Metodología propuesta

Microdilución en caldo

Solución de trabajo. (DILUCIONES) Se preparó una solución de trabajo

diluyendo 2 mg de extracto en 50 µL de DMSO. Posteriormente se diluyó en 950
µL de caldo de cultivo, para así obtener una solución de 1000 µL con una
concentración de 2000 µg/ml. Las diluciones se prepararán a partir de diluciones
1:1 con caldo nutritivo.

Inóculo. 10 ml de caldo nutritivo, inocular con la cepa de trabajo y dejar incubar

por 24 h

En cada pocillo se colocarán 100 µl de caldo inoculado más 100 µl de la

concentración a probar. Al final las diluciones en los pocillos serán: 1000 µg/mL,
500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 62.5 µm/L, 31.25 µg/mL, 15.625 µg/mL, 8.625
µL.

Controles: negativo cultivo, cultivo + extracto, cultivo inoculado

Contr Control Contr St + D1+ D2 + D3 + D4 + D5 + D6 + D7 +
ol caldo ol caldo caldo caldo caldo caldo caldo caldo caldo
caldo inoculad caldo 1000 500 250 125 62.5 31.2 15.6 8.62
o +MSO µg/mL µg/m µg/m µg/m µg/m 5 2 µg/m
L L L L µg/m µg/m L
L L
Contr Control Contr St + D1+ D2 + D3 + D4 + D5 + D6 + D7 +
ol caldo ol caldo caldo caldo caldo caldo caldo caldo caldo
caldo inoculad caldo 500 250 125 62.5 31.2 15.6 8.62
o + 1000 µg/m µg/m µg/m µg/m 5 2 µg/m
+MSO µg/mL L L L L µg/m µg/m L
L L
Contr Control Contr St + D1+ D2 + D3 + D4 + D5 + D6 + D7 +
ol caldo ol caldo100 caldo caldo caldo caldo caldo caldo caldo
caldo inoculad caldo 0 µg/mL 500 250 125 62.5 31.2 15.6 8.62
o +MSO µg/m µg/m µg/m µg/m 5 2 µg/m
L L L L µg/m µg/m L
L L

La placa se dejará incubar y se tomarán lecturas de densidad óptica. a 620 nm

cada hora por 12 h, este experimento se realizará por triplicado.
Concentraciones POR SEPARADO PARA QUE en 100 microlitros SE
TENGAN LAS SIGUIENTES CONCENTRACIONES

A. 400 (40 mg + 50 microlitros de DMSO + 950 microlitros de caldo)

B. 200 (20 mg + 50 microlitros de DMSO + 950 microlitros de caldo)
C. 100 (10 mg + 50 microlitros de DMSO + 950 microlitros de caldo)
D. 50 (5 mg + 50 microlitros de DMSO + 950 microlitros de caldo)
E. 25 (2.5 mg + 50 microlitros de DMSO + 950 microlitros de caldo)
F. 12.5 (1.25 mg + 50 microlitros de DMSO + 950 microlitros de caldo)
G. CONTROL POSITIVO CALDO INOCULADO
H. CONTROL NEGATIVO CALDO SIN INOCULO

Preparación con 50 microlitros de DMSO y 950 microlitros de caldo

10 ml de inoculo por cada placa

10 ml de caldo

1 placa para cada extracto y para cada bacteria

BACTERIAS:

 Bacillus cereus
 Staphilococcus aureus

REPRESENTACIÓN DE PLACA
A B C D E F G H
A B C D E F G H
A B C D E F G H

MATERIAL

 MATRAZ O TUBOS PARA INOCULO O CALDO (5)

 PUNTAS
 MICROPIPETAS
Células para el inóculo

Las colonias aisladas deben ser seleccionadas de un cultivo en placa de agar

nutritivo después de 18 a 24 horas. Se debe usar un medio no selectivo, como
agar sangre.

Prepare la suspensión del inóculo Método de crecimiento

• De la placa de agar, seleccione de tres a cinco colonias bien aisladas y con el

mismo tipo morfológico. La parte superior de cada colonia se toca con un asa de
alambre y se transfi ere a un tubo que contenga 4-5 mL de caldo apropiado

• El caldo de cultivo se incuba a 35ºC hasta que alcance la turbidez equivalente a

0,5 del estándar de McFarland (usualmente 4-6 horas).

La turbidez del cultivo creciendo activamente en caldo se ajusta con solución

salina o caldo estéril.

La suspensión resultante contiene aproximadamente 1 a 2 x 10 8 (UFC/mL).

Para ejecutar este paso apropiadamente, se debe usar ya sea un aparato

fotométrico o, si se hace visualmente, luz adecuada para comparar visualmente el
tubo con el inóculo y el estándar de McFarland al 0,5 frente a una cartulina con
fondo blanco y rayas negras de contraste. Ver Figura 4,2 en el Capítulo 4.
COMO LEER LA PLACA

Retire la placa de CIM y la placa de control de pureza de las incubadoras.

2. Examine la placa de control de pureza utilizando luz reflejada y luego utilizando

luz transmitida. A veces la contaminación suele ser casi imperceptible.

Si la placa de control de pureza se muestra contaminada, la prueba de CIM no

puede ser interpretada y debe ser repetida.

3. Revise el crecimiento en la celdilla de control positivo. Se debe encontrar

turbidez o un punto de crecimiento > 2 mm lo cual indica crecimiento adecuado en
el panel de CIM.

4. Revise el pozo de control negativo. Esta debe estar claro, sin turbidez.

5. Lea el punto fi nal CIM como la concentración más baja del agente
antimicrobiano que inhibe completamente el crecimiento del organismo detectado
por observación directa sin ayuda de ningún aparato óptico. Ver Figura 5.2.
Manual de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana / autores, Stephen J.
Cavalieri et al. American Society for Microbiology. (2005)
DIAGRAMA DE FLUJO

Balouri et al. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. J

Pharm Anal. 2016 Apr; 6(2): 71–79.