema JS. 2013. La absorción de α-cetoglutarato por el transportador de citrato CitP impulsa
la transaminación en Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol 79(4):1095–101.
Qian M, Reineccius G. 2002. Identificación de compuestos aromáticos en queso Parmigiano‐Reggiano por
cromatografía de gases/olfatometría. J Dairy Sci 85:1362–69.
Rajagopal SN, Sandine WE. 1990. Crecimiento asociativo y proteólisis de Streptococcus thermophilus y
Lactobacillus bulgaricus en leche descremada. J Dairy Sci 73:894–99.
Randazzo CL, De Luca S, Todaro A, Restuccia C, Lanza CM, Spagna G, Caggia C. 2007. Caracterización
preliminar de bacterias silvestres del ácido láctico y lascapacidades de ir para producir compuestos de
sabor en el sistema de queso modelo madurado. J Appl Microbiol 103(2):427–35.
Ruggirello M, Dolci P, Cocolin L. 2014. Detección y viabilidad de Lactococcus lactis durante la maduración
del queso. PLoS One 9(12):e114280.
Rychlik M, Bosset JO. 2001. Aroma and off‐flavour compounds of Swiss Gruyere cheese. Identificación de
odorantes clave mediante estudios cuantitativos instrumentales y sensoriales. Int Dairy J 11:903–10.
Sadat‐Mekmene L, Genay M, Atlan D, Lortal S, Gagnaire V. 2011. Características originales de las
proteinasas de la envoltura celular de Lactobacillus helveticus. Una revisión. Int J Food Microbiol
146(1):1–13.
Saier MH Jr, Ye JJ, Klinke S, Nino E. 1996. Identificación de unsistema fosfotransferasa específico
dependiente de fosfoenolpiruvato inducido anaeróbicamente y evidencia de la vía glucol-Meyerhof de
Embden-Meyerhof en la bacteria heterofermentativa Lactobacillus brevis. J Bacteriol 178(1): págs.
314–6.
Sanna MG, Mangia NP, Garau G, Murgia MA, Massa T, Franco A, Deiana P. 2005. Selección de bacterias
del ácido láctico productoras de folato para mejorar la leche fermentada de cabra. Ital J Food Sci 17:143–
54.
Santiago B, MacGilvray M, Faustoferri RC, Quivey RG Jr. 2012. El aminoácido de cadena ramificada
aminotransferasa codificado por ilvE está implicado en la tolerancia al ácido en Streptococcus mutans.
J Bacteriol 194(8):2010–19.
Sasaki Y, Horiuchi H, Kawashima H, Mukai T, Yamamoto Y. 2014. La NADH oxidasa de Streptococcus
thermophilus 1131 es necesaria para lafermentación efectiva con Lactobacillus delbrueckii subsp.
Bulgaricus 2038. Biosci Microbiota Food Health 33(1):31–40.
Savijoki K, Ingmer H, Varmanen P. Sistemas proteolíticos de bacterias del ácido láctico. 2006. Appl
Microbiol Biotechnol 71:394–406.
Schmitt P, Vasseur C, Palip V, Huang DQ, Divies C, Prevost H. 1997. Producción de diacetilo y acetoína a
partir del cometabolismo de citrato y xilosa por Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides. Appl
Microbiol Biotechnol 47:715–718.
Schweikhard ES, Ziegler CM. 2012. Transportadores secundarios de aminoácidos: hacia un mecanismo de
transporte común. Curr Topics Membranas 70:1–28.
Sieuwerts S, Molenaar D, van Hijum SA, Beerthuyzen M, Stevens MJ, Janssen PW, Ingham CJ, de Bok
FA, de Vos WM, van Hylckama Vlieg JE. 2010. El análisis del transcriptoma de cultivo mixtorevela las
bases moleculares del crecimiento del cultivo mixto en Streptococcus thermophilus y Lactobacillus
bulgaricus. Appl Environ Microbiol 76:7775–84.
Simov ZI, Ivanov GY. 2005. Actividad proteolítica de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y
Streptococcus thermophilus en queso Kashkaval congelado almacenado. J Ind Microbiol Biotechnol
32(10):449–54.
Smit BA, Engels WJM, Alewijn M, Lommerse GTCA, Kippersluijs E, Wouters JTM, Smit G. 2004c.
Conversión química de alfa-cetoácidos en relación con laformación de flavor en alimentos fermentados.
J Agric Food Chem 52:1263–1268.
Smit BA, Engels WJM, Bruinsma J, Van Hylckama Vlieg JET, Wouters JTM, Smit G. 2004a. Desarrollo
de un método de cribado de alto rendimiento para probar la capacidad formadora de sabor de
microorganismos anaeróbicos. J Appl Microbiol 97:306–313.
Smit BA, Engels WJM, Wouters JTM, Smit G. 2004b. Diversidad del catabolismo de L-leucina en diversos
microorganismos implicados en fermentaciones lácteas, e identificación del paso de control de velocidad
en la formación del potente componente de sabor 3-metilbutanal. Appl Microbiol Biotechnol 64:396–
402.
Smit BA, Vlieg J, Engels WJM, Meijer L, Wouters JTM, Smit G. 2005a. Identificación, clonación y
caracterización de una alfa-cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada de Lactococcus lactis
involucrada en la formación del sabor. Appl Environ Microbiol 71:303–311.
Smit G, Smit BA, Engels WJM. 2005b. Formación de aromas por bacterias lácticas y perfiles bioquímicos
de aromas de productos queseros. FEMS Microbiol Rev 29:591–610.
Smid EJ, Erkus O, Spus M, Wolkers‐Rooijackers JCM, Alexeeva S, Kleerebezem M. 2014. Implicaciones
funcionales de la estructura de la comunidad microbiana de cultivos iniciadores mesófilos indefinidos.
Fábricas de células microbianas 13:S2.
Strahinic I, Kojic M, Tolinacki M, Fira D, Topisirovic L. 2010. La presencia del gen de la proteinasa prtP
en el aislado natural Lactobacillus plantarum BGSJ3e18. Lett Appl Microbiol 50:43–49.
Stressler T, Ewert J, Merz M, Funk J, Claaßen W, Lutz‐Wahl S, Schmidt H, Kuhn A, Fischer L. 2016. Una
nueva aminopeptidasa A específica de glutamil (aspartil) de Lactobacillus delbrueckii con propiedades
prometedoras para su aplicación. PLoS One 11(3):e0152139.
Sun Z, Harris HM, McCann A, Guo C, Argimón S, Zhang W, Yang X, Jeffery IB, Cooney JC, Kagawa TF,
Liu W, Song Y, Salvetti E, Wrobel A, Rasinkangas P, Parkhill J, Rea MC, O'Sullivan O, Ritari J,
Douillard FP, Paul Ross R, Yang R, Briner AE, Felis GE, de Vos WM, Barrangou R, Klaenhammer TR,
Caufield PW, Cui Y, Zhang H, O'Toole PW. 2015. Ampliar el potencial biotecnológico de los
lactobacilos a través de la genómica comparativa de 213 cepas y géneros asociados. Nat Commun
6:8322.
Sutula J, Coulthwaite L, Verran J. 2012. Medios de cultivo para el aislamiento diferencial de Lactobacillus
casei Shirota a partir de muestras orales. J Microbiol Methods 90:65–71.
Esta revisión debería citarse como: Tabet E, Mangia NP, Mouannes E, Hassoun G, Helal Z, Deiana P.
2016. Caracterización de la leche de cabra de raza libanesa Baladi y su idoneidad para preparar un
queso madurado utilizando un cultu de inicio seleccionado. Investigación de pequeños rumiantes
40:13–17.
Tanous C, Kieronczyk A, Helinck S, Chambellon E, Yvon M. 2002. Actividad de la glutamato
deshidrogenasa: Un criterio importante para la selección de cepas de bacterias del ácido láctico
productoras de sabor. Ant Leeuwenhoek 82:271–278.
Thevenard B, Rasoava N, Fourcassié P, Monnet V, Boyaval P, Rul F. 2011. Caracterización de sistemas
bicomponentes de Streptococcus thermophilus: análisis in silico, análisis funcional y expresión de
genes reguladores de respuesta en cultivo puro o mixto con su compañero yogurt, Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus. Int J Food Microbiol 151:171–81.
Trip H, Mulder NL, Lolkema JS. 2013. Clonación, expresión y caracterización funcional de transportadores
secundarios de aminoácidos de Lactococcus lactis. J Bacteriol 195(2):340–50.
Turner MS, Woodberry T, Hafner LM, Giffard PM. 1999. El locus bspA de Lactobacillus fermentum BR11
codifica un sistema de captación de L-cistina. J Bacteriology 181(7):2192–8.
Urbach G. 1993. Relaciones entre el sabor del queso y la composición química. Int Dairy J 3:389–422.
Van
Kranenburg R, Kleerebezem M, Van Hylckama Vlieg JET, Ursing BM, Boekhorst J, Smit BA, Ayad
EHE, Smit G, Siezen RJ. 2002. Flavor formation from amino acids by lactic acid bacteria: Predictions
from genome sequence analysis. Int Dairy J 12:111–21.
Wagner N, Tran QH, Richter H, Selzer PM, Unden G. 2005. Fermentación de piruvato por Oenococcus oeni
y Leuconostoc mesenteroides y papel de la piruvato deshidrogenasa en la fermentación anaeróbica.
Appl Environ Microbiol 71 :4966–71.
Wakai T, Yamamoto N. 2013. Un nuevo regulador transcripcional sensible a aminoácidos de cadena
ramificada, BCARR, actúa negativamente sobre el sistema proteolítico en Lactobacillus helveticus.
PLoS One 8(10) :e75976.
Wallace JM, Fox PF. 1997. Efecto de añadir aminoácidos libres a la cuajada de queso cheddar sobre el
desarrollo de proteólisis, sabor y textura. Int Dairy J 7:157–67.
Weimer B, Seefeldt K, Dias B. 1999. Metabolismo del azufre en bacterias asociadas al queso. Ant van
Leeuwenhoek 76:247–61.
Wolf IV, Peralta GH, Candioti M, Perotti MC. 2016. Elpapel de las propionibacterias en el perfil volátil de
los quesos Pategrás. Dairy Sci Technol 96:551–67.
Yvon M, Berthelot S, Gripon JC. 1998. La adición de alfa-cetoglutarato a la cuajada de queso semi-duro
mejora altamente la conversión de aminoácidos en compuestos aromáticos. Int Dairy J 8:889–98.
Yvon M, Chambellon E, Bolotin A, Roudot‐Algaron F. 2000. Caracterización y papel de la aminotransferasa
de cadena ramificada (BcaT) aislada de Lactococcus lactis subsp. cremoris NCDO 763. Appl Environ
Microbiol 66(2):571–7.
Zaunmüller T, Eichert M, Richter H, Unden G. 2006. Variaciones en el metabolismo energético de bacterias
ácido lácticas heterofermentativas biotecnológicamente relevantes durante el crecimiento en azúcares y
ácidos orgánicos. Appl Microbiol Biotechnol 72:421–29.
Yvon M, Chambellon E, Bolotin A, Roudot‐Algaron F. 2000. Caracterización y papel de la aminotransferasa
de cadena ramificada (BcaT) aislada de Lactococcus lactis subsp. cremoris NCDO 763. Appl Environ
Microbiol 66(2):571–7.
Zaunmüller T., Eichert M., Richter H., Unden G. 2006. Variaciones en el metabolismo energético de
bacterias ácido lácticas heterofermentativas biotecnológicamente relevantes durante el crecimiento en
azúcares y ácidos orgánicos. Appl Microbiol Biotechnol 72:421–29.
7 Necesidades de crecimiento y medios de cultivo
para LAB y especies asociadas a lácteos
Giuseppe Blaiotta1, Maria Aponte2 y Palmiro Poltronieri3
Agrícolas, División de Ciencias de la Uva y el Vino, Universidad de Nápoles
1 Departamento de Ciencias
Federico II, Avellino, Italia

2 Departamento de Ciencias Agrícolas, División de Microbiología , Universidad de Nápoles Federico II,
Portici, Italia
3 Instituto de Ciencias de la Producción de Alimentos (CNR-ISPA), CNR, Consejo Nacional de
Investigación de Italia,
Lecce, Italia
7.1 INTRODUCCIÓN
Lactobacillus (Lb.), Leuconostoc (Ln.), Lactococcus (Lc.), Pediococcus (Ped.),
Streptococcus (St.) y Enterococcus (Ent. ) son géneros de bacterias del ácido láctico
(LAB) comúnmente recuperados en ambientes lácteos donde pueden encontrar
compuestos para mantener su crecimiento. Según lo descrito por varios grupos de
investigación, basados en análisis genéticos y caracterización fenotípica, cada especie
puede mostrar necesidades específicas de aminoácidos como fuente de nitrógeno,
utilización de proteína de suero, preferencia por proteínas de suero modificadas con
ácido N-acetil neuramínico (NANA), lípidos y oligosacáridos, explotados para
promover su crecimiento. Además, este capítulo discutirá las especies asociadas a los
lácteos, como las Bifidobacterias.
7.2 MEDIOS DE CULTIVO ESTABLECIDOS PARA LACTOBACILOS

Los lactobacilos han sido aislados de ambientes y nichos a los que los miembros del
género estánadaptados para crecer. Además del entorno lácteo tratado en este libro, los
lactobacilos pueden aislarse de la glándula mamaria, el intestino del ganado desde el
cual se transfieren las bacterias al medio ambiente, la leche utilizada para amamantar a
los recién nacidos y los productos derivados de la leche. Las tecnologías en la
fabricación de lácteos, como los tratamientos térmicos de la leche, y la termización
suave durante la producción de cuajada permiten una recuperación selectiva de especies
termorresistentes, es decir, lactobacilos, enterococos y cepas de St. thermophilus. Sin
embargo, el aislamiento de una sola especie o cepa por poblaciones mixtas en cocultivo
se vuelve problemático por la presencia de otras especies que a menudo pueden superar
y competir con el candidato a ser aislado (Lima et al., 2009; Erkus et al., 2013). Sehan
propuesto numerosos medios selectivos/diferenciales basados en el uso de agentes
selectivos (Tharmaraj y Shah, 2003). A menudo, los compuestos selectivos ejercen una
alta inhibición.

potencia sobre las células lesionadas o estresadas (Reid et al., 2006; Reale et al., 2015),
lo que resulta en unasubestimación del número real de BAL dentro de la microflora
total, o en una falla en el aislamiento de especies específicas en la muestra.
Por ejemplo, en el contexto del proyecto de investigación cooperativa "Fermented
Beverages in East Europe (Ferbev)", del Programa Marco 6 de la Comisión Europea,
los grupos de trabajo estudiaron la comunidad bacteriana en las producciones de Ayran
utilizando dos tipos de cultivos: M17 con 0,5% de lactosa y de Man Rogosa Sharpe
(MRS), suplementado con 0,1 g/l de cicloheximida a inh levaduras ibit, para la
enumeración de LAB mesófilas y termófilas con incubación bajo anaerobiosis durante
48 h a 30 °C y 42 °C (Baruzzi et al., 2011; Baruzzi et al., 2016). Con propósitos
similares, se identificaron bifidobacterias en lactantes alimentados con leche y
productos lácteos, como leches fermentadas de diferente origen, productos lácteos
fermentados, yogures y otras producciones lácteas (especies no asociadas a lácteos
LAB). Para ello, existen varios procedimientos estándar, como la ISO 7889:2003 para
enumerar las especies asociadas a las BAL y lácteos delyogur (Davis, 2014). Entre las
bacterias LAB y asociadas a lácteos presentes o añadidas a estos productos, las cepas
con características probióticas han sido particularmente aisladas y enumeradas (Shah,
2000).
En los párrafos siguientes se prestará especial atención a las especies de lactobacilos
y sus requisitos de crecimiento.
7.2.1 Agar Rogosa

En el agar Rogosa, los lactobacilos aparecen como colonias blancas medianas a
grandes. Como es habitual, si se ha realizado un recubrimiento cuantitativo, se pueden
contar colonias, multiplicadas por el factor de dilución de la muestra, obteniendo así las
unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo o mililitro. Las colonias
presuntamente pertenecientes al género Lactobacillus deben confirmarse mediante
pruebas microscópicas y bioquímicas. Rogosuna composición se reporta en la Tabla
7.1, según productos comercializados y bibliografía (de Man et al., 1960).
Los lactococos/estreptococos no forman colonias en agar Rogosa acidificado
(Ravula y Shah, 1998). El crecimiento de Streptococcus thermophilus se previene
ajustando el pH a 5.1.
Debido al alto contenido de sal, Rogosa no es un medio adecuado para el aislamiento
de Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis y subsp. bulgaricus, una especie
comúnmente asociada con los productos lácteos. El medio Rogosa con menor consumo
de saly pH 5,4 podría utilizarse para la determinación del recuento total de lactobacilos
después de la incubación a 37 °C, lo que permite la discriminación de las cepas de Lb.
bulgaricus por diferencia.
Necesidades de crecimiento y medios de cultivo para LAB y especies asociadas a lácteos 129
Tabla 7.1 Composición de Rogosa (por litro de agua purificada).
Triptona 10,0 g/l

Extracto de levadura 5,0 g/l
Glucosa 20,0 g/l
Monooleato de sorbitán (Tween 80) 1,0 ml/l
Fosfato de dihidrógeno de potasio 6,0 g/l
Citrato de amonio 2,0 g/l
Acetato de sodio anhidro 17,0 g/l
Sulfato de magnesio 0,575 g/l
Sulfato manganoso 0,12 g/l
Sulfato ferroso 0,034 g/l
Ácido acético 1,32 ml/l
pH 5.4 ± 0.2
Cuadro 7.2 Composición de MRS (por litro de agua purificada).
Peptona 10,0 g/l

Lab‐Lemco 8,0 g/l
Glucosa 20,0 g/l
Monooleato de sorbitán (Tween 80) 1,0 ml/l
Dihidrógeno fosfato de potasio 2,0 g/l
Acetato de sodio * 3 H2O 5,0 g/l
Citrato triamónico 2,0 g/l
Sulfato de magnesio * 7 H2O 0,2 g/l
Sulfato de manganeso * 4 H2O 0,05 g/l
pH 6.2 ± 0.2
7.2.2 Medio MRS

El medio MRS suele ser adecuado para el crecimiento de una gran cantidad de
lactobacilos, así como otras bacterias, capaces de tolerar el pH ácido (Smid et al., 2014).
El tiempo y la temperatura óptimos para la incubación son de 2 a 3 días a 30 a 37 °C
paralas laboratorio mesófilas. Se debe evitar una incubación más larga, ya que la
viabilidad de las colonias puede disminuir posteriormente. La composición de MRS,
reportada en la Tabla 7.2, es similar a la del agar Rogosa, pero el pH es más alto.
En MRS, la peptona de caseína, el extracto de levadura y las sales de amonio
proporcionan nitrógeno. El polisorbato 80 suministra los ácidos grasos necesarios para
el crecimiento de lactobacilos (Corcoran et al., 2007). El manganeso y el magnesio son
factores de crecimiento. La glucosa es una fuente universal de energía y carbono. El
amonio y el acetato de sodio, el ácido acético y el sulfato ferroso actúan como
inhibidores de los estreptococos y otros microorganismos contaminantes y
proporcionan el pH bajo, bien soportado por los lactobacilos, pero no por varios otros
organismos. El fosfato y el acetato estabilizan el pH.
Leuconostoc mesenteroides puede enumerarse en paralelo en MRS suplementado
con vancomicina (de Man et al., 1960; Schillinger y Holzapfel, 2011; Smid et al., 2014).
El agar MRS puede acidificarse agregando 1,23 ml de ácido acético por litro (MRSa),
como se informó anteriormente para Rogosa agar. Las placas pueden incubarse en
condiciones anaeróbicas a dos temperaturas, para el recuento de lactobacilos mesófilos
y termófilos (Galat et al., 2016).
Alternativamente, MRS puede complementarse con carbonato de calcio (0,3-0,5%),
que confiere un color vítreo alagar. Las colonias de especies LAB altamente
acidificantes exhiben un halo claro. Esta observación puede ser una alternativa al uso
de indicadores de pH, que generalmente se vuelven rojos / amarillos al bajar el pH.
7.2.3 Leche desnatada y agar de suero

La leche kim (RSM) reconstituida al 10% esterilizada en autoclave,suplementada con
2% de glucosa y extracto de levadura al 1%, se utiliza a menudo para el cultivo continuo
de cepas LAB. La leche descremada líquida proporciona un ambiente anaeróbico, pero
la coagulación de las proteínas dificulta la manipulación.
Para la preparación de agar suero, el suero de leche debe desgrasarse mediante
centrifugación refrigerada. El suero de leche desnatada se filtra (0,22 μm) y se diluye
1:2 en extracto de levadura al 1%; Finalmente, se agrega un 5% de stock de agar a la
concentración final de 1.5%. En este punto, el agar debe verterse rápidamente en los
plates.
7,3 M17 MEDIO PARA LA SELECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE LACTOCOCOS Y
ESTREPTOCOCOS
M17 se utiliza para el conteo y aislamiento de lactococos y estreptococos. La
composición de M17 se presenta en el cuadro 7.3. La lactosa se añade después del
tratamiento en autoclave como unasolución esterilizada filtrada. Los cocos mesófilos y
termófilos pueden diferenciarse por incubación a 30 y 45 °C, respectivamente.
Los lactococos pueden ser discriminados por la aparición de colonias en medios
diferenciales, como el agar de Reddy (Reddy et al., 1972). Este medio permite la
diferenciación de Lactococcus lactis subsp. cremoris (sin actividad de arginina
deiminasa, sin utilización de citrato), Lc. lactis subsp. lactis (actividad de arginina
deiminasa, sin utilización de citrato) y Lc. lactis subsp. Lactis Biovar Diacetylactis
(actividad de arginina deiminasa, utilización de citrato). Además, la suplementación
con cloruro de sodio (6,5% vs. 4%) puede permitir la explotación de la mayor tolerancia
a la sal de Lc. lactis subsp. lactis versus subsp. cremoris (Al-Zoreky y Sandine, 1991;
Fernández et al., 2011).
Smid y colegas (2014) utilizaron diferentes medios en paralelo, para recuperar todas
las células bacterianas de un cultivo iniciador; tal enfoque permitió una colección de
cientos de culturas, que colectivamente representaban toda la diversidad en la muestra
(Erkus et al., 2013).
Cuadro 7.3 Composición M17 (por litro de agua purificada).
Triptona 5,0 g/l

Peptona de soja 5,0 g/l

Digestión de carne 5,0 g/l
Ácido ascórbico 0,5 g/l
Sulfato de magnesio anhidro 0,25 g/l
Glicerofosfato disódico 19,0 g/l
Lactosa 10% (solución filtrada) 10 g/l
7.3.1 Agar St. thermophilus

St. El agar termófilo (ST) es un medio no selectivo para el cultivo de estreptococos
termófilos. En la Tabla 7.4 se compara la composición del ST con la del caldo de Elliker
(Elliker et al., 1956), y ambos se han utilizado para aislar cocos (Gemelas et al., 2013).
Tabla 7.4 Composición del agar ST (por litro de agua purificada) y comparación con caldo Elliker.
Caldo ST Elliker
Hidrolizado enzimático de caseína 20,0 g/l Triptona 20,0 g/l

Dextrosa 5,0 g/l Extracto de levadura 5,0 g/l
Lactosa 5,0 g/l Dextrosa 5,0 g/l
Ácido ascórbico 0,5 g/l Gelatina 2,5 g/l
pH 6.8 Lactosa 5,0 g/l
Sacarosa 5,0 g/l
Ácido ascórbico 0,5 g/l
Acetato de sodio 1,5 g/l
Cloruro de sodio 4,0 g/l
El agar ST a 37 °C durante 24 h y en condiciones aeróbicas es selectivo para St.

thermophilus (Dave y Shah, 1996). St. thermophilus forma pequeñas colonias de
alrededor de 0,1-0,5 mm de diámetro, en agar ST a 37 °C bajo incubación aeróbica
(Dave y Shah, 1996).
7.4MEDIOS SELECTIVOS PARA LACTOBACILOS

Varios autores describieron medios selectivos supuestamente capaces de aislar
cuantitativamente cepas en el grupo Lactobacillus casei de manera confiable,
independientemente de sus condiciones fisiológicas (Desai et al., 2006), de leche,
cuajada de leche y cheese (Ravula y Shah, 1998), como el agar Lc (Tabla 7.5)
(Champagne et al., 1997).
Tabla 7.5 Composición del agar Lc (por litro de agua purificada).
Peptona bacteriológica 10,0 g/l

Lab‐Lemco 4,0 g/l
KH2PO4 2,0 g/l

Acetato de sodio 3,0 g/l
MgSO4 0,2 g/l
MnSO4 0,05 g/l
Hidrolizado ácido de caseína 1,0 g/l
Preadolescente 80 1,0 ml/l
Las cepas de LAB en una población mixta o superadas en número por otras especies
más abundantes pueden necesitar algunos agentes selectivos para apoyar su
crecimiento. Entre estos agentes, a menudo se usa una fuente única de carbohidratos
para distinguir las BAL a nivel de especie o cepa.
7.4.1 MRS vancomicina

Muchas BAL son intrínsecamente resistentes a la vancomicina. Los géneros
Leuconostoc, Weissella y Pediococcus, así como la mayoría de las especies de
Lactobacillus son resistentes. Muchos lactobacilos termófilos, incluyendo
Lactobacillus acidophilus y Lb. delbrueckii, son sensibles (Vinderola y Reinheimer,
2000).
Las bacterias gramnegativas suelen ser intrínsecamente resistentes a la vancomicina
debido a su membrana externa, que es impermeable a las moléculas de glicopéptidos
grandes (Quintiliani et al., 1995). Además, un mecanismo de resistaa la vancomicina
implica la alteración de los residuos de aminoácidos terminales del peptidoglicano (en
condiciones normales el péptido es d-alanil-d-alanina) al que se une la vancomicina. La
variación d-alanil-d-lactato resulta en la pérdida de una interacción hidrógeno-bonding
(con respecto a cinco enlaces para d-alanil-d-alanina) posiblemente entre la
vancomicina y el péptido. La pérdida de una interacción resulta en una disminución de
1000 veces en la afinidad. La variación d-alanil-d-serina causa una pérdida de
afinidadentre la vancomicina y el péptido, probablemente debido a un obstáculo
estérico.
En los enterococos, tal modificación parece deberse a la expresión de una enzima
que altera el residuo terminal. Hasta la fecha, se han caracterizado tres variantes
principales de resistencia en poblaciones residualesde Enterococcus faecium y faecalis
.
En 2011, se probó una variante de vancomicina en el Instituto de Investigación
Scripps que se une a la variación resistente del ácido d‐láctico en las paredes celulares
bacterianas resistentes a la vancomicina (Xie et al., 2011) y se une al objetivo original
(bacterias susceptibles a la vancomicina).
7.4.2 Agentes selectivos adicionales

Otros agentes selectivos que pueden incluirse en el medio MRS son cicloheximida,
ácido nalidíxico, sulfato de neomicina, sulfato de paromomicina, sales biliares, cloruro
de litio,metronidazol, propionato de sodio, lactato de sodio, cloruro de 2,3,5-
trifeniltetrazolio (TTC) (Sakai et al., 2010; Sutula et al., 2012; Colombo et al., 2014).
Además, la selectividad puede aumentarse reemplazando la glucosa y Lab-Lemco en la
composición MRScon una fuente de carbono diferente, como lactitol, ramnosa o
maltosa (Sakai et al., 2010). Por ejemplo, Sakai y colaboradores (2010) enumeraron
selectivamente Lb. casei Shirota (LcS) en agar cin modificado-ramnosa-2,3,5-
trifeniltetrazolio-cloruro-LBS-vancomia (agar M-RTLV; Cuadro 7.6), explotando el
uso selectivo de la l-ramnosa como fuente de carbono. En detalle, en el agar M-RTLV,
Lb. casei y Lactobacillus paracasei formaron colonias rojas, mientras que
Lactobacillus rhamnosus formaron colonias de tonos rosados o colonias conuna
mancha roja.
MRS-S (pH 5.7) es MRS suplementado con 0.1% de ácido sórbico y se utiliza como
medio selectivo general para Lactobacillus, Leuconostoc y Weissella spp. (Reuter,
1985).
Se ha propuesto un medio multiuso (APT) (pH 6.7) parala enumeración y el cultivo
de LAB heterofermentativos que incluyen lactobacilos, leuconóstocs y estreptococos
lácticos, así como otros microorganismos con altos requerimientos de tiamina en
productos cárnicos, alimentos enlatados, jugos de frutas y otros alimentos (Evans y
Niven, 1951).
TPPY (triptosa proteosa peptona extracto de levadura eriocromo T agar) puede
usarse para el conteo de St. thermophilus, Lb. delbrueckii. Ssp. bulgaricus y Lb.
acidophilus. St. Las colonias de termófilos aparecen circulares o semicirculares,
conveX, opacas, blanco-violeta, y a menudo tienen un centro oscuro. Lb. Delbrueckii
SSP. Las colonias de bulgaricus son planas, transparentes, de forma indefinida, con
un borde irregular, mientras que las colonias de Lb. acidophilus son pequeñas, de color
blanco a violeta, ligeramente elevadas y algo borrosas (Braquart, 1981).
Tabla 7.6 Composición del M-RTLV.
Peptona tripticasa 10,0 g/l

Fosfato de potasio monobásico 6,0 g/l
Preadolescente 80 1,0 g/l
Acetato de sodio trihidrato 25,0 g/l
Clorhidrato de vancomicina 1 mg/l
Metronidazol 10 mg/l
Cloruro de 2,3,5 trifeniltetrazolio (TTC) 30 mg/l
L-Ramnosa 20 g/l
Solución salina 5 ml
Agua destilada para sales 100 ml
MgSO4 11,5 g/l
(Fe3+) 2(SO4)3 0,68 g/l
MnSO4 2,4 g/l
pH 6.0
El agar diferencial L-S (LSD) es un medio selectivo que permite la diferenciación de

especies de lactobacilos y estreptococos en yogur. La reducción de 2,3,5‐TTC, junto
con la reacción de caseína, permite la discriminación entre lactobacilos y estreptococosi

mediante morfología de colonia. El agar LSD está compuesto de peptona de caseína,
peptona de soja, extracto de carne de res, extracto de levadura, dextrosa, cloruro de
sodio, clorhidrato de 1-cisteína, 2, 3, 5-TTC, leche en polvo, agar y agua destilada o
desionizada. Las colonias brillantes con halos claros se consideran estreptococos
lácticos, mientras que las colonias rosadas con un centro rojo probablemente se
informen a Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus. Lb. acidophilus y otros lactobacilos de
fuentes lácteas aparecen como colonias rojas con un halo opaco (Eloy y Lacrosse,
1976).
El agar Briggs con adición de jugo de tomate se usa con frecuencia para el cultivo
de lactobacilos a partir de productos lácteos (Mitsuoka et al., 1965).
Composición del M-RTLV, basada en MRS, incluyendo TTC, vancomicina y l-
ramnosa is reportada en la Tabla 7.6.
7.4.3 VSM más agentes selectivos para la enumeración de grupos de Lb. casei
El agar MRS suplementado con ácido nalidíxico, bilis, cloruro de litio, metronidazol,
propionato de sodio y vancomicina puede usarse para el aislamiento selectivo de
Lactobacillus paracasei. Con base en la tolerancia de los miembros de la especie del
grupo Lb. casei a TTC, Sutula y colaboradores (2012) desarrollaron un medio
diferencial, LcS Select, para el aislamiento selectivo y el conteo del probiótico Lb. casei
Shirota. En detalle, el agar MRS se complementó con azul de bromofenol como
indicador de pH, vancomicina y agente reductor clorhidrato de l-cisteína para el
desarrollo de la morfología diferencial de la colonia. Lb. casei Shirota cultivado en el
medio produjo morfologías de colonias distintivas. Elrecuento viabl e de colonias de
LcS se correlacionó con las aisladas en agar lactitol-LBS-vancomicina (LLV) (Sakai et
al., 2010).
7.4.4 MRS-salicina, MRS-sorbitol, MRS-ribosa, MRS agar

gluconato
MRS, preparado sin azúcares según Lankaputhra y Shah (1996), se complementa con
soluciones esterilizadas por filtro de salicina, sorbitol, ribosa o gluconato (10%)
después del autoclave (Dave y Shah, 1996). MRS-salicina o agar MRS-sorbitol pueden
utilizarse para el recuentoselectivo de Lb. acidophilus, siempre que Lb. casei no esté
presente en el producto (en cuyo caso se obtiene un recuento total para ambas especies
(Coeuret et al., 2003).
7.4.5 MRS-clindamicina-ciprofloxacino agar

El agar MRS-clindamicina-ciprofloxacina (MRS-CC) demostró tener una selectividad
relativamente buena para Lb. acidophilus; sin embargo, también promueve el
crecimiento de cepas de Lb. casei. El agar MRS-CC sólo puede utilizarse como medio
selectivo para la enumeración de Lb. acidophilus si Lb. casei no está presente en la
muestra a niveles similares o superiores a los de Lb. acidophilus.
Según Van de Casteele et al. (2006), el agar MRS-CC debe considerarse el medio
electivo para la enumeración selectiva de las cepas probióticos comerciales Lb.
acidophilus La-145 y Lafti L10. La Organización Internacional de Normalización (ISO,
20128/IDF 192: 2006) (ISO, 2006) ha recomendado agar MRS-CC para la enumeración
de presuntas Lb. acidophilus en productos lácteos, incluidas leches fermentadas y no
fermentadas, leche en polvo y fórmulas infantiles, donde las cepas presuntas de Lb.
acidophilus están presentes junto con otras BAL y bifidobacterias.
7.4.6 Medio MMV para la enumeración de grupos Lb. casei

MMV, un medio basal con una mezcla que contiene todos los componentes de MRS,
excepto glucosa y extracto de carne y suplementado con maltosa como única fuente de
carbohidratos, l-cisteína, vancomicina y púrpurade bromocresol se sugiere para el
aislamiento y la enumeración de los miembros del grupo Lb. casei (Ludwig et al., 2009)
(ver Tabla 7.7).
El uso de maltosa como fuente de carbohidratos es ampliamente reconocido para
varios lactobacilos, incluido el Lb. casei que comparte la capacidad de metabolizar la
maltosa, acidificando así el medio (Gänzle y, 2012).
7.4.7 MRS que contienen fructosa (MRSF)

Tabasco et al. (2007) descubrieron que un medio no antibiótico basado en el medio
MRS acidificado recomendado para la enumeración de microorganismos
característicos del yogur (ISO, 2002) nofue seleccionado para la enumeración de Lb.
delbrueckii subsp. bulgaricus ya que también permitió el crecimiento de Lb.
acidophilus, Lb. paracasei subsp. paracasei, y Bifidobacterium (Bif.) lactis. Para este
propósito, los autores propusieron el uso de MRSF: MRS sin glucosa o extracto de
carne, suplementado con fructosa, hidrolizado de ácido de caseína y cisteína. El medio
permitió una diferenciación morfológica entre colonias lenticulares con 1-2 mm de
diámetro de Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus y colonias esponjosas con 2–3 mm de
diámetro de Lb. acidophilus. Además, la sustitución de glucosa por fructosa acoplada a
la incubación a 45 °C permite la exclusión de Lb. paracasei subsp. paracasei y Bif.
lactis (Tabasco et al., 2007).
Tabla 7.7 Composición del agar MMV.
Peptona 10,0 g/l

Extracto de levadura 4.0 g/l
Hidrogenofosfato dipotásico 2,0 g/l
Acetato de sodio3H2O 5,0 g/l
Citrato triamónico 2,0 g/l Sulfato de magnesio 7H 2 O 0,20 g/l
Sulfato de manganeso 4H2O 0,05 g/l

Tween 80 1,0 ml Maltosa 10,0 g/l l‐Cisteína HCl 0,5 g/l pH

6,9–7,0 Bromocresol púrpura 1,6% (p/v, solución de etanol) 3,0 ml
Vancomicina 10 g/l (1 μg/ml final) 1 ml
7.4.8 mMRS-BPB
Lee y Lee (2008) desarrollaron un medio MRS modificado (mMRS-BPB), a saber,
MRS que contiene cisteína y azul de bromofenol (pH 6.5), que, incubado en
anaerobiosis, permite la enumeración diferencial de varias especies, incluyendo Lb.
plantarum, Lb. casei, Lb. paracasei y Lb. rhamnosus, en leche fermentada. Según
Ricciardi et al. (2015), quienes probaron el procedimiento en 461 cepas de LAB
pertenecientes a ocho géneros y 35 especies, el medio discriminó correctamente a los
miembros de los grupos Lb. plantarum y Lb. casei de otras especies de LAB (Ricciardi
et al., 2015).
7.4.9 Agar MRS-NNLP y agares cromogénicos para comunidades

complejas
MRS suplementado con ácido nalidíxico, sulfato de neomicina, cloruro de litio y sulfato
de paromomicina (MRS-NNLP) es útil para diferenciar ynumerar especies de LAB en
comunidades complejas. Varios medios bacteriológicos han sido evaluados para la
enumeración selectiva de Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, St. thermophilus, Lb. casei,
Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, bifidobacteria, y propionibacteria (Sakai et al., 2010;
Sutula et al., 2012).
Galat et al. (2016) desarrollaron recientemente un método basado en el cultivo que
combina nuevos medios de agar cromogénicos y condiciones de incubación apropiadas
para enumerar, según nuestro conocimiento por primera vez, cepas de LAB en leche
fermentada. Agar M1, que contenía sustratos cromogénicos para la detección de
actividades β-galactosidasa y β-glucosidasa, permitió la enumeración selectiva de Lb.
rhamnosus, Lb. paracasei subsp. paracasei y St. thermophilus. Dependiendo de la
presencia de algunas o todas las especies anteriores, el agar M1 puede complementarse
con l-ramnosa o vancomicina, y las incubaciones pueden llevarse a cabo a 37 °C o 44
°C para aumentar la selectividad. El agar M2, que contiene un sustrato cromogénico, se
utilizó para enumerar selectivamentela β-galactosidasa productora de Lb. delbrueckii
subsp. cepas de bulgaricus después de la incubación a 47 °C. El método cromogénico
permitió la enumeración inequívoca de cada especie, con discriminación entre dos
cepas de Lb. paracasei en leche fermentada (Galat et al. , 2016).
7.4.10 Medio diferencial homofermentativo-heterofermentativo

Las BAL heterofermentativas reducen una porción de fructosa a manitol
produciendoCO2, ácido láctico y ácido acético cuando la fructosa es la única fuente de
carbohidratos. Por otro lado, las BAL homofermentativas producen 3 moles de ácido
láctico independientemente por la hexosa fermentable, incluida la fructosa. Dado que
las BAL homofermentativas producen más ácido a partir de una cantidad fija de
fructosa, si se comparan con las BAL heterofermentativas, se puede establecer

yexplotar una diferencia de pH para discriminar entre las BAL homofermentativas y
heterofermentativas en un medio con una cantidad limitada de fructosa como única
fuente de carbohidratos.
En primer lugar, Sims (1968) diseñó un medio selectivo que contenía ácido fusídico
para cultivar lactobacilos homofermentativosde origen lácteo, oral y vaginal, pero tanto
los lactobacilos homofermentativos como los heterofermentativos demostraron ser
capaces de crecer en fusídicos.
Tabla 7.8 Medio diferencial homofermentativo-
heterofermentativo (HHD).
Fructosa 0,25% (14 mM)

KH2PO4 0,25% (18 mM)
Aminoácidos libres 1,0 g/l
Peptona tripticasa 10,0 g/l
Peptona de fitono 1,5 g/l
Casaminoácidos 3,0 g/l
Preadolescente 80 1,0 g/l
Medio que contiene ácido. Más tarde, McDonald et al. (1987) diseñaron un medio
homofermentativo-heterofermentativo (HHD) que permitió la enumeración diferencial
de los dos tipos fisiológicos de LAB. El medio, cuya composición se indica en la Tabla
7.8, se basa enel uso de verde de bromocresol como indicador de pH. El caldo HHD
inoculado con BAL homofermentativo es verde, mientras que permanece azul en el
caso de BAL heterofermentativo. Además, las células de las especies
homofermentativas en la parte inferior del tubo son de color azul a verde, mientras que
las células heterofermentativas permanecen blancas. Por lo tanto, la diferencia en la
reducción del pH puede ser explotada para discriminar LAB homofermentativo y
heterofermentativo en caldo HHD. En placas de agar HHD, después de 3 días de
incubación a 30 °C, las BAL homofermentativas producen colonias azules a verdes,
mientras que las BAL heterofermentativas muestran colonias blancas (McDonald et
al., 1987).
En realidad, la fórmula HHD se basa en el medio MD (Daeschel et al., 1984), que
contiene fructosa (14 mM, 0,25%), KH 2PO4 (18 mM, 0,25%) y fuentes de aminoácidos
.
7.5 MEDIOS PARA EL AISLAMIENTO DE BIFIDOBACTERIAS

Las bifidobacterias se pueden enumerar utilizando métodos de referencia
microbiológicos internacionales estándar (ISO 29981:2010). Varios compuestos
pueden promover el crecimiento de bifidobacterias (Ventura y Zink, 2002; Zitz et al.,
2007), es decir, proteínas de suero que contienen ácido N-acetil-neuramínico (NANA),

fructooligosacáridos (FOS) (Gibson y Wang, 1994) e inulina (Roberfroid et al., 1998)
se han utilizado como compuestos bifidogénicos. Otro compuesto bifidogénico,
producidopor
Propionibacterium freudenreichii (PF) (Isawa et al., 2002; Furuichi et al., 2007) y cepas
del grupo Lb. casei (Kang et al., 2015), es ácido 1,4-dihidroxi-2-naftoico (DHNA).
DHNA es un precursor de la menaquinona (MK) y se transforma en MK por
peinacióncon una unidad isoprenoide.
Bifidobacterium spp. puede propagarse en caldo GAM modificado (Gifu Anaerobic
Medium) (Tabla 7.9) suplementado con glucosa al 1% (p/v). El caldo GAM es un medio
líquido para bacterias anaeróbicas, que contiene hemina como factor de crecimiento
esencial, tioglicolato de sodio y l-cisteína como agentes reductores, y almidón para
absorber los metabolitos tóxicos producidos.
Tabla 7.9 Caldo GAM (g/l).
Peptona 5,0 g/l

Peptona de soja 3.0
Proteosa-peptona Suero 5.0
digerido 10.0
Extracto de 2.5
levadura Extracto 2.2
de carne 1.2
Extracto de hígado 0.5
Dextrosa 5.0
Almidón soluble 0.2
L-triptófano L- 0.3
cisteína 0.3
Na tioglicolato l-arginina
1.0
Vitamina
5 mg
K Hemin
10 mg
KH2PO4
2.5
NaCl pH
3.0
7.3
Tabla 7.10 Composición media de la PNLN.
Ácido nalidíxico 15.0 mg

Sulfato de neomicina 100 mg
Cloruro de litio 3,0 g
Sulfato de paromomicina 200 mg
clorhidrato de L-cisteína 0,5 g
Agua destilada esterilizada por filtro (0,22 μm) 100 ml
Añadido al caldo MRS al 10%
7.5.1 Agar MRS-NNLP

MRS-NNLP (ácido nalidíxico, sulfato de neomicina, cloruro de litio, sulfato de
paromomicina) se utiliza para enumerar bifidobacterias (Tabla 7.10) en incubación
anaeróbica a 37 °C durante 72 h. Las mejoras en el crecimiento selectivo se obtuvieron
mediante la adopción de nuevos suplementos.
Para el agar MRS-NNLP, se agregó NNLP esterilizado por filtro al MRS esterilizado
en autoclave y l-cisteína (0,05%) (Laroia y Martin, 1991).
7.5.2 BSM, WSP, TOS‐MUP

El medio selectivo de bifidobacterias (BSM) que contiene arginina, piruvato de sodio,
menadiona y hemina y el ag ar modificado de Wilkins-Chalgren anaerobio (Wilkins y
Chalgren, 1976) con peptona de soja (WSP) se han aplicado para la enumeración de
bifidobacterias (Bunesova et al., 2015).
El agar MRS-CC, la mupirocina de litio de rafinosa-propionato (RP-MUP), el
oligosacárido transgalactosilado (TOS)-propionato agar basa suplementado con MUP
y sales de litio (ISO 29981:2010) son medios de crecimiento selectivos alternativos para
las bifidobacterias. TOS-MUP contiene oligosacáridos transgalactosilados obtenidos
por la transformación de lactosa por la enzima β-galactosidasa. Específicamente, TOS-
MUP fue adecuado para enumerar selectivamente bifidobacterias y LAB en leches
fermentadas (Miranda et al., 2014; Süle et al., 2014).
El caldo base de rafinosa-propionato (RP) suplementado con solución MUP se ha
propuesto como un medio alternativo para la enumeraciónde bifidobacterias. Para la
preparación de RP, el componente TOS se sustituye por rafinosa (5 g / l) en la
composición de caldo de TOS-propionato.
La comparación de los medios basados en MUP para la enumeración selectiva de
bifidobacterias en suplementos probióticos ha sido realizada por Bunesova y
colaboradores (2015).
7.5.3 MRS-ABC
La composición de MRS-ABC (A: solución de dicloxacilina, B: solución de cloruro de
litio, C: solución de cisteína) se informa en la Tabla 7.11. MRS-NNLP y MRS-ABC se
utilizaron en asociación con el sistema de recubrimiento de Petrifilm 3 M (3 M
Corporation, Food Safety Division, St. Paul, MN, EUA) para enumerar bifidobacterias
en leche fermentada (Miranda et al., 2011). En otros estudios, se utilizaron sistemas de
Petrifilm para la enumeración de St. thermophilus (Miranda et al., 2015) y con MRS
vancomicina (M RS-V) para la resolución de colonias de Lb. casei incubadas en
condiciones anaeróbicas (Di Lena et al., 2015).
La fiabilidad de RP-MUP se evaluó mediante la comparación con protocolos de
referencia y medios de cultivo para la enumeración de bifidobacterias.
MRS-ABC se presenta en la Tabla 7.11. Después de la incubación, se contaron las
colonias formadas en cada composición de medio de cultivo y los resultados se
expresaron como unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml).
Cuadro 7.11 MRS-ABC medio. Composición de soluciones A, B y C.
Un Dicloxacilina, 10 mg/100 ml de agua destilada Filtro esterilizado (0,22 μm) 0,5% en MRS
B LiCl, 2 g/18 ml de agua destilada Filtro esterilizado (0,22 μm) 1,0% en MRS
C L-cisteína, 10 g/100 ml de agua destilada Autoclave (121°C/15 min) 0,5% en MRS
7.6 FENOTIPADO
La caracterización fenotípica de las cepas de BAL puede basarse en características
bioquímicas, serológicas y morfológicas. Recientemente, los microarrays de fenotipo
automatizados de Biolog (Hayward, CA, EUA) pueden proporcionar hasta 100
caracteres para ser examinados en un solo paso. Sobrela base del uso de diferentes
fuentes de carbono, nitrógeno, fosfato y azufre, en la inclusión de aditivos nutricionales
o agentes inductores de estrés (sales, pH, agentes antimicrobianos), se pueden comparar
alrededor de 2000 fenotipos (Galat et al., 2016). Estos métodos permitenperfiles
fenotípicos específicos para cepas específicas. Se pueden observar y seleccionar
patrones diferenciales de fermentación de carbohidratos para pruebas preliminares de
las actividades enzimáticas correspondientes.
Las características fisiológicas y bioquímicas de las BAL se basan en propiedades
generales conocidas y ensayos tentativos. Leuconostoc spp. son mesófilos, mientras
que muchos otros pueden crecer a temperaturas superiores a 37 °C. Algunas especies
se agrupan por fermentación homoláctica, mientras que otras son heterofermentativas
y producen CO2. Esto puedeevidenciarse utilizando un agar colocado sobre el agar
selectivo después de la inoculación de la bacteria. Después de unos días, el gas empujará
el agar en la parte superior del vial.
La caracterización se realiza mediante monitorización: tolerancia al ácido, la sal y la
temperatura; la naturaleza óptica del isómero del ácido láctico producido, "D, L, o
ambos (meso) ácido láctico; ensayos enzimáticos" (API20, Biolog, ensayos de
fenotipado); cribado en los medios para determinar las necesidades de nutrientes y
temperaturas; crecimiento en citrato, metabolismo en diferentes azúcares; pH final del
caldo fermentado; Cromatografía de gases o cromatografía en capa fina (TLC) o
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para análisis de metabolitos;
Identificación de exopolisacáridos sintetizados y propiedad viscosa del caldo
fermentado.
La producción depolisacáridos exo (EPS) en asociación con la detección del gen eps
de cepas de St. thermophilus se puede cribar en placas de leche roja de rutenio (Stingele
et al., 1996).
7.7 CONCLUSIONES
En microbiología láctea, los medios utilizados para cultivar y reintegrar selectivamente
lactococos,estreptococos, lactobacilos y bifidobacterias de comunidades microbianas
complejas han evolucionado significativamente para apoyar los estudios sobre la

biodiversidad de las cepas presentes en los productos lácteos naturales y para
caracterizar los iones de productos lácteos con microbiota natural o suplementados con
cepas funcionales, como las cepas probióticas.
Referencias
Al‐Zoreky N, Sandine WE. 1991. Lactococcus genus: Un medio de agar selectivo y diferencial. J Food
Science 56(6):1729–30.
Baruzzi F, Quero GM, Poltronieri P, Morea M, Morelli L. 2011. Un protocolo in vitro para el aislamiento
directo de posibles lactobacilos probióticos de leche cruda de bovino y leches fermentadas tradicionales.
Appl Microbiol Biotechnol 90:331–42.
Baruzzi F, Quintieri L, Caputo L, Cocconcelli PS, Borcakli M, Owczarek L, Jasinska UT, Skapska S, Morea
M. 2016. Mejora de la calidad de Ayran mediante la selección de cultivos microbianos autóctonos. Food
Braquart P. 1981. Un medio de agar para laración diferencial de enuma de Streptococcus thermophilus
y Lactobacillus bulgaricus en yogur. J Appl Bacterio 51:303–305.
Bunesova V, Musilova S, Geigerova M, Pechar R, Rada V. 2015. Comparación de medios basados en
mupirocina para la enumeración selectiva de bifidobacterias ensuplementos probiotic. J Microbiol Meth
109 :106–109.
Corcoran BM, Stanton C, Fitzgerald GF, Ross RP. 2007. El crecimiento de lactobacilos probióticos en
presencia de ácido oleico mejora la supervivencia posterior en jugo gástrico. Microbiol 153:291−99.
Champagne CP, Roy D, Lafond A. 1997. Enumeración selectiva de Lactobacillus casei en leches
fermentadas tipo yogur basadas en una temperatura de incubación de 15° C. Biotechnol Technol 11:567–
69.
Coeuret V, Dubernet S, Bernardeau M, Gueguen M, Vernoux JP. 2003. Aislamiento, caracterización e
identificación de lactobacilos centrándose principalmente en quesos y otros productos lácteos. Lait
83:269–306.
Colombo M, Zimmermann de Oliveira AE, de Carvalho AF, Nero LA. 2014. Desarrollo de un medio de
cultivo alternativo para la enumeración selectiva de Lactobacillus casei en leche fermentada. Food
Daeschel MA, McFeeters RF, Fleming HP, Klaenhammer TR, Sanozky RB. 1984. Mutación y selección de
cepas de Lactobacillus plantarum que no producen dióxido de carbono a partir de malato. Appl Environ
Microbiol 47, 419–420.
Dave RI, Shah NP. 1996. Evaluación de medios para la enumeración selectiva de Streptococcus
thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, y bifidobacterias.
J Dairy Sci 79:1529–36.
Davis C. 2014. Enumeración de cepas probióticas: revisión de técnicas alternativas y dependientes del
cultivo para cuantificar bacterias viables. J Microbiol Methods 103:9–17. de Man JC, Rogosa M, Sharpe
ME. 1960. Un medio para el cultivo de lactobacilos. J Appl Bacteriol 23:130–35.
Desai AR, Shah NP, Powell IB. 2006. Discriminación de aislados de la industria láctea del grupo
Lactobacillus casei. J Dairy Sci 89:3345–51.
Di Lena M, Quero GM, Santovito E, Verran J, De Angelis M, Fusco V. 2015. Un medio selectivo para la
isolación y enumeración precisa de lactobacilos del grupo Lactobacillus casei en leches probióticas y
productos lácteos. Int Dairy J 47:27–36.
Elliker PR, Anderson AW, Hannesson G. 1956. Un medio de cultivo en agar para estreptococos y
lactobacilos del ácido láctico. J Dairy Sci 39:1611–12.
Eloy v, Lacrosse R. 1976. Lactobacillus Streptococcus medio diferencial. Bullettin de Recherches
Agronomiques Gembloux 11:83.
Erkus O, de Jager VC, Spus M, van Alen‐Boerrigter IJ, van Rijswijck IM, Hazelwood L, Janssen PW, van
Hijum SA, Kleerebezem M, Smid EJ. 2013. La diversidad multifactorial sostiene la estabilidad de la
comunidad microbiana. ISM J 7:2126–36.
Fernández E, Alegría A, Delgado S, Martín MC, Mayo B. 2011. Perfil genético fenotípico y molecular
comparativo de Lactococcus lactis silvestre subsp. cepas de lactis de L. lactis subsp. lactis y L.
lactis subsp. Genotipos cremoris, aislados de quesos sin entrantes elaborados con leche cruda. Appl
Environ Microbiol 77(15):5324–35.
Galat A, Dufresne J, Combrisson J, Thépaut J, Boumghar‐Bourtchai L, Boyer M, Fourmestraux C. 2016.
Nuevo método basado en medios cromogénicos para la discriminación y enumeración selectiva de
bacterias del ácido láctico en productos lácteos fermentados. Food Microbiol 55:86–94.
Gänzle MG, R. 2012. Metabolismo de oligosacáridos yalmidón en lactobacilos: una revisión. Frontiers
Microbiol 26:340.
Gemelas L, Rigobello V, Ly‐Chatain MH, Demarigny Y. 2013. Enumeración selectiva de Lactococcus en
leche cruda. Food Nutr Sci 4:49–58.
Gibson GR, Wang X. 1994. Propiedades bifidogénicas de diferentes tipos de fructooligosacáridos. Food
ISO 7889:2003. Yogur – Enumeración de microorganismos característicos – Técnica de recuento de
colonias a 37 °C.ISO 29981:2010. Productos lácteos. Enumeración de presuntas bifidobacterias. Técnica de
recuento de colonias a 37 °C.
Laroia S, Martin JH. 1991. Métodos para enumerar y propagar bifidobacterias. Cult Dairy Products
(Productos lácteos de culto) J 26:32–33.
Lee HM, Lee Y. 2008. Un medio diferencial para las bacterias productoras de ácido láctico en un cultivo
mixto. Lett Appl Microbiol 46:676–81. doi: 10. 1111/j.1472‐765X.2008. 02371.x.
Lima KGC, Kruger MF, Behrens J, Destro MT, Landgraf MB, Franco DGM. 2009. Evaluación de medios
de cultivo para la enumeración de Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei y Bifidobacterium
animalis en presencia de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus.
LWTFood Sci Technol 42:491–95.
Ludwig W, Schleifer K‐H, Whitman WB. 2009. Lactobacillaceae. En: Vos P, Garrity G, Jones D, Krieg
NR, Ludwig W, Rainey FA (eds). Manual de bacteriología sistemática de Bergey, los firmicutes. Nueva
York: Springer.
McDonald LC, McFeeters RF, Daeschel MA, Fleming HP. 1987. Un medio diferencial para la enumeración
de bacterias del ácido láctico homofermentativas y heterofermentativas. Appl Environ Microbiol 33(6):
págs. 1382–84.
Miranda RO, de Carvalho AF, Nero LA. 2014. Desarrollo deun medio de cultivo selectivo para
bifidobacterias, rafinosa-propionato de litio mupirocina (RP-MUP) y evaluación de su uso con placas
de recuento aeróbico de Petrifilm™. Food Microbiol 39:96–102.
Miranda RO, Gama Neto G, de Freitas R, de Carvalho AF, Nero LA. 2011. Enumeración de bifidobacterias
utilizando Petrifilm™ AC en cultivos puros y en una leche fermentada fabricada con un cultivo
comercial de Streptococcus thermophilus. Food Microbiol 28:1509–13.
Mitsuoka T. 1969. Estudios comparativos sobre bifidobacteriasaisladas del tracto alimentario del hombre y
los animales, incluidas las descripciones de Bifidobacterium thermophilum nov spec y
Bifidobacterium pseudolongum nov. Infektionskr. Hyg Abt 1 Oríg 210:52–64.
Quintiliani R Jr, Courvalin P. Mecanismos de resistencia alos agentes antimicrobianos. 1995. En: Murray
PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH. Manual of clinical microbiology, 6ª edición).
Washington, DC: ASM Press, pp 1319-25.
Ravula RR, Shah NP. 1998. Enumeración selectiva de Lactobacillus casei de yogures y bebidas lácteas
fermentadas. Biotechnol Technol 12:819–822.
Reale A, Di Renzo T, Rossi F, Zotta T, Iacumin L, Preziuso M, Parente E, Sorrentino E, Coppola R. 2015.
Tolerancia de las cepas de Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei y Lactobacillus
rhamnosus a los factores de estrés encontrados en el procesamiento de alimentos y en el tracto
gastrointestinal. LWT ‐ Food Sci Technol 60:721–28.
Reddy MS, Vedamuthu ER, Washam CJ, Reinbold GW. 1972. Medio de agar para la enumeración
diferencial de estreptococos lácticos. Appl Microbiol 24:947–952.
Reid G, Kim SO, Köhler GA. 2006. Seleccionar, probar y comprender los microorganismos probióticos.
FEMS Immunol Med Microbiol 46:149–157.
Ricciardi A, Ianniello RG, Parente E, Zotta T. 2015. Medio modificado químicamente definido para el
crecimiento respiratorio mejorado de los grupos Lactobacillus casei y Lactobacillus
plantarum. J Appl Microbiol 119:776–85.
Roberfroid MB, Van Loo JAE, Gibson GR. 1998. La naturaleza bifidogénica de la inulina de achicoria y
sus productos de hidrólisis. J Nutr 128:11–19.
Sakai T, Oishi K, Asahara T, Takada T, Yuki N, Matsumoto K, Nomoto K, Kushiro A. 2010. Agar M-
RTLV, un nuevo medio selectivo para distinguir Lactobacillus casei y Lactobacillus
paracasei de Lactobacillus rhamnosus. Int J Food Microbiol 139(3), 154–160.
Schillinger U, Holzapflel W H.2011. Medios de cultivo para bacterias del ácido láctico. En: Corry JEL,
Curtis GDW, Baird RM (Eds). Manual de medios de cultivo para microbiología de alimentos y aguas.
Cambridge, Reino Unido: Leatherhead Publishing and RSC publishing, pp 174–92.
Shah NP. 2000. Probiotic bacterias:s elective enumeration and survival in dairy products. J Dairy Sci
83:894–907.
Sims W. 1968. Uso de ácido fusídico para diferenciar lactobacilos homofermentativos de
heterofermentativos. J Dent Res 47:105–107.
Smid EJ, Erkus O, Spus M, Wolkers‐Rooijackers JCM, Alexeeva S, Kleerebezem M. 2014. Implicaciones
funcionales de la estructura de la comunidad microbiana de cultivos iniciadores mesófilos indefinidos.
Fábricas de células microbianas 13(Suppl 1): S2.
Stingele F, Neeser JR, Mollet B. 1996. Identificación y caracterización del grupo de genes eps
(exopolisacáridos) de Streptococcus thermophilus Sfi6. J Bacteriol 178:1680–90.
Süle J, Kõrösi T, Hucker A, Varga L. 2014. Evaluación de medios de cultivo para la enumeración selectiva
de bifidobacterias y bacterias del ácido láctico. Braz J Microbiol 45(3):1023–1030.
Sutula J, Coulthwaite L, Verran J. 2012. Medios de cultivo para el aislamiento diferencial de Lactobacillus
casei Shirota a partir de muestras orales. J Microbiol Meth 90:65–71.
Tabasco R, Paarup T, Janer C, Peláez C, Requena T. 2007. Enumeración selectiva e identificación de
cultivos mixtos de Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, L.
acidophilus, L. paracasei subsp. paracasei y Bifidobacterium lactis en leche fermentada. Int Dairy J
17 :1107–14.
Tharmaraj N, Shah NP. 2003. Enumeración selectiva de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus,
Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, bifidobacterias, Lactobacillus casei,
Lactobacillus rhamnosus, y propionibacteria. J Dairy Sci 86(7):2288–96.
Van de Casteele S, Vanheuverzwijn T, Ruyssen T, Van Assche P, Swings J, Huys G. 2006. Evaluación de
medios de cultivo para la enumeración selectiva de cepas probióticas de lactobacilos y bifidobacterias
en combinación con yogur o entrantes de queso. Int Dairy J 16 :1470–76.
Ventura M, Zink R. 2002. Rápida identificación, diferenciación y propuesta de nueva clasificación
taxonómica de Bifidobacterium lactis. Appl Environ Microbiol 68: 6429–34.
Vinderola C, Reinheimer J. 2000. Enumeración de Lactobacillus casei en presencia de L. acidophilus,
bifidobacterias y bacterias iniciadoras lácticas en productos lácteos fermentados. Int Dairy J 10:271–
75.
Wilkins TD, Chalgren S. 1976. Medio para su uso en pruebas de susceptibilidad a antibióticos de bacterias
anaeróbicas. Agentes antimicrobianos Chemother 10:926–928.
Xie J, Pierce JG, James RC, Okano A, Boger DL. 2011. Una vancomicina rediseñada diseñada para la unión
dual d‐Ala‐d‐Ala y d d‐Ala‐d‐Lac exhibe una potente actividad antimicrobiana contra las bacterias
resistentes a la vancomicina. J Am Chem Soc 133 (35):13946–9.
Zitz U, Kneifel W, Weiss H, Wilrich PT. 2007. Enumeración selectiva de bifidobacterias en productos
lácteos:
Desarrollo de unmétodo de S Tandard. Bull Int Dairy Fed 411:3–20.
8 Identificación de especies y cepas de LAB
Cinzia Randazzo 1, Alessandra Pino1, Koenraad Van
Hoorde2 y Cinzia Caggia1
1Departamento de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente (Di3A), Universidad de Catania, Catania,
Italia
Laboratorio de Elaboración de Cerveza y Bioquímica, Facultad de Ingeniería de Biociencias ,
2
Universidad de Gante, Gante, Bélgica
8.1 INTRODUCCIÓN
La leche se convierte en una gran cantidad de productos lácteos, y su alto contenido de agua y su
valor de pH casi neutro apoyan el crecimiento de una variedad de microorganismos. Ya se han
detectado más de 100 géneros y 400 especies microbianas en la leche cruda (ver revisión Montel et
al., 2014). Se trata tanto de levaduras como de bacterias, principalmente bacterias grampositivas o
negativas halófilas y/o alcalófilas, que pueden tener efectos negativos considerables sobre la calidad
de la leche y los productos lácteos (Cousin, 1982). También pueden ser de relevancia tecnológica,
como las bacterias del ácido láctico (LAB). Las BAL están naturalmente presentes en la leche como
contaminantes de fuentes diversas, tales como: la superficie de la ubre, el equipo de ordeño, el
entorno de la fábrica de productos lácteos, las operaciones de transporte y llenado, las superficies
de almacenamiento (Eneroth et al., 1998; McPhee y Griffiths, 2002). Desde un punto de vista
tecnológico, la mayoría de los estudios se han centrado en la detección e identificación de especies
LAB, que están principalmente implicadas en la formación de textura y sabor de los productos
lácteos. La rápida conversión de la lactosa en ácido láctico, junto con la actividad de sus enzimas
proteolíticas, responsables de la formación de pequeños péptidos y aminoácidos, especialmente en
los quesos, se consideran las principales contribuciones de LAB. Durante siglos, la investigación se
ha centrado en la exploración de la biodiversidad autóctona de LAB de varios nichos lácteos
ecológicos con el fin de abordar su papel en la formación de texturas y sabores y seleccionar cepas
para ser utilizadas como cultivos iniciadores. En este contexto, es muy ú til investigar la
composición microbiana láctea, abordando las preguntas "¿qué microorganisms están presentes" y
"¿qué puede hacer la comunidad"?

8.2 MÉTODOS GENOTÍPICOS DE TOMA DE HUELLAS DACTILARES

Actualmente, se dispone de una amplia gama de técnicas de genética molecular para identificar a
los miembros de la microbiota láctea. Cuando se utilizan en combinación,se denominan enfoque de
identificación polifásica (Vandamme, 1996). La elección del mejor método depende de varios
factores, tales como:
1) el propósito o contexto de la investigación: construir un inventario taxonómico de especies

microbianas presentes en una matriz láctea o monitorear la dinámica durante la producción y /
o almacenamiento, buscar microorganismos con propiedades funcionales y / o tecnológicas
interesantes, seguimiento de fuentes y análisis forense microbiano, control de calidad;
2) el nivel de información taxonómica requerido, que está fuertemente asociado con el propósito
y el contexto: nivel de género, especie o cepa;
3) tiempo disponible: análisis a largo plazo versus análisis en tiempo real;
4) disponibilidad de recursos financieros: estudios a pequeña o gran escala, aplicaciones rentables
o costosas;
5) Lo que Methods son el estado actual de la técnica.
Como resultado del uso de enfoques genotípicos moleculares, nuestro conocimiento sobre la
diversidad de comunidades microbianas de diferente complejidad ha mejorado enormemente.
Muchas de estas técnicas se basan en información de secuenciainferida del gen 16S rRNA, de genes
de mantenimiento y de genomas parciales o completos. Desde que Woese (1987) propuso el
concepto de reconstrucción de la filogenia bacteriana basada en secuencias de ARN ribosómico, la
secuenciación del gen 16S rRNA y, en gran medida, el gen 23S rRNA, se ha utilizado rutinariamente
para la identificación de bacterias, permitiendo la construcción de un marco filogenético para la
taxonomía bacteriana. Por lo tanto, la identificación a través de la secuenciación del gen 16S rRNA
de los diversos miembros que prosperan en la leche y los productos lácteos ha sido ampliamente
utilizada (Delbes et al., 2007; Randazzo y otros, 2010; Van Hoorde, 2010; Caro et al., 2013;
Bautista‐Gallego et al., 2014; Franciosi et al., 2015; Carafa et al., 2015, 2016; Tsafrakidou et al.,
2016). Ahora, gracias a loscontinuos avances y mejoras en las tecnologías de secuenciación, se
utilizan cada vez más enfoques de secuenciación de alto rendimiento utilizando ácidos nucleicos
extraídos directamente de la matriz láctea. Estas técnicas de secuenciación denominadas de segunda
y tercera generación permitieronuna caracterización microbiana más profunda y aumentaron el
número de muestras analizadas (Leite et al., 2012; O'Sullivan et al., 2013; De Pasquale et al., 2014a;
Riquelme et al., 2015).
Este capítulo ofrecerá una visión general de los enfoques dependientes e independientes del
cultivo utilizados para evaluar la composición microbiana de los productos lácteos. Además, se
discutirán los avances recientes en las tecnologías ómicas, utilizadas para comprender la
funcionalidad metabólica y la diversidad de la microbiota láctea. La figura 8.1 muestra un flujode
las técnicas moleculares actuales utilizadas individualmente o en combinación para estudiar la
microbiota láctea.
ECOSISTEMA MICROBIANO LÁCTEO
ANÁLISIS DE LA COMUNIDAD FUNCIONALIDAD DE LA COMUNIDAD
Métodos dependientes de la cultura Métodos independientes de la cultura
Aislamiento de ácidos nucleicos de

Matriz láctea
Plantar, contar,
y aislamiento
Actividad microbiana
Aislamiento de
ADN
Aislamiento de ácidos nucleicos de
Genotípico No genotípico Matriz láctea Sondas de ARN
Huellas digitales Huellas digitales
Métodos basados en PCR

Espectrometría de masas D/TGGE Gen funcional
Restricción del ADN MALDI-TOF MS SSCP expresión
ribotipado FTIR T-RFLP Basado en secuencias RT-qPCR
RFLP ARISA métodos SSH
PFGE LH-PCR Clonar bibliotecas
Amplificación del ADN HTS 16 s basado en rRNA
ARDRA Metagenómica Sondas
RAPD PESCA
REP-PCR DO
ANÁLISIS INDIVIDUAL aísla ANÁLISIS GLOBAL estructura, ACTIVIDAD METABÓLICA
identificación y caracterización diversidad y dinámica de la microbiota microorganismos cultivables y no cultivables
Figura 8.1 Diagrama de flujo de las técnicas moleculares actuales utilizadas individualmente o en combinación para estudiar la
microbiota láctea.
8.3 ENFOQUES DEPENDIENTES DE LA CULTURA
Los productos lácteos generalmente están poblados por una gran variedad de tipos de células,
incluidas células intactas, viables, no viables y parcial o totalmente desintegradas (es decir,
autolizadas) (Carraro et al., 2011), que contribuyen a las características fisicoquímicas y
microbiológicas del producto final. Durante siglos,se han utilizado técnicas dependientes del cultivo
para permitir la identificación bacteriana. Los métodos se basan en el cultivo de los
microorganismos, en medios específicos y en la caracterización fenotípica y/o genotípica de una
fracción de la comunidad (Ward y Roy, 2005; Jany y Barbier, 2008).
8.3.1 Amplificación aleatoria de ADN polimórfico

El ADN polimórfico amplificado aleatorio (RAPD) es una técnica basada en PCR capaz de
discriminar microorganismos en función de la variación genética. RAPD implica el uso de
cebadores sintéticos cortos (generalmente 10 pb) de secuencia aleatoria en una reacción de PCR, lo
que resulta en laamplificación de muchos productos de ADN discretos. Estos oligonucleótidos
sirven como cebadores directos e inversos y generalmente pueden amplificar fragmentos de 1 a 10
sitios genómicos simultáneamente. Los fragmentos amplificados, generalmente dentro del rango de
tamaño de 0.5–5 kb, son separadospor electroforesis en gel de agarosa, y los polimorfismos se
detectan como la presencia o ausencia de bandas de tamaños particulares (Williams et al., 1990;
Hadrys y otros, 1992). RAPD-PCR es una de las técnicas de tipificación más populares aplicadas a
los ecosistemas lácteos. Su uso ha sido documentado en diversos informes que describen y tipifican
la diversidad de ecosistemas queseros y lácteos (Martín‐Platero et al., 2009; Carafa et al., 2015;
Mangia et al., 2016; Tsafrakidou et al., 2016), para monitorear la dinámica de cepas específicasa lo
largo de la maduración del queso (Bove et al., 2011; Feligini et al., 2012; Pogačić et al., 2013; Silva
et al., 2015) y/o como herramienta para la caracterización de aislados lácteos con características
específicas de cepas como propiedades tecnológicas, propiedades proteolíticas, producción de ácido
γ-aminobutírico (GABA), producción de antimicrobianos o susceptibilidad a antibióticos, en vista
de una posible aplicación futura en el desarrollo de nuevos cultivos iniciadores o adjuntos (Morandi
y Brasca, 2012; Baruzzi et al., 2012; Franciosi et al., 2015; Carafa et al., 2016). En el queso Pecorino
di Filiano DOP (Denominación de Origen Protegida), un queso tradicional de leche de oveja del sur
de Italia, el recuento en placa en combinación con RAPD-PCR y el análisis de restricción de ADN
ribosómico amplificado (ARDRA) permitieron la identificación de Lactobacillus paracasei subsp.
paracasei como especie dominante durante el proceso de maduración (Bonomo y Salzano, 2012).
Resultados similares fueron mostrados por Tsafrakidou y colaboradores (2016), demostrando el
predominio de L. paracasei, seguido de Lactobacillus brevis, en Graviera Kritis DOP, un queso
griego duro hecho de leche de oveja (Tsafrakidou et al., 2016). Además, aplicando el enfoque
RAPD-PCR, fue posible detectar Lactococcus lactis subsp. lactis dominance tanto en queso
Casizolu pasta hilata, elaborado con leche cruda de vaca (Mangia et al., 2016), como en quesos
frescos y maduros Feta DOP, elaborados con leche ovina y con una mezcla de leches ovina y caprina
(Bozoudi et al., 2016). Además, algunos informes incluyeron el uso del análisis RAPD-PCR,
combinado con otras técnicas moleculares, para determinar la ocurrencia y la biodiversidad
genotípica de Geotricum candidum en el queso Armada (Sacristán et al., 2013) y para proporcionar
una imagen completa de la alta biodiversidad, a nivel genéticoy fenotípico, entre la población de
Kluyveromyces marxianus, aislada de Pecorino di Farindola (Tofalo et al., 2014).
Identificación de especies y cepas de LAB 143
8.3.2 ARDRA y RFLP

Además de susaplicaciones de idespread en enfoques basados en secuencias, los genes
ribosómicos también se pueden usar como objetivos genómicos para métodos de
huellas dactilares de ADN, como el ribotipado y el análisis de restricción de ADNr
amplificado (ARDRA). Ambas técnicas pueden considerarse como una variación del
análisis convencional de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP).
El análisis RFLP es una herramienta de creación de perfiles basada en los patrones de
bandas obtenidos de los resúmenes genómicos o de restricción de ARNr. El elemento
crucial de esta técnica es la selección correcta de las enzimas de restricción, ya que el
uso de enzimas de corte raras reduce el número de fragmentos de ADN obtenidos
(McCartney, 2002). De hecho, la huella digital de ADN generada depende tanto de la
especificidad de las enzimas de restricción utilizadas como de la secuencia delgenoma
corporal que es característica de cada especie o cepa bacteriana. Cuando la región
objetivo (leída como amplificada y digerida) corresponde al ADN ribosómico, esta
variante RFPL se conoce como ARDRA. Sin embargo, ARDRA sólo tiene un poder
discriminativo limitado cercano al nivel de género-especie (Marilley y Casey, 2004).
La resolución de esta técnica, sin embargo, depende y puede ser influenciada por la
elección de la endonucleasa de restricción utilizada y puede aumentarse utilizando
múltiples enzimas de restricción por separado o en combinación (Justé et al., 2008).
Además, la elección de las endonucleasas puede adaptarse en vista del grupo
taxonómico en estudio.
Recientemente, ARDRA, utilizando enzimas de restricción TaqI y HaeIII, se aplicó
para identificar las especies de Lactobacillus de quesos Dalameh y yogur producidos
en Irán. Los resultados mostraron el predominio de cepas pertenecientes a
Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus acidophilus, L. brevis y Lactobacillus
delbrueckii subsp. lactis (Ghafari et al., 2014). El mismo enfoque, basado en el análisis
de secuencia de ADNr 16S, se aplicó para caracterizar la población de LAB aislada del
queso Konya Kuflu maduro, un queso azul tradicional de pavo producido a partir de
leche cruda sin adición de cultivo iniciador (Guley et al., 2014). Además, Khemariya y
colaboradores (2013) demostraron que el ensayo de PCR-RFLP podría usarse
rutinariamente para la identificación de subespecies de L. lactis a partir de productos
lácteos basados en amplicones dirigidos a los genes yueF y htrA sujetos a restricción
por las enzimas Alu I y TaqI, respectivamente. Del mismo modo, Jans y colaboradores
(2012b) desarrollaron un ARDRA específico para el complejo Streptococcus bovis /
Streptococcus equinus, dirigido al gen 16S rRNA basado en PCR múltiple seguido de
RFLP utilizando enzimas de restricción Mse I y Xba I.
Unenfoque ARDRA, utilizando la digestión Hha I y Mse I, fue parte de un estudio
polifásico para inventariar la comunidad de bacterias del ácido láctico no iniciadoras
(NSLAB) presentes en el queso Parmigiano Reggiano madurado (Solieri, 2012),
mientras que Blasco y sus colaboradores utilizaron con éxitoun ARDRA basado en
HaeIII y AluI para la designación de especies de 107 cepas pertenecientes al género
lácteo Propionibacterium (Blasco, 2015).
8.3.3 Ribotipado
El ribotipado es una variación del RFLP convencional y permite la generación de un
patrón menos complejo ya que el ADN genómico se digiere enzimáticamente, y los
fragmentos resultantes se transfieren posteriormente a una membrana y se hibridan con
una sonda de ADNr. Las túnicas p utilizadas en el ribotipadovarían desde secuencias
parciales de los genes de ADN o de sus regiones espaciadoras hasta el operón de ADNr
completo, que podría usarse como sonda en un Southern blot clásico de varios pasos o
en ribotipado automatizado. Si la sonda contiene regiones d conservadas de ADNr, se
puede utilizar para el ribotipado de una amplia gama de bacterias, incluso
filogenéticamente distantes. Evidentemente, más fragmentos se hibridarán con sondas
que abarcan una gran región del operón de ADNr que con una sonda más corta. Por lo
tanto, elpoder discriminatorio de la técnica no sólo depende del tamaño de la sonda,
sino también de la(s) enzima(s) de restricción utilizada(s) (Randazzo et al., 2009). Caro
y sus colaboradores caracterizaron los aislados de LAB de un queso de leche cruda
utilizando solo una endonucleasa EcoRI y unasola sonda. Recientemente, Mormile y
sus colaboradores (2016) utilizaron ribotipado para identificar 169 LAB aislados del
queso artesanal Pecorino di Tremonti. La técnica permitió agrupar los aislados en las
siguientes especies: Enterococcus faecium, Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp.
cremoris, Enterococcus faecalis y Enterococcus durans. Una combinación de RFLP y
ribotipado permitió la discriminación entre las cepas de Lactobacillus helveticus,
según el queso del que fueron aisladas (Giraffa et al., 2000). Sin embargo, es importante
recordar que siempre que se quiera utilizar la información dentro del ADN ribosómico,
tales enfoques pueden fallar en la discriminación filogenéticamente de especies o
subespecies estrechamente relacionadas (Felis y Dellaglio, 2007) y, como se mencionó
anteriormente,ciertamente no permiten el enfoque a nivel de cepa. Existen alternativas
que proporcionan una mejor discriminación de especies estrechamente relacionadas que
comparten secuencias de genes de ARNr muy similares, si no idénticas; Algunos de
estos métodos de huellas dactilares de alta resolución permiten observar más de cerca
el nivel de tensión cuando sea necesario.
8.3.4 PCR basada en secuencias de elementos repetitivos

La PCR basada en secuencias de elementos repetitivos (rep-PCR) es un método de
tipificación que aprovecha la presencia de elementos extragénicos cortos
intercalados(por ejemplo, secuencias REP, ERIC, (GTG) 5 y BOX) que se encuentran
repetidamente en todo el cromosoma bacteriano. La PCR con cebadores dirigidos a
estos elementos repetitivos genera perfiles específicos que pueden usarse para
discriminar hasta el nivel de deformación (Versalovic et al., 1994). El método de rep-
PCR utiliza cebadores que se hibridan a secuencias no codificantes dispersas por todo
el genoma. El ADN entre elementos repetitivos adyacentes se amplifica mediante PCR,
y se pueden producir múltiples amplicones. Los amplicones se caracterizan por
electroforesis, y los patrones de bandas se comparan para determinar la relación
genética entre los aislados bacterianos analizados.
La rep-PCR demostró ser útil para la diferenciación rápida y confiable en especies,

subespecies y, potencialmente, nivel de cepa de lactobacilos y otras BAL asociadas con
la producción de diferentes tipos de quesos (Van Hoorde et al., 2008b, 2010; Bove y
otros, 2011; Baruzzi et al., 2012; Solieri et al., 2012; Bautista‐Gallego et al., 2014; Perin
et al., 2015; Mangia et al., 2016) y otros productos lácteos (Kesmen y Kacmaz, 2011;
Jans et al., 2012a; Akabanda et al., 2013; Tormo et al., 2015). En particular,
TerzićVidojević et al. (2015) utilizaron la REP-PCR combinada con la secuenciación
del ADNr 16S, subrayando el predominio de las especies Leuconostoc
pseudomesenteroides y Lc. lactis en la leche cruda de cabra Vlasina de 5 días de edad.
Las especies Lactobacillus plantarum, E. durans y Pediococcus pentosaceus fueron
dominantes en el mismo queso después de 15 días de maduración (Terzic‐Vidojevic et
al., 2015). Recientemente, se aplicó REP-PCR para caracterizar la población de BAL
en queso Karish egipcio y Laban Zeer, un milk fermentado tradicional, mostrando el
predominio de Lc. lactis subsp. lactis, L. delbrueckii subsp. lactis y especies de E.
feacium (Awad, 2016).
8.3.5 Polimorfismo de longitud de fragmento amplificado

El polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLP) combina la
amplificación por PCR con un resumen de restricción DNA anterior mediante el cual
los fragmentos de restricción se ligan a adaptadores de doble cadena que proporcionan
los sitios de recocido para los cebadores. Después de la PCR, los fragmentos resultantes
se analizan mediante electroforesis, generando huellas dactilares con un poder minador
altamente discreto. AFLP ha demostrado ser una técnica de huellas dactilares de alta
resolución para la identificación intraespecie y para el genotipado de LAB y
bifidobacterias de diversos productos fermentados, así como de la biota gastrointestinal
humana (Ben Amor et al., 2007). Aunque no se emplea con frecuencia en combinación
con productos lácteos, AFLP se utilizó en combinación con (GTG)5-PCR para
monitorear la persistencia de LAB durante la maduración de quesos artesanales tipo
Gouda (Van Hoorde et al., 2008a). Curiosamente, el AFLP obtuvoun mejor rendimiento
en comparación con el RAPD para evaluar la diversidad genotípica entre diferentes
cepas de la misma especie, como se demostró para Streptococcus thermophilus (Lazzi
et al., 2009) y para L. plantarum (Di Cagno et al., 2010).
8.3.6 Electroforesis en gel de campo pulsado

Al igual que la rep-PCR y RAPD, la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE)
analiza el genoma completo y, por lo tanto, tiene un alto poder discriminatorio. Sin
embargo, PFGE es una técnica muy laboriosa y lenta, ya que implica la digestión del
ADN genómico con una endonucleasa de corte estadísticamente rara que genera
grandes fragmentos de ADN. Estos fragmentos de ADN se separan en un campo
eléctrico con pulsos que cambian de dirección. Como resultado, se puede estudiar un
número limitado de muestras, lo que hace que PFGE sea una herramienta de
identificación menos adecuada, por ejemplo, para campañas de aislamiento a gran
escala con un objetivo taxonómico descriptivo. Por otro lado, como este método es
altamente discriminatorio, PFGE es un método poderoso para la tipificación de cepas
de aislados lácteos (Blasco et al., 2015; Tsafrakidou et al., 2016), y a menudo es el
método de elección para las aplicaciones de seguimiento de fuentes (Freitas et al., 2015;
Terzić‐Vidojević et al., 2015; Acciari et al., 2016). Usando una combinación de RAPD
y PFGE, Coppola y sus colaboradores (2006) pudieronrecuperar la mayoría de los
aislados, desde el queso maduro para pasta hilada hasta la leche cruda.
Cada método tiene sus puntos fuertes y sus limitaciones. Por lo tanto, para tratar de
eludir parcialmente los inconvenientes inherentes, a menudo se combinan dos o más
técnicas para beneficiarse al máximo de cada uno de los métodos utilizados. Siempre
que la información de múltiples enfoques, tanto fenotípicos como genotípicos, se
integra para una diferenciación, identificación y clasificación más robustas, esto se
denomina "estrategia de taxonomía polifásica" (Vandamme et al., 1996). En la mayoría
de los estudios antes mencionados, se implementó dicha estrategia polifásica.
8.4 MÉTODOS DE HUELLAS DACTILARES NO GENOTÍPICAS
Posiblemente los nuevos avances en ecología microbiana también pueden dar una
respuesta adicional a los problemas antes mencionados. Una técnicaque surgió
recientemente en el campo de la microbiología es la espectrometría de masas de tiempo
de vuelo por ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS).
MALDI-TOF MS es un enfoque proteómico que genera huellas dactilares que
representan las masas moleculares depéptidos y proteínas pequeñas. Como estas
proteínas confieren información genética, los perfiles se consideran adecuados para
fines de identificación. Es un método de ionización suave, y los iones generados se
separan y detectan de acuerdo con su masa molecular y carga, generalmente una carga
única positiva . Su alta sensibilidad y alto rendimiento lo han convertido en un método
muy interesante para la caracterización e identificación de (gran número de) aislados
microbianos. Para obtener los extractos celulares proteicos fo análisis, en general se
pueden utilizar tres enfoques: el método más corto se basa en la aplicación directa de
material celular como una capa delgada en la placa objetivo (es decir, el método de
frotis directo); posteriormente, la muestra se seca y se cubre con la matriz antes de ser
analizada. Algo más elaborada es la extracción en el objetivo en la que se agrega ácido
fórmico al frotis celular para mejorar la extracción de proteínas. La tercera opción
consiste en realizar una extracción de etanol-ácido fórmico-acetonitrilo y, a
continuación, después de la centrifugación, se aplica 1 μl de sobrenadantes sobre la
placa objetivo, se deja secar y se cubre con matriz antes del análisis. La naturaleza del
analito determina el tipo de matriz utilizada: para fines de identificación microbiana
que dependen de proteínas, generalmente se utiliza ácido α-ciano-4-hidroxicinámico
(CHCA) y, con menor frecuencia, ácido sinapínico (SA). Mientras que el uso de
MALDI‐TOF MS se limitó inicialmente a un contexto de microbiología clínica
(Carbonnelle et al., 2011), cada vez con más frecuencia se está explotando MALDI‐
TOF MS para la caracterización de microorganismos de origen alimentario en general
y lácteos en particular, aunque su uso sigue siendo limitado (Pavlovic et al., 2013).
Utilizando la huella digital MALDI-TOF MS, Dušková et al. (2012) identificaron con
éxito el 93% de las 148 BAL aisladas de diversas fuentes de alimentos (carne y lácteos).
Esta tasa de éxito fue notablemente mayor en comparación con ARDRA, para la cual
solo el 77% de los aislamientos se identificaron sin ambigüedades. Varios estudios
utilizaron MALDI‐TOF MS para caracterizar microorganismos de espo ilage de
cerveza(Wieme et al., 2014a; Turvey et al., 2016), y MALDI-TOF MS se utilizó para
evaluar la biodiversidad de consorcios microbianos psicrotróficos en leche cruda
(Vithanage et al., 2014; 2016) e identificar especies de Enterococcus y Escherichia coli
recuperadas del queso Bryndza (Vrabec et al., 2015). Al igual que con la mayoría de
las estrategias de huellas dactilares, un enfoque basado en la biblioteca que contiene
espectros de tipo conocido y bacterias de referencia para identificar incógnitas es el más
común. Sin embargo, además, también es posibleidentificar una especie dada a través
de biomarcadores únicos (es decir, picos de masa con una cierta relación m/z en el
espectro MS), y con esto, ventajas importantes son la simplicidad comparativa de los
espectros de masas y la alta reproducibilidad de la técnica (Sauer et al., 2008). De esta
manera, Fernández-No y colaboradores (2010) pudieron diferenciar inequívocamente
entre 16 bacterias entéricas y marinas productoras de aminas biogénicas a través de la
asignación de picos específicos de marcadores de proteínas. Del mismo modo, los
aislados de dos subspecies del microorganismo probiótico Bifidobacterium animalis,
subsp. lactis y subsp. animalis, podría ser discriminado en base a picos específicos
(Ruiz‐Moyano et al., 2012). Esto abre perspectivas hacia una descripción e
identificación más precisas de los diferentes miembros de una comunidad hasta el nivel
de cepa a través de la generación de espectros de MALDI-TOF MS específicos de la
cepa, ya sea en combinación o no con picos de biomarcadores específicos de la cepa
(Sandrin et al., 2013). Sin embargo, el potencial de MALDI‐TOF MS para clasificar
más allá del nivel de subespecie sigue siendo un tema de debate, con algunos estudios
a favor (Kern et al., 2014; Wieme et al., 2014b) y otros que han encontrado las
limitaciones taxonómicas a menudo dependientes de taxones (Ghyselinck et al., 2011)
del t echnique (Zeller‐Péronnet et al., 2013).
Otra técnica no nueva (con los primeros proyectos que datan de hace 20 a 30 años)
(Naumann et al., 1991) pero hoy en día emergente en el campo de la microbiología, es
la espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR). Mientras que MALDI-
TOF MS registra simplemente un espectro de masas con contenido de proteínas de
células bacterianas completas, la espectroscopia FTIR genera huellas bioquímicas
generales: la absorbancia de la luz infrarroja (IR) por los compuestos celulares de las
células da como resultado un espectro similar a una huella digital que contiene señales
de muchos grupos funcionales y biomoléculas diferentes, incluidos lípidos, proteínas,
carbohidratos, ácidos nucleicos e incluso agua. Al igual que MALDI-TOF MS, es una
técnica rápida y sencilla que ofrece una identificación confiable a nivel de género,
especie, incluso hasta cepa (Wenning et al., 2014). En un estudio de 2015, por ejemplo,
von Neubeck y sus colegas pudieron asignar 2906 aislados de leche cruda a 169
especies de 61 géneros utilizando espectroscopia FTIR (von Neubeck et al., 2015).
Aunqueestos métodos han sido optimizados para detectar y cuantificar

microorganismos relevantes, presentan una menor cobertura de diversidad que los
métodos independientes del cultivo. Además, se sabe que las técnicas convencionales
están sesgadas porque las bacterias solo pueden cultivarse si sus necesidades
metabólicas y fisiológicas pueden reproducirse in vitro (Ndoye et al., 2011). Las
técnicas dependientes del cultivo utilizadas actualmente para la caracterización de la
microbiota de los productos lácteos se presentan en la figura 8.1.
8.5 ENFOQUES INDEPENDIENTES DE LA CULTURA

Los desarrollos de métodos moleculares que permiten la identificación de microbios
que son difíciles o imposibles de cultivar en los medios han revolucionado nuestro
conocimiento sobre la ecología microbiana de los productos lácteos. Este cambio hacia
el uso de metods independientes del cultivoque ya no requieren un paso de cultivo ha
facilitado el estudio simultáneo de microorganismos viables, no cultivables y estresados
/ lesionados. De hecho, su aplicación a la matriz láctea ha ayudado a dar una visión
significativa de aislados específicos, poblaciones microbianas y de la evolución y la
naturaleza de los grupos microbianos en estos ecosistemas (Bonaïti et al., 2006).
Además, los métodos independientes de la cultura tienden a ser más rápidos, sensibles
y menos susceptibles al sesgo que los que dependen de la cultura.
8.5.1 Métodos independientes del cultivo para el análisis cualitativo de la

microbiota de los productos lácteos
El análisis cualitativo de la microbiota de los productos lácteos para estudiar la
diversidad y dinámica microbiana se puede realizar aplicando herramientas basadas en
PCR, como la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (PCR-DGGE), la
electroforesis en gel de gradiente de temperatura (PCR-TTGE), el polimorfismo de
conformación de cadena simple PCR (SSCP-PCR), el polimorfismo de longitud de
fragmento de restricción terminal (T-RFLP), la PCR DE HETEROGENEIDAD DE
LONGITUD (LH-PCR) y el riboso automatizado técnicas de análisis de espaciadores
intergénicos (ARISA) (Ndoye et al., 2011). Otras técnicas de huellas dactilares
comunitarias utilizadas en la microbiología de los productos lácteos incluyen la
desnaturalización de la cromatografía líquida de alto rendimiento (DHPLC) (Ercolini
et al., 2008; Mounier y otros, 2010; Delavenne et al., 2011) y análisis de restricción de
ADN ribosómico amplificado (ARDRA) (Singh et al., 2009). Además, cuando se
encuentra un interés particular en perfilar a los miembros de la comunidad
metabólicamente activos, se puede realizar un análisis en el ARN transcrito
inversamente (RT), por ejemplo, RT-PCR-DGGE, RT-PCR-SSCP y LH-RT-PCR.
DGGE y el método relacionado TGGE son los enfoques de huellas dactilares
comunitarias más utilizados para estudiar la población microbiana en productos lácteos.
Desde su primer uso en la investigación de ecología microbiana a principios de la
década de 1990 (Muyzer et al., 1993), DGGE y TGGE unanálisis de genes
codificadores de ARNr amplificados por PCR se han aplicado ampliamente para
identificar las poblaciones microbianas dominantes y para mostrar la diversidad y la
estructura de la comunidad microbiana presente sin conocimiento previo de su
composición. DGGE y TGGE consisten en una separación electroforética de productos
de PCR en un gel de poliacrilamida que contiene un gradiente de desnaturalizantes

químicos (urea y formamida en DGGE) o físicos (temperatura en TGGE). A medida
que la molécula de ADN migra a través del gradiente desnaturalizante, se produce una
desnaturalización parcial dependiente de la secuencia de la doble cadena (Muyzer et al.,
1993). Aunque DGGE y TGGE no son técnicas cuantitativas, su aplicación permite
mostrar y monitorear los cambios espaciales/temporales que ocurren durante la
producción y almacenamiento de productos lácteos(Cocolin et al., 2013). Además,
también se ha realizado la transcripción inversa (RT)‐PCR‐DGGE para obtener una
imagen de la especie metabólicamente activa en un momento de muestreo particular
(Dolci et al., 2013; Alessandria et al., 2016). Los métodos DGGE y TGGE, junto con
el cultivo y/o la secuenciación, se han aplicado con éxito a varios tipos de queso y
productos lácteos (Leite et al., 2012; Delgado et al., 2013; Arcuri y otros, 2013; Quero
et al., 2014; TerzićVidojević et al., 2015; Chombo‐Morales et al., 2016; Carpino et al.,
2017). Recientemente, se desarrolló un nuevo método independiente del cultivo basado
en PCR-DGGE, con el fin de detectar e identificar, a nivel de especie, las bacterias
histaminogénicas presentes en el queso. Se diseñaron cebadores específicosbasados en
las secuencias de genes hdcA disponibles para bacterias Gram positivas, y se
optimizaron PCR y DGGE para diferenciar amplicones que corresponden a diferentes
especies productoras de histamina (Diaz et al., 2016).
SSCP es un método independiente del cultivo similar aPCR-D/TGGE ya que permite
la separación de diferentes fragmentos de ADN de longitud similar, también se basa en
la separación electroforética debido a la variación dependiente de la secuencia en la
velocidad de migración de los productos de PCR. SSCP se ha aplicado para analizar
mutaciones odinámica entre poblaciones microbianas a nivel de género y especie en
queso (Callon et al., 2006; Delbes y otros, 2007; Saubusse y otros, 2007; Mounier y
otros, 2009). El principio de SSCP es que la movilidad de un fragmento de ADN
monocatenario, en un gel de lacrilamida pol, depende de la conformación del ADN
(Orita et al., 1989; Hayashi, 1991). Un perfil SSCP típico consiste en dos fragmentos
de ADN monocatenario y un fragmento de ADN bicatenario, aunque también son
posibles diferentes conformaciones de una hebra. Con respecto al queso, el SSCP no se
ha empleado ampliamente. Sofu y Ekinc (2016) utilizaron PCR-SSCP combinada con
PCR-DGGE para perfilar la diversidad y la dinámica de la comunidad de leche y queso
Ezine, revelando el predominio de L. lactis y S. thermophilus spp.
Recientemente, Hermet y sus colaboradores (2014) han desarrollado un método
basado en el análisis de electroforesis capilar CE-SSCP de amplicones ITS de ADN
ribosómico nuclear (conformadores ITS1 e ITS2) para determinar la composición de la
comunidad fúngica de 36 quesos, incluidosquesos maduros con vetas azules, prensados,
cocidos, prensados, sin cocer, con manchas rojas y con moho superficial. El método ha
demostrado ser reproducible y sensible. Puede considerarse una herramienta eficaz para
identificar los hongos presentes en varios tipos de queso y puede ser de interés para la
industria del queso describir rápidamente la composición de las comunidades fúngicas
del queso (Hermet et al., 2014). En cuanto a DGGE, TGGE y TTGE, SSCP también
proporciona huellas dactilares comunitarias que no pueden asignarse filogenéticamente
directamente. Debe crearse una base de datos que contenga el perfil de migración de las
cepas de referencia. Una desventaja de la técnica SSCP, en contraste con DGGE, es que
los fragmentos de ADN de cadena única marcados no pueden ser secuenciados para
confirmar las designaciones de especies derivadas de la base de datos.
El polimorfismo de longitud de fragmento de restricción terminal (T-RFLP) es un
enfoque molecular rápido y sensible con una alta resolución y capacidad para evaluar
diferencias genéticas sutiles entre cepas, proporcionando una visión más profunda de la
estructura delas comunidades microbianas. La técnica combina la amplificación
selectiva por PCR de genes diana con digestión enzimática de restricción, electroforesis
de alta resolución y detección fluorescente. El uso de un cebador marcado con
fluorescencia restringe el análisis únicamente al fragmento terminal. T-RFLP se utiliza
cada vez más para analizar comunidades microbianas debido a su simplicidad y
fiabilidad para los genes 16S rRNA bacterianos (Schütte et al., 2008; Arteau et al.,
2010; Rasolofo et al., 2011). Además, se ha convertido en un método valioso para
comparar ociosamente los cambios temporales y las relaciones de las comunidades
bacterianas, así como para revelar las secuencias microbianas más dominantes en
muestras lecheras (Ndoye et al., 2011). Fuka y colaboradores (2013) aplicaron T-RFLP
y 454 pirosecuenciación de amplicones marcados del gen 16S rRNA marcados para
obtener una visión completa de la estructura de la comunidad bacteriana de los quesos
croatas de leche cruda de oveja.
La PCR de heterogeneidad de longitud (PCR-LH) es un método de toma de huellas
dactilares capaz de estudiar la diversidad microbiana, asociada a un ecosistema
particular, basada en las variaciones en la longitud de las secuencias del gen 16S rRNA
u otros genes (Giraffa y Neviani, 2001). La LH-PCR se realiza utilizando un
oligonucleótido marcado con colorante fluorescente como cebador directo junto con un
prímero inverso no marcadopara amplificar las regiones hipervariables. Los fragmentos
marcados se separan posteriormente y la fluorescencia se detecta con un secuenciador
automatizado. La LH-PCR es capaz de discriminar amplicones originarios de diferentes
organismos en función de la variación natural en las longitudes de sus regiones diana
de ADN . Se ha demostrado que este método es fácil, rápido, confiable y altamente
reproducible (Quigley et al., 2011). Se utilizó para explorar la estructura y la dinámica
de la microbiobio ta del queso Grana Padano DOP, así como para evaluar la tendencia
de la dinámica microbiana de
LABs durante todo el proceso de elaboración del queso (Pogačić et al., 2013; Santarelli
et al., 2013). Recientemente, Lazzi y colaboradores (2016) aplicaron el mismo enfoque
para estudiar la relación entre la dinámica de crecimiento ylisis de LAB en queso Grana
Padano y su vínculo con la formación de compuestos de sabor volátiles durante el
tiempo de maduración.
El análisis automatizado de espaciadores intergénicos ribosómicos (ARISA),
introducido por Fisher y Triplett (1999), es un método comúnmente utilizado para el
análisis de comunidades microbianas. Sobre la base de la heterogeneidad de longitud
del operón de ARNr bacteriano 16S-23S espaciador intergénico, ARISA proporciona
estimaciones de la riqueza y diversidad microbiana. Este método se ha utilizado con
frecuencia para estudiar una variedad de hábitats, incluidos los productos lácteos,
convirtiéndose en una herramienta muy útil para comparar la estructura de la
comunidad a través de múltiples muestras basadas en perfiles de patrones. Además, el
enfoque ARISA presenta perspectivas importantes en términos de aplicabilidad a lo
largo de toda la cadena de producción láctea con fines de diagnóstico, así como para la
evaluación de la calidad microbiológica de la leche (Feligini et al., 2014). Se utilizó un
enfoque de perfil basado en ARISA, asociado a T-RFLP, en combinación con el
componente principal de la lisis anal para evaluar los cambios fúngicos en el queso
Camembert, de acuerdo con los parámetros del proceso (Arteau et al., 2010). Este
enfoque fue lo suficientemente sensible como para detectar diferencias en las
poblaciones de hongos entre lotes y tipos de queso (Camembert y Brie). Además,
Porcellato y colaboradores (2014) evaluaron la aplicación de ARISA como método de
cribado para estudiar la microbiota del queso y evaluar la dinámica microbiana en
quesos cheddar que difieren en tipo y nivel de catión salado. Los resultados indicaron
que ARISA es una técnica útil para el análisis de la ecología microbiana del queso y,
debido a su alta resolución y similitud con otros métodos moleculares utilizados para
estudios comunitarios, puede utilizarse como método de cribado para estudiar un gran
número de muestras. Los mismos autores también determinaron la dinámica de la
microbiota durante el tiempo de maduración de los quesos cheddar aplicando el LAB-
ARISA. Los resultados de ARISA indicaron que los lactobacilos primarios presentes
en la matriz del queso durante la maduración fueron L. helveticus y Lactobacillus
curvatus. Una aplicación original de ARISA fue desarrollada por Panelli y
colaboradores (2013). De hecho, basándose en un conjunto de cebadores específicos de
múltiples especies, fue posible mostrar simultáneamente huellas dactilares distintivas
diagnósticas para Clostridium tyrobutyricum y para las otras especies asociadas hasta
ahora con el soplado tardío en el queso Grana Padano DOP. Además, se diseñó y utilizó
un conjunto de imprimaciones específicas de especies para el ARISA con el fin de
diagnosticar la presencia de C. tyrobutyricum en la producción de leche cruda antes de
la fabricación de queso (Panelli et al., 2013).
La diversidad bacteriana también puede evaluarse mediante la secuenciación de
bibliotecas de clones generadas a partir de la amplificación del gen 16S rRNA del ADN
extraído de productos lácteos (Rasolofo et al., 2010; Schornsteiner et al., 2014; Carafa
et al., 2015; Avnİ Kırmacı et al., 2015). A pesar del progreso realizado en el campo de
la secuenciación de alto rendimiento, este enfoque es costoso y requiere mucho tiempo.
Además, las bibliotecas de clones a menudo se construyen en un enfoque paralelo para
complementar las técnicas de fingerprin tingcomo DGGE, T-RFLP o SSCP.
8.5.2 Métodos independientes del cultivo para el análisis cuantitativo de la

microbiota de los productos lácteos
Para obtener información cuantitativa de miembros específicos de la comunidad, se
pueden aplicar herramientas basadas en PCR como PCR cuantitativa (qPCR) yPCR
cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR). La técnica de qPCR se utiliza
especialmente en estudios de ADN, mientras que RTqPCR se dedica al estudio de genes
específicos expresados (ARNm).
La tecnología qPCR se basa en la detección y cuantificación de una señal
fluorescente producida por colorantes intercalantes no específicos, como el verde
SYBR, o sondas específicas de secuencia, como balizas moleculares y sondas TaqMan.
La intensidad de la señal fluorescente está vinculada a la cantidad inicial de ADN. La
qPCR es una herramienta útil para la detección, identificación y cuantificación efectivas

de bacterias en diferentes tipos de muestras o productos. Además, esta técnica no
requiere grandes cantidades de muestra (Postollec et al., 2011). El enfoque de qPCR se
ha utilizadopara cuantificar diferentes especies microbianas en productos lácteos como
S. thermophilus, en muestras comerciales de yogur (Ongol et al., 2009),
Propionibacterium freudenreichii, L. paracasei, S. thermophilus, L. helveticus
(Falentin et al., 2010; 2012) en queso Emmental experimental; Enterococcus gilvus
en quesos artesanales de leche cruda (Zago et al., 2009); E. faecium, en quesos
libaneses de leche cruda de cabra (Serhan et al., 2009); S. aureus genotipo B en leche
(Boss et al., 2011); Brucella spp. en leche de búfala (Amoroso et al., 2011); Penicillium
roqueforti y Penicillium camemberti en quesos modelo y comerciales tipo Camembert
(Le Dréan et al., 2010 ); y microbiota fúngica en quesos de corteza floreciente, como
el Camembert (Lessard et al., 2012).
La falta de diferenciación entre el ADN de las células bacterianas viables y no viables
es una barrera significativa para el uso de qPCR (Nocker et al., 2006) que puede
resolverse eliminando la amplificación del ADN de las células muertas, por ejemplo,
mediante la formación de complejos con agentes como el propidium monoazide. En
este contexto, la RT-qPCR es capaz de superar las limitaciones anteriores, ya que se
dirige a las moléculas de ARN que caracterizan los microorganismos y las actividades
metabólicas. Los experimentos de RT-qPCR implican los siguientes pasos: extracción
de ARN, evaluación de la integridad del ARN, tratamiento con DNase, transcripción
inversa y qPCR (Nolan et al., 2006; Bustin et al., 2009). Hasta ahora, la RT-qPCR se
ha aplicado a productos lácteos principalmente con el objetivo de detectar, cuantificar
y estudiar el crecimiento y la actividad metabólica de especies microbianas específicas
(Rantsiou et al., 2008; Falentin y otros, 2010; Duquenne et al., 2010; Ruggirello et al.,
2014).
8.6 NUEVAS TÉCNICAS DE ALTO RENDIMIENTO: SECUENCIACIÓN Y

METAGENÓMICA
La secuenciación de alto rendimiento (HTS) y la metagenómica representan avances
recientes en el estudio de la ecología microbianay se aplican ampliamente para estudiar
la composición de la microbiota alimentaria y para monitorear la dinámica microbiana
durante la producción y el almacenamiento de alimentos. Desde su llegada a mediados
de la década de 2000, HTS ha revolucionado el campo de la ecología microbiana,
permitiendo una identificación más precisa de los taxones microbianos, incluidos
aquellos que son difíciles de cultivar y / o están presentes en baja abundancia (Sogin et
al., 2006). HTS presenta una mayor sensibilidad en comparación con los métodos
tradicionales independientes del cultivo y, aunquedepende de la PCR, la HTS basada
en amplicones se considera cuantitativa. Dependiendo del nivel deseado de cobertura
de muestras, se pueden secuenciar muchas muestras de alimentos al mismo tiempo, y
se puede lograr una identificación confiable de la mayoría de los microorganismos, en
las materias primas y durante laproducción / almacenamiento de alimentos. Además,
cuando los microbiomas se estudian mediante la secuenciación de bibliotecas de
escopeta, se pueden obtener información sobre las actividades microbianas a partir de

las secuencias de genes microbianos presentes en la muestra de alimentos, lo que ofrece
avances importantes en el estudio de laecología microbiana de los alimentos (Ercolini,
2013; De Filippis et al., 2016). Los alimentos lácteos y la leche fermentada se estudiaron
ampliamente a través de HTS para monitorear el proceso fermentativo y la dinámica de
la microbiota durante la producción y el envejecimiento y explorar la distribución
espacial de microorganismos en diferentes partes de la misma muestra (Nalbantoglu et
al., 2014; De Filippis et al., 2014; De Pasquale y otros, 2014a, 2014b; Dolci et al., 2014;
Wolfe et al., 2014; Riquelme et al., 2014; Sun et al., 2014; Delcenserie et al., 2014,
2016; Liu y otros, 2015a, 2015b; Garofalo et al., 2015; Stellato et al., 2015; Guidone et
al., 2015; Calasso et al., 2016).
En estudios metagenómicos o metatranscriptómicos, se secuencia el ADN total o
ADNc, sin necesidad dePCR, evitando la posibilidad de sesgos de amplificación. De
esta manera, se puede obtener una imagen de toda la comunidad microbiana, rastreando
y comparando la abundancia de bacterias y otros organismos al mismo tiempo. Por lo
tanto, además de la composición taxonómica de la comunidad, este enfoque permite
obtener la abundancia de todos los genes microbianos. El resultado del análisis
metagenómico, basado en la secuenciación del ADN, es, sin embargo, las actividades
potenciales de las comunidades microbianas, porque un gen específico puede no
expresarse en esa condición o porque el ADN puede surgir de células muertas o
metabólicamente inactivas. Para identificar los genes realmente expresados en una
muestra de alimentos, la secuenciación de ARN (RNAseq) es el camino más apropiado
a seguir, que es lo que sucedeen un enfoque metatranscriptómico. Hasta ahora, la
aplicación de la metagenómica y la metatranscriptómica se limita a unos pocos estudios
centrados principalmente en los productos lácteos. Lessard y colaboradores (2014)
realizaron, hasta donde sabemos, por primera vez, un análisis exhaustivo del
metatranscriptoma del ecosistema de maduración fúngica del complejo de queso
Camembert, aumentando el conocimiento sobre las actividades biológicas de la
población microbiana dominante de maduración del queso Camembert. Dugat‐Bony y
colaboradores (2015), utilizaronun enfoque integrado metagenómico,
metatranscriptómico y bioquímico que estudió el proceso de maduración del queso y
las actividades metabólicas de los diferentes miembros de la comunidad, así como sus
posibles interacciones. Además, Monnet et al. (2016) informaron diferencias en el
catabolismo de aminoácidos entre las dos levaduras inoculadas en un queso tipo
Reblochon: se encontró que Geotrichum candidum alcanzó la máxima expresión de
genes relacionados con aminoácidos en la primera fase de maduración, mientras que
Debaryomyces hansenii tomó over después de 30 días, destacando un papel diferente
de estas levaduras en la producción de sabor.
8.7 CONCLUSIONES
Los métodos de huellas moleculares son altamente discriminatorios a nivel de especie
y cepa, lo que permite una evaluación exhaustiva de la diversidad de los aislados
recuperadosde las placas de cultivo. Sin embargo, la elección de un método de
tipificación depende de su aplicación, por ejemplo, estudios de composición y/o

dinámica, seguimiento de fuentes, seguimiento y control de la calidad de los alimentos,
conservación de alimentos, etc. Actualmente, se utilizan variosenfoques culturales re-
independientes para aumentar el conocimiento sobre la composición microbiana y su
funcionalidad de los productos lácteos y para monitorear el destino de ciertas bacterias
a través del proceso lácteo.
Se pueden esperar mejoras adicionales mediante la aplicación de nuevas técnicas de
alto rendimiento para estudios de ecología láctea.
Referencias
Acciari VA, Iannetti L, Gattuso A, Sonnessa M, Scavia G, Montagna C, Addante N, Torresi M, Zocchi L,
Scattolini S, Centorame P, Marfoglia C, Prencipe VA, Gianfranceschi MV. 2016. Rastreo de fuentes de
contaminación por Listeria en queso tradicional italiano asociado con un brote en Estados Unidos:
investigaciones en Italia. Epidemiol Infect 144:2719–27.
Akabanda F, Owusu‐Kwarteng J, Tano‐Debrah K, Glover RLK, Nielsen DS Jespersen L. 2013.
Caracterización taxonómica y molecular de bacterias y levaduras del ácido láctico en nunu, un producto
lácteo fermentado de Ghana. Food Microbiol 34:277–83.
Alessandria V, Ferrocino I, De Filippis F, Fontana M, Rantsiou K, Ercolini D, Cocolin L. 2016. Microbiota
de unqueso similar al It alian Grana durante la fabricación y maduración, desentrañada por enfoques
basados en 16S rRNA. Appl Environ Microbiol 82:3988–95.
Amoroso MG, Salzano C, Cioffi B, Napoletano M, Garofalo F, Guarino A, Fusco G. 2011. Validación de
un ensayo de PCR en tiempo real para una cuantificación rápida y sensible de Brucella spp.in leche de
búfala de agua. Food Control 22:1466–70.
Arcuri EF, Sheikha AF, Rychlik T, Isabelle PM, Montet D. 2013. Determinación del origen del queso
mediante el uso de huellas dactilares de ADNr 16S de comunidades bacterianas por PCR‐DGGE:
aplicación preliminar al queso tradicional de Minas. Control de alimentos 30:1–6.
Arteau M, Labrie S, Roy D. 2010. Polimorfismo de longitud de fragmento de restricción terminal y análisis
intergénico intergénico automatizado de comunidades fúngicas enqueso Camembert. Int Dairy J
20:545–54.
AvnI Kırmacı H, Hamdİ Özer B, Akçelik M, Akçelİ k N. 2015. Identificación y caracterización de bacterias
lácticas aisladas del queso Urfa tradicional. Int J Dairy Technol 69:301–307.
Awad S. 2016. Criterios de seguridad microbiana y calidad del queso tradicional egipcio Karish. African J
Microbiol Res 10:804–12.
Baruzzi F, Lagonigro R, Quintieri L, Morea M, Caputo L. 2012. Aparición de poblaciones de bacterias del
ácido no láctico involucradas en proteen la hidrólisis del queso mozzarella de alta humedad almacenado
en frío. Food Microbiol 30:37–44.
Bautista‐Gallego J, Alessandria V, Fontana M, Bisotti S, Taricco S, Dolci P, Cocolin L, Rantsiou K. 2014.
Diversidad y caracterización funcional de Lactobacillus spp. aislado durante la maduración de un queso
duro. Int J Food Microbiol 181:60–66.
Ben Amor K, Vaughan EE, de Vos WM. 2007. Herramientas moleculares avanzadas para la identificación
de bacterias lácticas. J Nutrición 137:741S–47S.
Blasco L, Kahala M, Jatila H, Joutsjoki V. 2015. Aplicación de 16S‐ARDRA y RFLP-PFGE para mejorar
la caracterización genotípica de propionibacterias lácteas y la combinación con fenotipos característicos.
Int Dairy J 50:66–71.
Bonaïti C, Parayre S, Irlinger F. 2006. Nueva estrategia de extracciónde ARN ribosómico y ADN genómico
del queso para investigaciones basadas en PCR. Int J Food Microbiol 107:171–79.
Bonomo MG, Salzano G. 2012. Diversidad microbiana y dinámica de Pecorino di Filiano DOP, un queso
tradicional de la región de Basilicata (sur de Italia). Int J Dairy Technol 65:531–41.
Boss R, Naskova J, Steiner A, Graber HU. 2011. Mastitis diagnostics: quantitative PCR for Staphylococcus
aureus genotype B in bulk tank milk. J Dairy Sci 94:128–37.
Bove CG, De Dea Lindner J, Lazzi C, Gatti M, Neviani E. 2011. Evaluación del polimorfismo genético
entre cepas de queso Parmigiano Reggiano no iniciador de Lactobacillus rhamnosus. Int J Food
Bozoudi D, Kotzamanidis C, Hatzikamari M, Tzanetakis N, Menexes G, Litopoulou‐Tzanetaki E. 2015.
Una comparaciónpara la producción de ácido, proteólisis, autólisis y propiedades inhibitorias de
bacterias lácticas a partir de queso griego fresco y maduro Feta DOP, elaborado en tres zonas montañosas
diferentes. Int J Food Microbiol 200:87–96.
Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellem ans J,Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW,
Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. 2009. Las directrices MIQE: información mínima para la
publicación de experimentos cuantitativos de PCR en tiempo real. Clin Chem 55(4):611–22.
Calasso M, Ercolini D, Mancini L, Stellato G, Minervini F, Di Cagno R, De Angelis M, Gobbetti M. 2016.
Relaciones entre las microbiotas de la casa, la corteza y el núcleo durante la fabricación de quesos
tradicionales italianos en la misma planta láctea. Food Microbiol 54:115–26.
Callon C, Delbès C, Duthoit F, Montel MC. 2006. Aplicación de huellas dactilares SSCP-PCR para perfilar
la comunidad de levaduras en quesos Salers de leche cruda. Syst Appl Microbiol 29:172–80.
Carafa I, Clementi F, Tuohy K, Franciosi E. 2016. Evolución microbiana del queso tradicionalional de
montaña y caracterización de cocos de fermentación temprana para la selección de cepas iniciadoras
lecheras autóctonas. Food Microbiol 53 (Parte B):94–103.
Carafa I, Nardin T, Larcher R, Viola R, Tuohy K, Franciosi E. 2015. Identificación ycaracterización de
lactobacilos y pediococos silvestres procedentes de queso de montaña fermentado espontáneamente.
Carbonnelle E, Mesquita C, Bille E, Day N, Dauphin B, Beretti J‐L, Ferroni A, Gutmann L, Nassif X. 2011.
Herramientas de espectrometría de masas MALDI-TOF parala identificación bacteriana en el laboratorio
de microbiología clínica. Clin Biochem 44:104–109.
Caro I, Mateo J, Sandoval MH, Soto S, García‐Armesto MR Castro JM. 2013. Caracterización de la
microbiota del queso de leche cruda de Oaxaca con especial interés enlas cepas de Lactobacillu. J
Dairy Sci 96:3461–70.
Carpino S, Randazzo CL, Pino A, Russo N, Rapisarda T, Belvedere G, Caggia C. 2017. Influencia de la
microbiota del biofilm del queso DOP Ragusano en la formación de compuestos aromáticos. Microbiol
alimentario. 6: 126–35.
Carraro L, Maifreni M, Bartolomeoli I, Martino ME, Novelli E, Frigo F., et al. 2011. Comparación de
métodos dependientes e independientes del cultivo para el monitoreo de la comunidad bacteriana durante
la fabricación del queso Montasio. Res Microbiol 162:231–39.
Chombo‐Morales P, Kirchmayr M, Gschaedler A, Lugo‐Cervantes E, Villanueva‐Rodríguez S. 2016.
Efectos del control de las condiciones de maduración sobre la dinámica de la población microbiana
nativa del queso Cotija artesanal mexicano evaluado por PCR-DGGE. LWT ‐ Food Sci Technol 65:1153–
61.
Esta revisión debería citarse como: Cocolin L,Al essandria V, Dolci P, Gorra R, Rantsiou K. 2013. Métodos
independientes del cultivo para evaluar la diversidad y la dinámica de la microbiota durante la
fermentación de los alimentos. Int J Food Microbiol 167:29–43.
Coppola S, Fusco V, Andolfi R, Aponte M, Blaiotta G, Ercolini D, Moschetti G. 2006. Evaluación de la
diversidad microbiana durante la fabricación de Fior di Latte di Agerola, un queso tradicional de pasta
de leche cruda y filata de la zona de Nápoles. J Dairy Res 73:264–72.
Primo M A. 1982. Presencia y actividad de microorganis psicrotróficaem en leche y productos lácteos: Una
revisión. J Food Protect 36:108–207.
De Filippis F, Genovese A, Ferranti P, Gilbert JA, Ercolini D. 2016. La metatranscriptómica revela cambios
funcionales impulsados por la temperatura en el microbioma que afectan la tasa de maduración del
queso. Sci Rep 6:21871.
De Filippis F, La Storia A, Stellato G, Gatti M, Ercolini D. 2014. Un microbioma central seleccionado
impulsa las primeras etapas de tres populares fabricantes italianos de queso. PLoS One 9: e89680.
De Pasquale I, Calasso M, Mancini L, Ercolini D, La Storia A, De Angelis M, Di Cagno R, Gobbetti M.
2014b. Relación causal entre la dinámica de la ecología microbiana y la proteólisis durante la fabricación
y maduración de la denominación de origen protegida (DOP) cheese Canestrato Pugliese. Appl Environ
De Pasquale I, Di Cagno R, Buchin S, De Angelis M, Gobbetti M. 2014a. La dinámica de la ecología

microbiana revela una sucesión en el núcleo de la microbiota implicada en la maduración de la pasta
hilada caciocavallo pugliese cheese. Appl Environ Microbiol 80:6243–55.
De Pasquale I, Di Cagno R, Buchin S, De Angelis M, Gobbetti M. 2016. Distribución espacial de la
microbiota metabólicamente activa dentro de los quesos de leche de oveja italianos DOP. PLoS One
11:e0153213.
Delavenne E, Mounier J, Asmani K, Jany JL, Barbier G, Le Blay G. 2011. Diversidad fúngica en leche de
vaca, cabra y oveja. Int J Food Microbiol 151:247–51.
Delbès C, Ali‐Mandjee L, Montel MC. 2007. Monitoreo de comunidades bacterianas en leche cruda y queso
medianteanálisis basados en genes de ARNr 16S dependientes y dependientes del cultivo. Appl Environ
Microbiol 73, 1882–1891.
Delcenserie V, Taminiau B, Delhalle L, Nezer C, Doyen P, Crevecoeur S, Rossey D, Korsak N, Daube G.
2014. Caracterización de la microbiota de un queso belga con denominación de origen protegida, el
queso Herve, mediante análisis metagenómico. J Dairy Sci 97:1–11.
Delgado S, Rachid CT, Fernández E, Rychlik T, Alegría A, Peixoto RS, Mayo B. 2013. Diversidad de
bacterias termófilas en leche cruda, pasteurizada y cultivada selectivamente, evaluada mediante cultivo,
PCR-DGGE y pirosecuenciación. Food Microbiol 36:103–11.
Di Cagno R, Minervini G, Sgarbi E, Lazzi C, Bernini V, Neviani E, Gobbetti M. 2010. Comparación de
métodos fenotípicos (Biolog System) y genotípicos (reacción en cadena de la polimerasa polimerasa
polimórfica amplificada aleatoria, RAPD-PCR y polimorfismo de longitud de fragmento amplificado,
AFLP) para tipificar aislados de Lactobacillus plantarum de verduras y frutas crudas. Int J Food
Diaz M, Ladero V, Del Rio B, Redruello B, Fernández M, Martin MC, Alvarez MA. 2016. Capacidad
formadora de biopelículas en bacterias productoras de aminas biogénicas aisladas de productos lácteos.
Microbiol frontal 7:591.
Dolci P, De Filippis F, La Storia A, Ercolini D, Cocolin L. 2014. Monitorización basada en ARNr de la
microbiota implicada en la producción de queso DOP Fontina en relación con diferentes etapas de la
lactancia de la vaca. Int J Food Microbiol 185:127–35.
Dolci P, Zenato S, Pramotton R, Barmaz A, Alessandria V, Rantsiou K, Cocolin L. 2013. Complejidad de
la microbiota superficial del queso: RT‐PCR‐DGGE, una herramienta para unaimagen detallada? Int J
Dugat‐Bony E, Straub C, Teissandier A, Onésime D, Loux V, Monnet C, Irlinger F, Landaud S,
LeclercqPerlat MN, Bento P, Fraud S, Gibrat JF, Aubert J, Fer F, Guédon E, Pons N, Kennedy S,
Beckerich JM, Swennen D, Bonnarme P. 2015. Visión general de una comunidad de quesos madurados
en superficie que funcionan mediante análisis metaómicos. PLoS One 10(4):e0124360.
Duquenne M, Fleurot I, Aigle M, Darrigo C, Borezée‐Durant E, Derzelle S, Bouix M, Deperrois‐Lafarge
V, Delacroix‐Buchet A. 2010. Herramienta para la cuantificación de la expresión génica de
enterotoxinas estafilocócicas en queso. Appl Environ Microbiol 76:1367–74.
Dušková M, Šedo O, Kšicová K, Zdráhal Z, Karpíšková R. 2012. Identificación de lactobacilos aislados de
alimentos por métodos genotípicos y MALDI-TOF MS. Int J Food Microbiol 159:107–114.
Eneroth A, Christiansson A, Brendehaug J, Molin G. 1998. La contaminación crítica se encuentraen la línea
de producción de leche pasteurizada, con referencia a la flora de deterioro psicrotrófico. Int Dairy J
8:829–834.
Ercolini D, Frisso G, Mauriello G, Salvatore F, Coppola S. 2008. Diversidad microbiana en cultivos
naturales de suero utilizados para la producción de queso Caciocavallo Silano DOP. Int J Food
Ercolini D. 2013. Secuenciación de alto rendimiento y metagenómica: avanzando en el análisis
independiente del cultivo de la ecología microbiana de los alimentos. Appl Environ Microbiol
79(10):3148–55.
Falentin H, Postollec F, Parayre S, Henaff N, Le Bivic P, Richoux R, Thierry A, Sohier D. 2010. Actividad
metabólica específica de bacterias maduras cuantificada por PCR con transcripción inversa en tiempo
real en toda la fabricación de queso Emmental. Int J Food Microbiol 144:10–19.
Falentin H, Henaff N, Le Bivic P, Deutsch SM, Parayre S, Richoux R, Sohier D, Thierry A, Lortal S,
Postollec F. 2012. La PCR cuantitativa con transcripción inversa reveló la persistencia de la actividad
metabólica de las bacterias termófilas del ácido láctico hasta el final de lamaduración del queso
Emmental. Food Microbiol 29:132–40.
Feligini M, Brambati E, Panelli S, Ghitti M, Sacchi R, Capelli E, Bonacina C., 2014. Investigación de un
año de la presencia de Clostridium spp. en leche cruda y cuajada de queso Grana Padano mediante el
análisis automatizado de espaciadores intergénicos ribosómicos. Food Control 42:71–77.
Feligini M, Panelli S, Buffoni JN, Bonacina C, Andrighetto C, Lombardi A. 2012. Identificación de la
microbiota presente en la superficie del queso Taleggio mediante PCR-DGGE y RAPD-PCR. J Food
Sci 77:M609–15.
Felis GE, Dellaglio F. 2007. Taxonomía de lactobacilos y bifidobacterias. Curr Issues Intestinal Microbiol
8:44–61.
Fernández‐No IC, Böhme K, Gallardo JM, Barros‐Velázquez J, Cañas B, Calo‐Mata P. 2010.
Caracterización diferencial debacterias productoras de sustancias biogénicas implicadas en la
intoxicación alimentaria mediante la huella digital masiva MALDI‐TOF. Electroforesis 31:1116–27.
Fisher MM, Triplett EW. 1999. Automated approach for ribosomal intergenic spacer analysis of microbial
diversity and its application tosweet water bacterial communities. Appl Environ Microbiol 65:4630–36.
Franciosi E, Carafa I, Nardin T, Schiavon S, Poznanski E, Cavazza A, Larcher R, Tuohy, KM. 2015.
Biodiversidad y producción de ácido γ-aminobutírico por bacterias del ácido láctico aisladas de quesos
alpinos tradicionales de leche cruda de vaca. BioMed Res Int 1–11.
Freitas Rd, Chuat V, Madec M‐N, Nero LA, Thierry A, Valence F, Carvalho AFd. 2015. Biodiversidad de
la lechería Propionibacterium aislada de granjas lecheras en Minas Gerais, Brasil. Int J Food Microbiol
203:70–77.
Fuka MM, Wallisch S, Engel M, Welzl G, Havranek J, Schloter M. 2013. Dinámica de las comunidades
bacterianas durante el proceso de maduración de diferentes tipos de queso croata derivados de quesos
de leche cruda de oveja. PLoS ONE 8:e80734.
Garofalo C, Osimani A, Milanović V, Aquilanti L, De Filippis F, Stellato G, Di Mauro S, Turchetti B,
Buzzini P, Ercolini D, Clementi F. 2015. Bacterias y microbiota de levadura en granos de kéfir de leche
de diferentes regiones italianas. Food Microbiol 49:123–33.
Ghafari E, Doosti A, Mokhtari‐Farsani A, Ghasemi‐Dehkordi P, Mahmoudi E, Kabiri H. 2014. Estudio
genotípico y fenotípico de especies de Lactobacillus aisladas de yogur y queso tradicionales en el
suroeste de Irán. Int J Biosci 5:155–62.
Ghyselinck J, Van Hoorde K, Hoste B, Heylen K, De Vos P. 2011. Evaluación de MALDI‐TOF MS como
herramienta para laeplicación de alto rendimiento. J Microbiol Methods 86:327–36.
Giraffa G, Gatti M, Rossetti L, Senini L, Neviani E. 2000. Diversidad molecular dentro de Lactobacillus
helveticus revelada por caracterización genotípica. Applied Environ Microbiol 66:1259–65.
Giraffa G, Neviani E. 2001. Estrategias basadas en el ADN e independientes del cultivo para evaluar las
comunidades microbianas en ecosistemas asociados a los alimentos. Int J Food Microbiol 67:19–34.
Guidone A, Braghieri A, Cioffi S, Claps S, Genovese F, Morone G, Napolitano F, Parente E. 2015. Efecto
delos ad juncts sobre las propiedades microbiológicas y químicas del queso Scamorza. J Dairy Sci
98:1467–78.
Guley Z, Uysal HR, Kilic S. 2014. Flora de bacterias del ácido láctico del queso Konya Kuflu: un queso
tradicional de la provincia de Konya en Turquía. J Microbiol Biotechnol Food Sci 4:238–42.
Hadrys H, Balick M, Schierwater B. 1992. Aplicaciones del ADN polimórfico amplificado aleatorio
(RAPD) en ecología molecular. Mol Ecol 1:55–63.
Hayashi K. 1991. PCR-SSCP: un método simple y sensible para la detección de mutaciones en el ADN
genómico. Métodos de PCR Apl 1:34–38.
Hermet A, Mounier J, Keravec M, Vasseur V, Barbier G, Jany JL. 2014. Aplicación del análisis de
polimorfismo de conformación monocatenario de electroforesis capilar (CE-SSCP) para la
identificación de comunidades fúngicas en queso. Food Microbiol 41:82–90.
Jans C, Bugnard J, Njage PMK, Lacroix C, Meile L. 2012a. La diversidad de bacterias del ácido láctico de
los productos lácteos de camello crudos y fermentados africanos revela una microflora predominante
altamente competitiva y potencialmente peligrosa para la salud. LWT ‐ Food Sc Technol 47:371–79.
Jans C, Lacroix C, Meile L. 2012b. Un nuevo ensayo multiplex PCR/RFLP para la identificación de
miembros del complejo Streptococcus bovis/Streptococcus equinus de comunidades microbianas lácteas
basado en el gen 16S rRNA. FEMS Microbiol Lett 326(2):144–50.
Jany JL, Barbier G. 2008. Métodos independientes del cultivo para identificar comunidades microbianas en
el queso. Food Microbiol 25:839–48.
Justé A, Thomma BPHJ, Lievens B. 2008. Avances recientes en técnicas moleculares para estudiar
comunidades microbianas en matrices y procesos asociados a alimentos. Food Microbiol 25:745–61.
Kern CC, Vogel RF, Behr J. 2014. Diferenciación de las estrategias de Lactobacillus brevis utilizando
espectrometría de masas de tiempo de vuelo asistida por matriz asistida por láser, ionización con respecto
a su potencial de deterioro de la cerveza. Food Microbiol 40:18–24.
Kesmen Z, Kacmaz N. 2011. Determinación de la microflora láctica de granos de kéfir y bebidas de kéfir
mediante el uso de métodos dependientes del cultivo e independientes del cultivo. J Food Sc 76:M276–
M283.
Khemariya P, Singh S, Nath G, Gulati AK. 2013. Aislamiento, identificación y susceptibilidad a antibióticos
de nis+ Lactococcus lactis de fuentes lácteas y no lácteas. Czech J Food Sci, 31:323–31.
Lazzi C, Bove CG, Sgarbi E, Monica G, La Gioia F, Sandra T, Neviani E. 2009. Aplicación del análisis de
huellas dactilares AFLP para el estudio de la biodiversidad de Streptococcus thermophilus. J Microbiol
Methods 79:48–54.
Lazzi C, Povolo M, Locci F, Bernini V, Neviani E, Gatti M. 2016. ¿Puede el desarrollo y la autólisis de las
bacterias del ácido láctico influir en la fracción volátil del queso? El caso de Grana Padano. Int J Food
Le Dréan G, Mounier J, Vasseur V, Arzur D, Habrylo O, Barbier G. 2010. Cuantificación del micelio
de Penicillium camemberti y P. roqueforti mediante PCR en tiempo real para evaluar su dinámica de
crecimiento durante la maduración del queso. Int J Food Microbiol 138:100–107.
Leite AMO, Mayo B, Rachid CTCC, Peixoto RS, Silva JT, Paschoalin VMF, Delgado S. 2012. Evaluación
de la diversidad microbiana de granos de kéfir brasileño mediante PCR-DGGE y análisis de
pirosecuenciación. Food Microbiol 31:215–221.
Lessard MH, Bélanger G, St‐Gelais D, Labrie S. 2012. La composición de los cultivos de maduración del
queso Camembert modula tanto el crecimiento micelial como la apariencia. Appl Environ Microbiol
78:1813–19.
Lessard MH, Viel C, Boyle B, St‐Gelais D, Labrie S. 2014. El análisis del metatranscriptoma de las cepas
fúngicas Penicillium camemberti y Geotrichum candidum revela la ruptura de la matriz del queso y el
desarrollo potencial de las propiedades sensoriales del queso tipo Camembert maduro. BMC Genomics
5:235.
Liu W, Zheng Y, Kwok LY, Sun Z, Zhang J, Guo Z, Hou Q, Menhe B, Zhang H. 2015b. Secuenciación de
alto rendimiento para la detección de ladiversidad bacteriana y fúngica en la leche de vaca fermentada
naturalmente en Mongolia en Rusia. BMC Microbiol 15:45.
Liu X‐F, Liu C‐J, Zhang H‐Y, Gong F‐M, Luo Y‐Y, Li X‐R. (2015a) La estructura de la comunidad
bacteriana de yond bap, un producto tradicional de leche de cabra fermentada, de distintas regiones
chinas. Dairy Sci Technol 95:369–80.
Mangia NP, Fancello F, Deiana P 2016. Caracterización microbiológica utilizando enfoques combinados
dependientes del cultivo e independientes del queso Casizolu pasta hilada. J Microbi aplicado ol 120,
329–345.
Marilley L, Casey MG. 2004. Sabores de productos queseros: vías metabólicas, herramientas analíticas e
identificación de cepas productoras. Int J Food Microbiol 90:139–159.
Martín‐Platero AM, Maqueda M, Valdivia E, Purswani J, Martínez‐Bueno M. 2009. Estudio polifásico de
comunidades microbianas de dos quesos de leche de cabra de granja españoles de Sierra de Aracena.
McCartney AL. 2002. Aplicación de métodos biológicos moleculares para el estudio de probióticos y la
flora intestinal. Br J Nutr 88:S29–37.
McPhee JD, Griffiths MW. 2002. Pseudomonas spp. En: Roginski H, Fuquay WJ, Fox FP (Eds).
Enciclopedia de ciencias lácteas, Vol. 4. Academic Press, pp 2340-50.
Monnet V, Juillard V, Gardan R. 2016. Conversaciones de péptidos en bacultura Gram-positiva. Crit Rev
Montel MC, Buchin S, Mallet A, Delbes‐Paus C, Vuitton DA, Desmasures N, Berthier F. 2014. Quesos
tradicionales: microbiota rica y diversa con beneficios asociados. Int J Food Microbiol 177:136–54.
Morandi S, Brasca M. 2012. Aspectos de seguridad, diversidad genética y caracterización tecnológica de
cepas silvestres de Streptococcus thermophilus aisladas de quesos tradicionales del norte de Italia.
Food Control 23 :203–209.
Mormile A, Barile M, Mercogliano R, Johansson P, Björkroth KJ, Aponte M, Murru N. 2016. Dinámica de
las bacterias del ácido láctico en "Pecorino di Tramonti", un queso de leche de oveja, con especial énfasis
en los enterococos: un estudio preliminar. Ann Microbiol 66:179–85.
Mounier J, Le Blay G, Vasseur V, Le Floch G, Jany JL, Barbier G. 2010. Aplicación de la cromatografía
líquida desnaturalizante de alta resolución (DHPLC) para la identificación de levaduras en superficies
de frotis de queso rojo. Lett Appl Microbiol 51:18–23.
Mounier J, Monnet C, Jacques N, Antoinette A, Irlinger F. 2009. Evaluación de la diversidad microbianal
en la superficie del queso Livarot utilizando enfoques independientes y dependientes del cultivo. Int J
Muyzer G, de Waal EC, Uitterlinden AG. 1993. Profiling of complex microbial populations by denaturing
gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction‐amplified genes coding for 16S rRNA. Appl
Environ Microbiol 59:695–700.
Nalbantoglu U, Cakar A, Dogan H, Abaci N, Ustek D, Sayood K, Can H. 2014. Análisis metagenómico de
la comunidad microbiana en granos de kéfir. Food Microbiol 41 :42–51.
Naumann D, Helm D, Labischinski H. 1991. Caracterizaciones microbiológicas por espectroscopia FT-IR.
Nature 351:81–82.
Ndoye B, Lessard MH, LaPointe G, Roy D. 2011. Explorando la hibridación sustractiva de supresión (SSH)
para discriminar Lactococcus lactis ssp. cremoris SK11 y ATCC 19257 en cultivo mixto basado en la
expresión de genes específicos de cepas. J Appl Microbiol 110:499–512.
Nocker A, Cheung CY, Camper AK. 2006. Comparación de monoazida de propidio con monoazida de etidio
para la diferenciación de bacteria viva vs. muertamediante la eliminación selectiva de ADN de células
muertas. J Microbiol Methods 67:310–20.
Nolan T, Hands RE, Bustin SA. 2006. Cuantificación de ARNm mediante RT-PCR en tiempo real. Nat
Protoc 1:1559–82.
Ongol MP, Tanaka M, Sone T, Asano K. 2009. Un método de PCR en tiempo real quecontiene una secuencia
génica que codifica la proteína de procesamiento de ARNr 16S, rimM, para la detección y enumeración
de Streptococcus thermophilus en productos lácteos. Food Res Int 42:893–98.
Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T. 1989. Detección de polimorfismos de ADN
humano mediante electroforesis en gel como polimorfismos de conformación monocatenaria. Proc Natl
Acad Sci USA 86:2766–70.
O'Sullivan DJ, Giblin L, McSweeney PL, Sheehan JJ, Cotter PD. 2013. Enfoques basados en ácidos
nucleicos para investigar defectos de calidad del queso relacionados conmicrobios. Fronteras en
Microbiol 4.
Panelli S, Brambati E, Bonacina C, Feligini M. 2013. Detección de Clostridium tyrobutyricum en leche
para prevenir el soplado tardío en queso mediante análisis automatizado de espaciadores intergénicos
ribosómicos. J Food Sci 78:M1569–74.
Pavlovic M, Huber I, Konrad R, Busch U. 2013. Aplicación de MALDI‐TOF MS para la identificación de
bacterias transmitidas por los alimentos. Abra Microbiol J 7:135–41.
Perin LM, Dal Bello B, Belviso S, Zeppa G, Carvalho AFd, Cocolin L, Nero LA. 2015. Microbiota del
queso de Minasinfluenced por el productor de nisina Lactococcus lactis subsp. lactis GLc05. Int J
Pogačić T, Mancini A, Santarelli M, Bottari B, Lazzi C, Neviani E, Gatti M. 2013. Diversidad y dinámica
de cepas de bacterias del ácido láctico durante el envejecimiento de un queso duro de larga maduración
producido a partir de leche cruda y un iniciador natural indefinido. Food Microbiol 6:207–215.
Porcellato D, Brighton C, McMahon DJ, Oberg CJ, Lefevre M, Broadbent JR, Steele JL. 2014. Aplicación
de ARISA para evaluar la influencia del contenido de sal y el tipo de catión en la diversidad
microbiológica del queso Cheddar. Lett Appl Microbiol 59(2):207–16.
Esta revisión debería citarse como: Postollec F, Falentin H, Pavan S, Combrisson J, Sohier D. 2011. Avances
recientes en aplicaciones de PCR cuantitativa (qPCR) en microbiología de alimentos. Food Microbiol
28:848–61.
Quero GM, Fusco V, Cocconcelli PS, Owczarek L, Borcakli M, Fontana C, Skapska S, Jasinska UT,
Ozturk T, Morea M. 2014. Caracterización microbiológica, fisicoquímica, nutricional y sensorial de
Matsoni tradicional: selección y uso decultivos de cepas múltiples autóctonas para extender su vida
útil. Food Microbiol 38:179–91.
Quigley L, O'Sullivan O, Beresford TP, Ross RP, Fitzgerald FG, Cotter PD. 2011. Enfoques moleculares
para analizar la composición microbiana de la leche cruda y el queso de leche crudae. Int J Food
Randazzo CL, Caggia C, Neviani E. 2009. Aplicación de enfoques moleculares para el estudio de bacterias
lácticas en quesos artesanales. J Microbiol Methods 78:1–9.
Randazzo CL, Pitino I, Ribbera A, Caggia C. 2010. Pecorino Crotonese cheese: estudio de la población
bacteriana y compuestos de sabor. Food Microbiol 27:363–74.
Rantsiou K, Urso R, Dolci P, Comi G, Cocolin L. 2008. Microflora de queso Feta de cuatro fabricantes
griegos. Int J Food Microbiol 26(1‐2):36–42.
Rasolofo EA, LaPointe G, Roy D. 2011. Evaluación de la diversidad bacteriana de la leche tratada y no
tratada durante el almacenamiento en frío mediante métodos T-RFLP y PCR-DGGE. Dairy Sci Technol
91(5):573–97.
Rasolofo EA, St‐Gelais D, LaPointe G, Roy D, 2010. Análisis molecular de la estructura ydinámica de la
opulación bacteriana durante el almacenamiento en frío de leche no tratada y tratada. Int J Food
Microbiol 138(1‐2):108–118.
Riquelme C, Câmara S, Enes Dapkevicius MdLN, Vinuesa P, da Silva CCG, Malcata FX, Rego OA. 2015.
Caracterización de labiodiversidad bacteriana en queso Pico (un alimento artesanal de las Azores). Int
J Food Microbiol 192:86–94.
Ruggirello M, Dolci P, Cocolin L. 2014. Detección y viabilidad de Lactococcus lactis durante la maduración
del queso. PLoS One 9(12):e 114280. doi: 10.1371/journal.pone.01142 80.
Ruiz‐Moyano S, Tao N, Underwood MA, Mills DA. 2012. Rapid discrimination of Bifidobacterium
animalis subspecies by matrix‐assisted laser desorption ionization‐time of flight mass spectrometry.
Sacristán N, Mayo B, Fernández E, Fresno JM, Tornadijo ME, Castro JM. 2013. Estudio molecular de cepas
Geotrichum aisladas del queso Armada. Food Microbiol 36(2):481–87.
Sandrin TR, Goldstein JE, Schumaker S. 2013. MALDI TOF MS perfil de bacterias anivel de cepa: una
revisión. Espectrometría de masas Apocalipsis 32:188–217.
Santarelli M, Bottari B, Lazzi C, Neviani E, Gatti M. 2013. Encuesta sobre la comunidad y dinámica de las
bacterias lácticas en el queso Grana Padano. Syst Appl Microbiol 36:593–600.
Saubusse M, Millet L, Delbès C, Callon C, Montel MC. 2007. Aplicación del polimorfismo de
conformación de cadena simple: método de PCR para distinguir las comunidades bacterianas del queso
que inhiben Listeria monocytogenes. Int J Food Microbiol 116:126–35.
Sauer S, Freiwald A, Maier T, Kube M, Reinhardt R, Kostrzewa M, Geider K. 2008. Clasificación e
identificación de bacterias por espectrometría de masas y análisis computacional. PLoS ONE 3:e2843.
Schornsteiner E, Mann E, Bereuter O, Wagner M, Schmitz-Esser S. 2014. Análisisindependiente del cultivo
de comunidades microbianas en cortezas austríacas de queso duro de leche cruda. Int J Food Microbiol
180:88–97.
Schütte U, Abdo Z, Bent S, Shyu C, Williams C, Pierson J, Forney L. 2008. Avances en el uso delanálisis
de polimorfismo de fragmentos de restricción terminal lengt h (T-RFLP) de genes 16S rRNA para
caracterizar comunidades microbianas. Appl Microbiol Biotechnol 80 :365–80.
Serhan M, Cailliez-Grimal C, Borges F, Revol-Junelles AM, Hosri C, Fanni J. 2009. Diversidad bacteriana
de Darfiyeh, un arte libanésisanal queso crudo de leche de cabra. Food Microbiol 26:645–52.
Silva LF, Casella T, Gomes ES, Nogueira MCL, De Dea LJ, Penna ALB. 2015. Diversidad de bacterias del
ácido láctico aisladas del queso mozzarella búfalo de agua brasileño. J Food Sci 80:M411–M417.
Singh S Goswami P, Singh R Hellerc KJ. 2009. Aplicación de herramientas de identificación molecular
para Lactobacillus, con un enfoque en la discriminación entre especies estrechamente relacionadas: una
revisión. LWT ‐ Food Sci Technol 42:448–45.
Sofu A, Ekinc FY. 2016. Dinámica de diversidad bacterianadel queso tradicional turco Ezine evaluado por
análisis PCR-DGGE y SSCP. Int J Dairy Technol 69:592–600.
Sogin ML, Morrison HG, Huber JA, Welch DM, Huse SM, Neal PR, et al. 2006. Diversidad microbiana en
las profundidades marinas y la poco explorada 'biosfera rara'. Proc Nat Acad Sci USA 103:12115–20.
Solieri L, Bianchi A, Giudici P. 2012. Inventario de bacterias lácticas no iniciadoras del queso Parmigiano
Reggiano madurado evaluado mediante un enfoque multifásico dependiente del cultivo. System Applied
Stellato G, De Filippis F, La Storia A, Ercolini D. 2015. Coexistencia de bacterias del ácido láctico y
potencial deterioro de la microbiota en un entorno de procesamiento de productos lácteos. Appl Environ
Microbiol 81(22):7893–904. doi: 10.1128/AEM.02294‐155.
Sun Z, Liu W, Ba o Q, ZhangJ, Hou Q, Kwok L, Sun T, Zhang H. 2014. Investigación de la diversidad
bacteriana y fúngica en tarag utilizando secuenciación de alto rendimiento. J Dairy Sci 97(10):6085–96.
doi: 10.3168/ jds.2014‐8360.
Terzić‐Vidojević A, Tonković K, Leboš Pavunc A, Beganović J, Strahinić I, Kojić M, Veljović K, Golić N,
Kos B, Čadež N, Gregurek L, Šušković J, Raspor P, Topisirović L. 2015. Evaluación de bacterias
autóctonas del ácido láctico como cultivos iniciadores para la producción de quesos blancos encurtidos
y frescos de pasta blanda. LWT ‐ Food Sci Technol 63:298–306.
Tofalo R, Fasoli G, Schirone M, Perpetuini G, Pepe A, Corsetti A, Suzzi G. 2014. El predominio, la
biodiversidad y las propiedades biotecnológicas de Kluyveromyces marxianus en la producción del
queso Pecorino di Farindola. Int J Food Microbiol 187:41–49.
Tormo H, Ali Haimoud Lekhal D, Roques C. 2015. Caracterización fenotípica y genotípica de bacterias del
ácido láctico aisladas de leche cruda de cabra y efecto de las prácticas agrícolas sobre las especies
dominantes de bacterias del ácido láctico. Int J Food Microbiol 210:9–15.
Tsafrakidou P, Bozoudi D, Pavlidou S, Kotzamanidis C, Hatzikamari M, Zdragas A, Litopoulou‐Tzanetaki
E. 2016. Caracterización tecnológica, fenotípica y genotípica de lactobacilos de Graviera Kritis DOP de
queso griego, fabricado enlecherías tradicionales. LWT ‐ Food Sci Technol 68:681–89.
Turvey ME, Weiland F, Meneses J, Sterenberg N, Hoffmann P. 2016. Identificación de microorganismos
de deterioro de la cerveza utilizando la plataforma MALDI Biotyper. Microbiol Biotechnol aplicado
100:2761–73.
Van Hoord e K,Van Leuven I, Dirinck P, Heyndrickx M, Coudijzer K, Vandamme P, Huys G. 2010.
Selección, aplicación y seguimiento de cepas de Lactobacillus paracasei como cultivos
coadyuvantes en la producción de quesos tipo Gouda. Int J Food Microbiol 144:226–35.
Van Hoorde K, Vandamme P, Huys G. 2008a. Identificación molecular y tipificación de bacterias del ácido
láctico asociadas con la producción de dos quesos artesanales de leche cruda. Dairy Sci Technol 88:445–
55.
Van Hoorde K, Verstraete T, Vandamme P, Huys G. 2008b. Diversidad de bacterias lácticas en dos quesos
flamencos artesanales tipo Gouda de leche cruda. Food Microbiol 25:929–35.
Vandamme P, Pot B, Gillis M, de Vos P, Kersters K, Swings J. 1996. Taxonomía polifásica, un enfoque de
consenso para la sistemática bacteriana. Microbiol Apocalipsis 60:407–38.
Versalovic J, Schneider M, De Bruijn FJ, Lupski JR. 1994. Huella genómica de bacterias mediante reacción
en cadena de la polimerasa basada en secuencias repetitivas. Métodos Molec Cell Biol 5:25–40.
Vithanage NR, Dissanayake M, Bolge G, Palombo EA, Yeager TR, Datta N. 2016. Biodiversidad de la
microbiota psicrotrófica cultivable en leche cruda atribuible a las condiciones de refrigeración,
estacionalidad y su potencial de deterioro. Int Dairy J 57:80–90.
Vithanage NR, Yeager TR, Jadhav SR, Palombo EA, Datta N. 2014. Comparación de los sistemas de
identificación de bacterias psicrotróficas aisladas de leche cruda de bovino. Int J Food Microbiol 189:26–
38. von Neubeck M, Baur C, Krewinkel M, Stoeckel M, Kranz B, Stressler T, Fischer L, Hinrichs J, Scherer
S, Wenning M. 2015. Biodiversidad de la microbiota de la leche cruda refrigerada y su potencial de deterioro
enzimático. Int J Food Microbiol 211:57–65.
Vrabec M, Lovayová V, Dudriková K, Gallo J, Dudriková E. 2015. Resistencia antibiótica yprevalencia de
Enterococcus spp. y Escherichia coli aisladas del queso Bryndza. Italiano J Animal Sci 14:3968.
Ward P, Roy D. 2005. Revisión de métodos moleculares para identificación, caracterización y detección de
bifidobacterias. Lait 85:23–32.
Wenning M, Breitenwieser F, Konrad R, Huber I, Busch U, Scherer S. 2014. Identificación y diferenciación
de bacterias relacionadas con alimentos: una comparación de la espectroscopia FTIR y la espectrometría
de masas MALDI-TOF. J Microbiol Methods 103:44–52.
Wieme AD, Spitaels F, Aerts M, De Bruyne K, Van Landschoot A, Vandamme P. 2014a. Identificación de
bacterias de deterioro de la cerveza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de
desorción/ionización láser asistida por matriz. Int J Food Microbiol 185:41–50.
Wieme AD, Spitaels F, Vandamme P, VanLan dschoot A. 2014b. Aplicación de la espectrometría de masas
de tiempo de vuelo de desorción / ionización láser asistida por matriz como herramienta de monitoreo
para la contaminación interna por levadura de cerveza: una prueba de concepto. J Inst Brewing 120:438–
43.
Williams DL, Gillis TP, Booth RJ, Looker D, Watson JD. 1990. El uso de una sonda de ADN específica y
reacción en cadena de la polimerasa para la detección de Mycobacterium leprae. J Infect Dis 162:193–
200.
Woese CR. 1987. Evolución bacteriana. Microbiol Apocalipsis 51:221–71.
Wolfe BE, Button JE, Santarelli M, Dutton RJ. 2014. Las comunidades de corteza de queso proporcionan
sistemas manejables para estudios in situ e in vitro de la diversidad microbiana. Celda 158:422–33.
Zago M, Bonvini B, Carminati D, Giraffa G. 2009. Detección y cuantificación de Enterococcus gilvus en
queso mediantePCR re-tiempo. Syst Appl Microbiol 32(7):514–21.
Zeller‐Péronnet V, Brockmann E, Pavlovic M, Timke M, Busch U, Huber I. 2013. Potencial y limitaciones
de MALDI‐TOF MS para la discriminación dentro de las especies Leuconostoc mesenteroides y
Leuconostoc pseudomesenteroides. Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit 8:205–
214.

Metabolismo y Bioquímica de LAB y Especies Asociadas A Lácteos

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6 Metabolismo y bioquímica de LAB y especies

Microbiología en el procesamiento de lácteos: desafíos y oportunidades, primera edición.

6.2 SUSTRATOS DE CARBOHIDRATOS, GLUCÓLISIS Y PRODUCCIÓN

Glucosa fermentada ≥85% 50%

Producido:CO2, acetato, etanol – +

Fructosa difosfato Aldolasa + −

B Homofermentativo Heterofermentativo aHeterofermentativo

Metabolismo y bioquímica de LAB y especies asociadas a lácteos

gliceraldehído-3-fosfato (GAP). GAP se convierte en piruvato en una secuencia

6.2.1 Vía de la pentosa fosfato

6.2.2 Fermentación del citrato

La energía se produce mediante la conversión de acetil-CoA en acetato: el citrato

6.3 PROTEÓLISIS, SUSTRATOS DE PROTEIN Y DISPONIBILIDAD DE

aminopeptidasa y una serie de peptidasas específicas de prolina que contribuyen a la

6.3.1 Proteinasas de la envoltura celular: el sistema Prt

sensible al fluoruro de fenil m etilsulfonilo. Se han descrito varias proteinasas en Lb.

6.3.2 Permeasas de oligopéptidos y otros transportadores de péptidos y

6.3.3 Peptidólisis yaminoácidos libres

PepL Serina peptidasa

PepF (F1, F2) Metalopeptidasa Escinde oligopéptidos

PepG Cisteína peptidasa

PepIP Serina peptidasa Prolina iminopeptidasa, actúa sobre secuencias que

Lb. helveticus CNRZ32 (Christensen et al., 2003). Además de escindir oligopéptidos

6.3.5 Biosíntesis de aminoácidos y auxotrofia

6.4 LIPÓLISIS, LIPASAS, ESTERASAS

2010; Wolf et al., 2016), que tienen propiedades volátiles y proporcionan

Liu et al. (2008) describieron unareacción alternativa para la formación de ésteres

6.5 AROMA Y FLAVOUR PRODUCTOS DEL METABOLISMO

un sabor más compacto. La lipólisis es responsable de la producción de ácidos grasos

Tabla 6.3 Principales compuestos volátiles activos en olores en productos lácteos.

Butanoico Carbohidratos / Sudor, calcetín fecal, rancio, Cheddar, Parmesano, Azul

Cuadro 6.3 (continuación)

Acetoína Carbohidratos Leche agria y mantecosa Mantequilla, Cheddar, Gouda

3-metilbutanal Proteínas Malteado, potente, queso, verde, Cheddar, Gouda, Parmesano,

Di-metil-disulfuro Proteínas Verde, agrio, cebolla Camembert

d-Decalactona Lípidos Coco, melocotón, cremoso, grasa Cheddar, Gouda, Camembert

6.5.1 Aldehídos, alcoholes y ácidos carboxílicos

Umbral de olor en ppb (μM)

2-metilpropanal Plátano, malta, chocolate 0.1–2.3

3-metilbutanal Malta 13 (0.15)

3-metilbutanal Queso fresco, impresionante, alcohólico 250 (2.8) —

Ácido 3-metilbutírico Sudoroso, queso 120–700 (1.2–6.9) —

Val α-Ácido 2-metilpropanal Ácido 2- 2-metilpropanol Isobutanoato de

Phe Piruvato de fenilo Benzaldehído Ácido benzoico Fenilmetanol Benzoato de etilo

derivados de BCAA, ArAA y metionina, observados en muchas fermentaciones lácteas,

6.5.2 Aminoácidos como compuestos aromatizantes precursores

6.6 PRODUCCIÓN NO ENZIMÁTICA DE AROMAS

6.7 MÉTODOS DE ANÁLISIS DE AROMAS EN LÁCTEOS

Federico II, Avellino, Italia

7.2 MEDIOS DE CULTIVO ESTABLECIDOS PARA LACTOBACILOS

Microbiología en el procesamiento de lácteos: desafíos y oportunidades, primera edición.

7.2.1 Agar Rogosa

Tabla 7.1 Composición de Rogosa (por litro de agua purificada).

Triptona 10,0 g/l

Cuadro 7.2 Composición de MRS (por litro de agua purificada).

Peptona 10,0 g/l

7.2.2 Medio MRS

7.2.3 Leche desnatada y agar de suero

Cuadro 7.3 Composición M17 (por litro de agua purificada).

Triptona 5,0 g/l

Peptona de soja 5,0 g/l

7.3.1 Agar St. thermophilus

Hidrolizado enzimático de caseína 20,0 g/l Triptona 20,0 g/l