1.

Evaluación del perfil proteico mediante la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)

Calentar los tubos a Electroforesis en el gel de Después de cargar las

Preparación de muestras: ebullición durante poliacrilamida con SDS: muestras, conectar la cuba de
En el TP N° 1 el pellet de 5 minutos. Sembrar las alícuotas de 25μL electroforesis, que contiene el
células fue resuspendido de las muestras preparadas gel y el buffer de corrida, a
en 25 μL de buffer sobre el pocillo de siembra de una fuente de poder.
LAEMMLI un gel de poliacrilamida.

Después de ese tiempo se Revelado del gel: Finalizada La corrida se desarrollará

realizara una decoloración del la corrida electroforética, el por 1h 30 min. Luego de
hasta visualizar gel con un 1er lavado de agua y gel se colocará en una esto el gel se retirará para
las bandas otro con solución decolorante solución de (Coomassie R ser revelado.
correctamente. (metanol:ácido acético:agua 350) durante 1 día.
(3:1:6, v/v))

2. Determinación cuantitativa de proteínas mediante el Método de Bradford

Al finalizar el TP1 se tomó la Las células obtenidas fueron

alícuota de la suspensión celular resuspendidas en un volumen conocido
control (C) y tratada (T) para, en el de buffer de lisis, y se tomaron 50 uL de
TP N° 2, estimar la concentración cada lisado, que fueron sembrados en
de proteínas totales para cada la placa multiwell siguiendo el siguiente
condición. esquema.
 3. Estudio del perfil lipídico de muestras biológicas mediante la técnica de cromatografía en capa delgada.
A) Extracción lipídica:

1) Agregar 100 μL de agua
y 500 μL de Metanol
(MeOH) al pellet de
células (este paso ya fue
realizado en el TP N° 1).
2) Trasvasar la muestra a
un tubo cónico
3) Agregar 350 μL de agua
y 500 μL de Cloroformo
(Cl3CH) (en campana).
4) Vortexear por 30’’.
5) Incubar 15 min a
temperatura ambiente.
6) Observar la formación
de dos fases.
7) Centrifugar a 2500 rpm 5 min
8) Retirar la fase acuosa
(superior) hasta que quede una
altura no menor a 1 milímetro.

10) Evaporar la fase 9) Extraer la fase

clorofórmica bajo clorofórmica (inferior)
atmósfera de N2 para cuidadosamente y pasar a
obtener el extracto seco. un tubo de vidrio limpio y
seco.

B) Separación por cromatografía en capa delgada (TLC):

1) Resuspender el 3) Aplicar la muestra sobre
extracto seco en 40 μL una placa cromatográfica
de Cl3CH:MeOH (2:1) previamente marcada,
2) Vortexear por 30’’ conteniendo la
fase estacionaria de sílica gel.
4) Colocar la placa en una cuba 5) Una vez que el frente
cromatográfica previamente de corrida alcanza el
saturada con la fase móvil: Éter de último medio centímetro
petróleo/hexano/éter etílico/ácido de la placa, retirar de
acético (40:40:20:1 v/v). la cuba y dejar secar.

Revelar utilizando Acetato

cúprico al 3% en H3PO4 al
8% y calor (110 oC) por 5
min.