BIOTECNOLOGÍA

GUÍA DE ESTUDIO
DE LA CÁTEDRA

INGENIERÍA QUÍMICA | UTN FRC

Prof. Dra. Ing. María José Pascualone

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Tema 1:

INTRODUCCIÓN A LA BIOTECNOLOGÍA

1.1. ¿Qué es la biotecnología?

La biotecnología es la aplicación de los principios de la ciencia y de la ingeniería al procesado de
materiales mediante agentes biológicos, con el fin de obtener productos y servicios. La palabra
biotecnología se utiliza a veces en un sentido demasiado restringido, como la manipulación genética y
la biología molecular aplicada a la obtención de bienes y servicios útiles. Y, en sentido amplio, la
biotecnología engloba todas las operaciones de la biología aplicada, desde la agricultura hasta las
ciencias culinarias.
Los inicios remotos de la biotecnología se encuentran ya en las sociedades primitivas con la
elaboración de pan, queso, vino, cerveza, etc. O también se pueden considerar precedentes de la
biotecnología la apicultura y la ganadería. Sin embargo, el uso de la palabra biotecnología en Estados
Unidos (uno de los países más avanzados en este campo) ha venido a significar todo un sector industrial
dedicado a crear, desarrollar y comercializar una gama de productos obtenidos mediante manipulación
genética, biología molecular o por la aplicación controlada y dirigida de microorganismos o partes de
ellos.
En este contexto, se considera a la biotecnología como una actividad basada en conocimientos
multidisciplinarios, que utiliza agentes biológicos para hacer productos útiles o resolver problemas (Fig.
1.1). Esta definición engloba muchas de las actividades practicadas por ingenieros, químicos,
agrónomos, veterinarios, microbiólogos, biólogos, médicos, abogados, empresarios, economistas, etc.
Los productos y procesos biotecnológicos forman parte de nuestra vida cotidiana. Se trata de plantas
resistentes a enfermedades, plásticos biodegradables, detergentes más eficientes, biocombustibles,
procesos industriales menos contaminantes, además de centenas de ensayos de diagnóstico y
medicamentos nuevos.

Fig. 1.1. El campo de la biotecnología.

1.2. Los inicios de la biotecnología

En muchos sentidos la biotecnología es una ciencia antigua. Así, sin saber ni entender los principios
de la fermentación o de la genética, la humanidad ha estado utilizando algunos procesos biotecnológicos
desde tiempos antiguos, por ejemplo, en la producción de queso, pan, vino, cría selectiva de animales y
plantas, etc.

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1.3. La biotecnología moderna

El interés actual de la biotecnología reside en el potencial que supone la unión de procesos y
métodos biológicos (antiguos y nuevos) con las técnicas de la ingeniería química. De forma gráfica, se
podría representar la biotecnología moderna como un árbol que tiene por raíces las ciencias biológicas
(microbiología, genética, biología molecular, bioquímica) y cuyas ramas son la ingeniería química de
procesos en su acepción más amplia.
Entre los acontecimientos más importantes se destacan dos aspectos industriales de la
biotecnología moderna de la fermentación que sucedieron entre los años 1910-1914: en primer lugar, la
obtención de biomasa a partir de lodos activados y, en segundo lugar, la selección y propagación a gran
escala de cepas específicas de Clostridium para la producción de acetona y butanol. Estos dos procesos
se iniciaron en Manchester hace más de un siglo, y son paradigma del proceso biotecnológico en sentido
amplio y ejemplos de la industria biotecnológica. El nacimiento de la biotecnología moderna también
se asocia con el desarrollo en 1944, a escala industrial, de los procesos de fabricación de penicilina
(antibiótico) por métodos fermentativos.
Más tarde y hacia 1960, la moderna industria biotecnológica se planteó como objetivo el uso de
enzimas, las cuales son los principios activos de los microorganismos y en realidad los responsables de
las biorreacciones. Las primeras aplicaciones de las enzimas en la industria biotecnológica fueron la
fabricación de edulcorantes (por ejemplo, obtención de jarabe de fructosa a partir del trigo) y el empleo
de lipasas y proteasas en los detergentes para eliminar las manchas difíciles en los tejidos. Con la
utilización de enzimas específicas, muchas obtenidas de microorganismos manipulados genéticamente,
empieza la segunda generación de la biotecnología industrial o biotecnología moderna.

1.4. La última generación de la biotecnología

La biotecnología empieza a considerarse una ciencia moderna en los años ´70 por los avances en
biología molecular y genética. Estos avances desembocaron en las técnicas de clonación (para la
obtención de anticuerpos monoclonales) y ADN recombinante, que permitieron a los científicos un
mejor conocimiento de las funciones celulares y sus componentes en los seres vivos, e hicieron posible
el desarrollo de nuevos métodos para aislar células madre y genes de los organismos vivos para producir
in vitro productos de su metabolismo que antes sólo podían obtenerse a partir del organismo vivo.
La habilidad de manipular la información genética, con las técnicas del ADN recombinante, ha
derivado en la obtención de muchos productos farmacéuticos con enzimas y microorganismos de diseño,
como lo son la insulina, el interferón o los plásmidos activadores, que antes eran muy complicados o
caros de fabricar.
Además del campo de la salud, es importante destacar otras dos aplicaciones actuales de la
biotecnología que incluyen el uso de la ingeniería genética: la biorremediación y las tecnologías más
limpias. Tradicionalmente, los métodos para el tratamiento de los residuos tóxicos y orgánicos son a
menudo caros y pueden crear nuevas dificultades ambientales. La manipulación genética ha permitido
obtener microorganismos de baja peligrosidad y enzimas específicas para degradar y metabolizar
productos residuales tóxicos. Son ejemplos de técnicas de biorremediación la obtención de metano y
gases a partir de residuos sólidos urbanos, la digestión de residuos vegetales por bacterias, las
biodepuradoras, la obtención de biomasa a partir de subproductos orgánicos, la digestión de manchas
de petróleo por microorganismos, etc.
Por otra parte, actualmente, en diferentes sectores industriales se están aplicando técnicas
biotecnológicas para sustituir técnicas industriales ambientalmente peligrosas o contaminantes. Estas
nuevas técnicas utilizan microorganismos o enzimas para conseguir un proceso menos contaminante y
residuos más biodegradables. De esa forma, se reducen in situ los efectos nocivos de los residuos e,
incluso, su cantidad, y muchas veces también el gasto de agua y energía.

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1.5. Principales áreas biotecnológicas

Las áreas de la biotecnología se pueden clasificar según las técnicas utilizadas y de acuerdo a los
sectores de aplicación industrial. Estas son:
▪ ADN recombinante (ingeniería genética),
▪ cultivo de tejidos vegetales,
▪ cultivo de células de mamífero,
▪ biocatalizadores,
▪ tratamiento y reutilización de productos residuales (biorremediación),
▪ fermentaciones,
▪ obtención biotecnológica de combustibles y materia prima orgánica como alternativa al
petróleo,
▪ ingeniería de procesos biotecnológicos.

1.6. Críticas a la biotecnología

Algunos países se han opuesto a ciertos aspectos de la biotecnología, al igual que muchas
organizaciones ecologistas. Las críticas que se hacen a la biotecnología se basan en la incapacidad de
predecir lo que puede ocurrir al liberar organismos modificados genéticamente al medio ambiente, así
como en la posibilidad de que los nuevos genes que estos organismos transportan, puedan causar daños
si llegan o se trasladan a otros organismos vivos. Sin embargo, los defensores de estas técnicas
argumentan que la precisión de la ingeniería genética, comparada con las transferencias de genes que se
producen habitualmente en la naturaleza, reduce más de lo que incrementa dicho peligro. Además, los
comités oficiales que regulan la biotecnología en los diferentes países valoran cuidadosamente estos
riesgos antes de permitir que se lleve a cabo cualquiera de estos experimentos.

1.7. Erosión genética

La erosión genética en biodiversidad agrícola y ganadera es la pérdida de diversidad genética
incluyendo la pérdida de genes individuales y la pérdida de genes combinados (o genes complejos) como
los manifestados en las variedades tradicionales, adaptadas localmente. Las fuerzas principales que
causan la erosión genética de los cultivos son: el reemplazo de variedades, la limpieza de terrenos, la
sobreexplotación de especies, la presión poblacional, la degradación ambiental, sobreexplotación de
terrenos y pastizales, políticas y cambios en los sistemas agrícolas. El factor principal, sin embargo, es
el reemplazo de variedades locales por variedades o especies de alto rendimiento o exóticas. El número
de variedades también puede ser reducido dramáticamente cuando las variedades comerciales
(incluyendo organismos modificados genéticamente) son introducidas en los sistemas agrícolas
tradicionales.
Se cree que el mayor problema relacionado con el manejo de los agro-ecosistemas es la tendencia
general hacia la uniformidad genética y ecológica impuesta por el desarrollo de la agricultura moderna.

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Tema 2:

PROTEINAS Y ÁCIDOS NUCLEICOS

2.1. PROTEÍNAS
Todos los organismos están compuestos por agua y moléculas de diversos tipos, inorgánicas y
orgánicas. Entre estas últimas se encuentra un grupo de macromoléculas, las proteínas, que participan
en numerosas actividades, cumpliendo un papel fundamental para los seres vivos (Tabla 2.1).
A pesar de haber algunas diferencias en las proporciones de ciertos componentes, la composición
química de otros microorganismos o de las células eucariotas es comparable a la de una bacteria (Figura
2.1).

Tabla 2.1. Funciones de las proteínas en el organismo.

Función Ejemplos

Componentes estructurales Queratina del cabello, colágeno de la dermis, actina y miosina de

Sustancias de reserva
Acción catalítica
Otras
las fibras musculares.
Albúmina del huevo, caseína de la leche.
Enzimas que controlan las reacciones químicas celulares.
Transmisión de información (hormonas proteicas), participación en
los mecanismos de defensa (anticuerpos, citoquinas), transporte y
almacenamiento de pequeñas moléculas (hemoglobina).

Fig. 2.1. Composición química de una bacteria.

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2.1.1. Estructura de las proteínas

Las proteínas son macromoléculas formadas por 20 aminoácidos diferentes. Estos se caracterizan
por tener unido al carbono un grupo amino, un grupo carboxilo y un radical variable (Figura 2.2, A). La
presencia de un carbono asimétrico resulta en dos formas moleculares, L y D, que difieren en sus
propiedades ópticas. Los aminoácidos que forman parte de las proteínas corresponden a la forma L.
La reacción de condensación entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de otro
crea una unión peptídica (Figura 2.2, B). Al unirse varios aminoácidos se forma una cadena peptídica
caracterizada no solo por el número y tipo de aminoácidos que la componen, sino también por la
secuencia en que se encuentran (estructura primaria), lo que determina la función de la proteína. Debido
a las interacciones puente hidrógeno entre los grupos que forman los enlaces peptídicos, la cadena adopta
una estructura regular, generalmente en forma de hélice o de hoja (estructura secundaria). Las
interacciones entre las cadenas laterales de los aminoácidos causan el plegamiento de la cadena
polipeptídica, obteniéndose una configuración espacial determinada (estructura terciaria), inducida por
enlaces disulfuro covalente, puente hidrógeno e interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas. La asociación
entre varios polipéptidos determina la forma final de una proteína (estructura cuaternaria) (Figura 2.2,
C).

Fig. 2.2. Aminoácidos y proteínas.

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2.1.2. Desnaturalización de proteínas

Cuando la proteína no ha sufrido ningún cambio en su interacción con el disolvente, se dice que
presenta una estructura nativa (Figura 2.3). Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de
las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica
reducida a un polímero afuncional sin ninguna estructura tridimensional fija.
La desnaturalización provoca diversos efectos en la proteína:
▪ Cambios en sus propiedades hidrodinámicas: aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente
de difusión.
▪ Una drástica disminución de su solubilidad, ya que los residuos hidrofóbicos del interior
aparecen en la superficie, provocando frecuentemente la precipitación.
▪ Pérdida de las propiedades biológicas.

Estado nativo Estado desnaturalizado

Desnaturalización

Renaturalización

Fig. 2.3. Desnaturalización de proteínas.

Entre los agentes desnaturalizantes, se distinguen agentes físicos (calor, radiaciones) y químicos
(detergentes, disolventes orgánicos, pH, fuerza iónica).
Una proteína desnaturalizada cuenta únicamente con su estructura primaria. Por este motivo, en
muchos casos, la desnaturalización es reversible ya que es la estructura primaria la que contiene la
información necesaria y suficiente para adoptar niveles superiores de estructuración. El proceso
mediante el cual la proteína desnaturalizada recupera su estructura nativa se llama renaturalización. Esta
propiedad es de gran utilidad durante los procesos de aislamiento y purificación de proteínas, ya que no
todas las proteínas reaccionan de igual forma ante un cambio en el medio donde se encuentra disuelta. En
algunos casos, la desnaturalización conduce a la pérdida total de la solubilidad, con lo que la proteína
precipita. La formación de agregados fuertemente hidrofóbicos impide su renaturalización, y hacen que
el proceso sea irreversible.

2.2. ÁCIDOS NUCLEICOS

Los ácidos nucleicos participan en el almacenamiento, replicación, transcripción y trasferencia de
la información genética. Desde el punto de vista químico, los ácidos nucleicos (ácido ribonucleico y
desoxirribonucleico) son macromoléculas formadas a partir de unidades llamadas nucleótidos. Un
nucleótido resulta de la asociación, a través de uniones químicas covalentes, de tres tipos de elementos:
una molécula de fosfato, un azúcar de cinco carbonos (pentosa: ribosa o desoxirribosa) y una base cíclica
nitrogenada: adenina, citosina, guanina, timina o uracilo. Las cadenas se forman por unión covalente de
los nucleótidos entre los extremos 5´ y 3´, es decir, por enlaces fosfodiéster entre el grupo fosfato de un
nucleótido y el azúcar del siguiente nucleótido (Figura 2.4).

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Fig. 2.4. Composición de los ácidos nucleicos.

2.2.1. Ácido desoxirribonucleico (ADN)

El ADN está compuesto por dos cadenas de nucleótidos formando una doble hélice, que es una
figura parecida a una escalera caracol. En esa escalera, el fosfato y el azúcar son los pasamanos, y las
bases nitrogenadas, los escalones (Figura 2.5, A). Las cadenas son antiparalelas, es decir, si una va en
sentido 5´- 3´, la otra va en sentido 3´- 5´. Ambas cadenas están unidas entre sí por puentes de hidrógeno
entre las bases, y las uniones ocurren siempre entre adenina y timina (dos puentes), y entre citosina y
guanina (tres puentes). Por esto, cuando en una cadena la secuencia de bases es AGTACG, en la otra
será TCATGC. Esta complementariedad de bases es principio de la replicación del ADN.
En el momento de la división celular, cada célula hija contiene el complemento total de la
información genética. El ADN debe replicarse de forma precisa, lo cual se logra mediante la separación
de las dos hebras, y cada una de ellas puede servir como molde para la síntesis de una nueva molécula.
La autoduplicación del ADN entonces, significa la asociación de una cadena original con una nueva y
se dice que es semiconservativa (Figura 2.5, B).
El ADN se ve involucrado en los siguientes procesos:
▪ Replicación (ADN se copia para producir dos moléculas idénticas).
▪ Transcripción (se copian segmentos cortos de ADN para producir ARN mensajero).
▪ Traducción (la información presente en el ARNm se utiliza para producir proteínas).

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Fig. 2.5. Estructura de la molécula de ADN.

A. El apareamiento de las bases ocurre siempre entre una purina y una pirimidina: adenina y timina, guanina y citosina.
B. La duplicación del ADN da origen a dos moléculas iguales. El proceso de duplicación involucra a numerosas enzimas,
y en es mucho más complejo de lo que se muestra en el esquema.

2.2.2. Ácido ribonucleico (ARN)

El ARN por lo general es una molécula lineal y monocatenaria (de una
sola cadena), constituida por ribonucleótidos (Figura 2.6). La diferencia
con el ADN se basa en su constitución, ya que el ARN posee una base
nitrogenada distinta (uracilo) a la timina y se compone de un azúcar
diferente a la desoxirribosa (ribosa). Aparte de ello, el ADN posee una
doble hélice en su estructura.
El ARN cumple con numerosas funciones, siendo la más importante la
síntesis de proteínas, en la que copia el orden genético contenido en el ADN
para emplearlo de patrón en la fabricación de proteínas necesarias para la
célula y el organismo. El ARN es el encargado de leer el código genético,
interpretarlo y materializarlo.
Existen varios tipos de ARN, dependiendo de su función primordial,
implicados en la síntesis de proteínas: ARN mensajero (ARNm), ARN de
transferencia (ARNt) y ARN ribosómico o ribosomal (ARNr).
Fig. 2.6. Estructura del ARN.

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2.3. EL CÓDIGO GENÉTICO

El funcionamiento de una célula depende, fundamentalmente, de dos tipos de moléculas: los ácidos
nucleicos y las proteínas. Ambas están relacionadas, ya que la estructura primaria de un polipéptido está
codificada por un gen, o sea, un segmento de ADN. El código genético es simple, a cada triplete de
bases le corresponde un aminoácido (Tabla 2.2).
Algunos aminoácidos están codificados por un único triplete, como el triptofano (UGG) o la
metionina (AUG) mientras que otros admiten sinonimia, como la prolina que está codificada por varios
codones (CCU, CCC, CCA, CCG). El inicio de la secuencia está indicado por el codón AUG,
correspondiente a la metionina, un aminoácido que en general es removido posteriormente. Los codones
UAA, UAG o UGA, que significan stop señalizan el fin de la secuencia, y se denominan codones sin
sentido.
Un cambio en la secuencia de bases del ADN puede tener como consecuencia la sustitución de un
aminoácido por otro. Por ejemplo, si el triplete GUG fuera reemplazado por CGU en el péptido, la valina
sería sustituida por leucina. Pero, dada la sinonimia existente en el código, si el triplete GUG fuera
sustituido por GUA o GUC, el aminoácido codificado continuaría siendo valina. Las pérdidas o
inserciones de una base modifican el resto de la secuencia del péptido, debido a mutaciones puntuales
que son pequeños cambios que ocurren en el ADN.

Tabla 2.2. El código genético.

2.3.1. La expresión génica y la síntesis de proteínas

La información codificada en el ADN se transcribe a una molécula mensajera que la lleva hasta los
ribosomas, donde las instrucciones serán traducidas del lenguaje de los ácidos nucleicos al lenguaje de
las proteínas, formándose el péptido correspondiente. De este modo, se establece en la célula un flujo
de información genética que sigue un sentido único: del ADN al ARN, y del ARN al péptido. Esto se
observa en detalle en la Figura 2.7.

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La transcripción es el primer paso de la expresión génica, en el que un segmento de ADN es

transcrito al ARNm. En células eucariotas tiene lugar en el núcleo. La enzima que se encarga de
controlar la transcripción es la ARN polimerasa, la cual deshace la hélice de ADN y sintetiza una cadena
simple de ARNm usando como molde la hebra de ADN. La enzima reconoce las secuencias de inicio y
de parada codificadas en el ADN y transcribe el contenido entre esas regiones.
La traducción es el segundo paso de la expresión génica y en eucariotas ocurre en el citoplasma,
donde los ribosomas leen el código del ARNm, transcrito en tripletes de bases (codones)
complementarios a un segmento de una de las dos hebras del ADN, y lo descodifican para sintetizar
proteínas. Los ribosomas son complejos macromoleculares compuestos por dos subunidades (mayor y
menor), ambas formadas ARNr y proteínas específicas. Estas subunidades se unen en presencia de
cadenas de ARNm y llevan a cabo la síntesis de proteínas con la ayuda del ARNt.
Cada ARNt se une a un lugar específico del ribosoma. En un extremo de su molécula poseen un
anticodón formado por un triplete de bases, que se une al codón complementario del ARNm mediante
puentes de hidrógeno. En otro extremo del ARNt, se encuentra unido un aminoácido específico, el cual
será transferido al polipéptido en formación. El ARNr es el componente catalítico, encargado de crear
los enlaces peptídicos entre esos aminoácidos del polipéptido.
En las células procariotas (bacterias) no hay núcleo y la transcripción tiene lugar directamente en
el citoplasma, junto con la traducción, por lo que la síntesis de proteínas puede ser extremadamente
rápida.

Fig. 2.7. Expresión génica en eucariotas.

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2.3.2. La regulación génica

La expresión génica puede suceder constantemente a través de genes constitutivos, que son
aquellos que codifican sistemas enzimáticos que se necesitan siempre para la actividad normal de la
célula (correcto funcionamiento y mantenimiento de las funciones celulares como también en los
procesos metabólicos de un organismo). O bien, por genes regulables cuya expresión se induce o
reprime, en respuesta a las condiciones ambientales. Una bacteria puede tener aproximadamente 2500
genes, que no funcionan todos al mismo tiempo. Por ejemplo, si hay lactosa en el medio (y falta glucosa),
las bacterias sintetizan las enzimas que permiten su utilización. Esto se ve facilitado por operones, que
consisten en uno o más genes del ADN, que son encendidos o apagados para codificar las proteínas
necesarias para una función específica.

2.3.3. Mutaciones
Las mutaciones son perturbaciones en el código genético y que, consecuentemente, ocasionan
cambios en la regulación o funcionamiento de las proteínas. Si bien los procesos de replicación del
material genético son muy precisos, y aun cuando diferentes sistemas celulares inician mecanismos de
reparación del ADN, si éste se daña; pueden originarse mutaciones por errores en la replicación del
ADN o durante la reparación del ADN dañado.
Las mutaciones se pueden clasificar como cromosómicas o puntuales. Las primeras son
alteraciones en el número o estructura de los cromosomas, dando lugar a errores en la transmisión
hereditaria de cromosomas completos y, por lo tanto, puede causar la pérdida, ganancia o ruptura de
éstos. Por otro lado, las mutaciones puntuales son cambios pequeños a nivel de los nucleótidos, pudiendo
alterar el sentido del código genético. Un cambio en la secuencia de nucleótidos puede resultar en la
síntesis de una proteína con un aminoácido diferente o una proteína trunca si el cambio es de un codón
con sentido a uno sin sentido, causando la ausencia o disminución de la actividad proteica particular.
Sin embargo, algunas mutaciones no producen ningún cambio debido a la sinonimia de codones.
Las mutaciones pueden surgir espontáneamente o inducidas por agentes mutagénicos, que pueden
ser químicos o físicos (luz UV, rayos X).

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Tema 3:

TECNOLOGÍA ENZIMÁTICA

3.1. ENZIMAS
Las enzimas son proteínas que actúan como catalizadores biológicos con gran especificidad y
eficiencia termodinámica. Hace siglos que éstas se utilizan, en particular para la producción de
alimentos, y representan una de las formas más antiguas de la biotecnología. La utilización de enzimas
tiene gran importancia también en la producción de sustancias químicas, en sistemas analíticos y de
diagnóstico, en el tratamiento de enfermedades y en la emergente industria de las tecnologías limpias.
La utilización de las enzimas en todos estos campos ha sido posible gracias al conocimiento de su
función en los sistemas metabólicos de los seres vivos, así como de su estructura y, sobre todo, a la
posibilidad de obtener enzimas de diseño a través de la manipulación genética de los microorganismos.
Esto ha dado lugar a que muchas empresas se dediquen a la producción de enzimas, de origen
microbiano, a gran escala.
Las enzimas actúan de acuerdo con los mismos principios generales que los demás catalizadores:
aumentan la velocidad de las reacciones químicas, combinándose temporalmente con los reactivos de
manera que éstos alcanzan un estado de transición con una energía de activación menor que el de la
reacción no catalizada. Cabe destacar que las enzimas son mucho más eficaces que los catalizadores
químicos, ya que a temperatura en torno a los 37 °C producen un aumento de la velocidad de reacción
de entre 107 y 1014 veces. Además, presentan un alto grado de especificidad química, es decir, son
capaces de inducir la transformación de un sólo tipo de moléculas y no de otros que también se
encuentran presentes en el medio de reacción. Un enzima es capaz de discriminar entre dos sustancias
que potencialmente podrían actuar como sustratos (reactivos).

3.1.1. Cofactores enzimáticos

Muchas enzimas requieren de un componente no proteico llamado cofactor para llevar a cabo su
actividad catalítica. Los iones metálicos (cationes mono o divalentes) pueden actuar como cofactores
enzimáticos, otorgándole la capacidad catalítica a la enzima, o bien actuando como agente estabilizador
de la conformación nativa del enzima. Otro grupo de cofactores son los compuestos orgánicos derivados
del grupo de las vitaminas B.
Los cofactores que se encuentran fuertemente unidos a la enzima se denominan grupos prostéticos.
La enzima que contiene el cofactor o grupo prostético se conoce como holoenzima (catalíticamente
activa), en tanto que en ausencia de cofactor la enzima resulta catalíticamente inactiva y recibe el nombre
de apoenzima. Compuestos orgánicos de naturaleza no proteica tales como NAD, NADP, ATP, pueden
unirse de forma débil a la enzima creando un equilibrio entre la apoenzima y el cofactor. Estos cofactores
comúnmente se conocen como coenzimas.

3.1.2. Inactivación de la actividad enzimática

Las enzimas presentan todos los rasgos estructurales y propiedades químicas que caracterizan a las
proteínas. En efecto, pierden su actividad catalítica cuando sufren desnaturalización por efecto de los
mismos agentes que afectan a las demás proteínas; la conformación tridimensional nativa intacta de la
proteína enzimática resulta indispensable para que ésta desempeñe su función. Entre los diferentes
factores ambientales pueden afectar a la actividad enzimática, se destacan: el pH y la temperatura (Figura
3.1).

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 BIOTECNOLOGÍA

Efecto del pH. La mayoría de las enzimas presentan un pH óptimo para el cual su actividad es
máxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye bruscamente. Esto se debe a que, al
ser las enzimas de naturaleza proteica, al igual que otras proteínas, se desnaturalizan y pierden su
actividad si el pH varía más allá de ciertos límites. De ahí la conocida importancia biológica de los
sistemas buffer. En la mayor parte de los casos el pH óptimo está próximo a la neutralidad, en
consonancia con el pH intracelular, pero existen enzimas con pH óptimo muy diverso según sea el pH
del medio en el que habitualmente actúan (las enzimas proteolíticas del jugo gástrico tienen pH óptimo
próximo a 2 ya que este es el pH de dicho jugo).
Efecto de la temperatura. Al igual que ocurre con la mayoría de las reacciones químicas, la
velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incrementa con la temperatura. Sin embargo, se
produce un brusco descenso de la actividad cuando se alcanza una temperatura crítica a consecuencia
de la desnaturalización térmica de la enzima. El óptimo puede estar entre 40-50 °C.

Fig. 3.1. Efecto del pH y la temperatura en la actividad enzimática.

3.2. CINÉTICA ENZIMÁTICA

Las enzimas presentan una cavidad en su superficie formada por aminoácidos “reactivos”, que se
ubican próximos entre sí como consecuencia del plegamiento característico de la cadena polipeptídica,
constituyendo un sitio activo. A través de éste las enzimas interactúan con el sustrato, mediante un
acoplamiento espacial (las superficies moleculares de ambos tienen formas complementarias) y químico
(poseen grupos funcionales que pueden establecer interacciones débiles entre sí). Tanto la actividad
catalítica como el elevado grado de especificidad química que presentan las enzimas, residen en esta
interacción específica entre la enzima y su sustrato.
Por lo tanto, en una reacción enzimática, la enzima y el sustrato se combinan de modo transitorio
para formar un complejo enzima-sustrato (Figura 3.2), estado en el cual la reacción se lleva a cabo para
dar lugar a los productos y a la enzima libre. Esto se puede escribir de la siguiente forma:

E + S → [ES] → E + P

Fig. 3.2. Mecanismo de la actividad enzimática.

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3.2.1. Modelo de Michaelis-Menten

Las reacciones catalizadas por enzimas exhiben una cinética de saturación. Cuando se mide la
velocidad inicial de una reacción sucede que, a bajas concentraciones de sustrato, la velocidad de
reacción es proporcional a dicha concentración, como ocurre generalmente para las reacciones no
enzimáticas. A medida que la concentración de sustrato aumenta, la velocidad de reacción ya no es
proporcional a ésta. A concentraciones aún mayores, la velocidad de reacción es independiente de la
concentración del sustrato y se aproxima asintóticamente al valor de la velocidad máxima que es
característico de cada enzima (Figura 3.3). Se dice entonces que el enzima se halla saturada por el
sustrato.
La concentración de sustrato a la cual la reacción alcanza la mitad de su velocidad máxima se
conoce con el nombre de KM (constante de Michaelis-Menten). Es un valor característico de cada enzima
y representa la afinidad de la enzima por el sustrato: valores bajos de KM indican una alta afinidad
mientras que valores altos representan una baja afinidad.

Fig. 3.3. Velocidad de reacción en función de la concentración de sustrato.

La hipótesis del complejo enzima-sustrato explica satisfactoriamente el efecto de saturación de la

enzima por el sustrato observado en los estudios de cinética enzimática: cuando la concentración de
sustrato es muy superior a la concentración de la enzima en el medio de reacción, todos los sitios activos
de las moléculas de enzima se hallan ocupados en un momento dado por moléculas de sustrato, con lo
que aumentos posteriores de la concentración de éste no se traducen en aumentos en la velocidad de
reacción. Una concentración de sustrato veinte veces mayor que KM se considera suficiente para obtener
una aproximación válida de la velocidad máxima de reacción.
La ecuación de Michaelis-Menten (Ec. 3.1) es utilizada para describir el efecto de las distintas
concentraciones de sustrato sobre la velocidad de reacción de una reacción enzimática típica.

[S]
v = Vmáx . (Ec. 3.1)
K M + [S]

Ahora bien, en una curva hiperbólica, es difícil determinar con precisión los valores de las
constantes KM y Vmáx, por lo que se recurre a la ecuación de Lineweaver-Burk (Ec. 3.2), la cual es una
de las formas linealizadas más frecuentemente empleada de la ecuación de Michaelis-Menten, que
implica tomar los recíprocos de ambos lados de la ecuación 3.1.

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1 K M + [S] KM [S]
= = +
v Vmáx . [S] Vmáx . [S] Vmáx . [S]

1 KM 1 1
= . + (Ec. 3.2)
v Vmáx [S] Vmáx

En una representación gráfica de 1/V en función de 1/[S] se obtiene una línea recta, cuya pendiente
es KM/Vmáx, el punto de corte con el eje de las ordenadas equivale a 1/Vmáx y el corte con el eje de las
abscisas es igual a -1/KM (Figura 3.4). En dicha gráfica se pueden medir directamente los valores de KM
y Vmáx.

Fig. 3.4. Gráfica de Lineweaver-Burk.

3.3. INHIBICIÓN DE REACCIONES ENZIMÁTICAS

Existen una serie de sustancias, llamadas inhibidores, que anulan o disminuyen la actividad de las
enzimas y están implicados en la regulación del metabolismo celular. Muchos medicamentos actúan
como inhibidores enzimáticos, puesto que el bloqueo de una enzima puede matar a un agente patógeno o
corregir un desequilibrio metabólico. También son usados como herbicidas y pesticidas.
La unión de un inhibidor con la enzima puede impedir la entrada del sustrato al sitio activo de ésta
y/o dificultar que la enzima catalice su reacción correspondiente. Dicha unión puede ser reversible o
irreversible. Normalmente, los inhibidores irreversibles se combinan de modo permanente con la
enzima, modificando su estructura química al unirse covalentemente a algún grupo funcional esencial
para la catálisis. En cambio, los inhibidores reversibles se combinan (temporalmente) de forma no
covalente con la enzima, dando lugar a diferentes tipos de inhibiciones, según si el inhibidor se une a la
enzima libre, al complejo enzima-sustrato o a ambos.

3.3.1. Inhibición competitiva

El inhibidor es una molécula con estructura química y espacial análoga a la del sustrato, de manera
que puede competir con él por acceder al sitio activo de la enzima (Figura 3.5). El inhibidor forma con
la enzima libre un complejo enzima-inhibidor que no puede descomponerse para la generación de los
productos. Este tipo de inhibición se puede revertir con concentraciones suficientemente altas del
sustrato, es decir, dejando fuera de competición al inhibidor. En consecuencia, el valor de Vmáx no se
verá modificado, mientras que en presencia del inhibidor, el valor de KM aumentará mostrando que la
enzima tendrá cada vez menos afinidad por el sustrato.

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 BIOTECNOLOGÍA

Fig. 3.5. Esquema de la inhibición competitiva.

3.3.2. Inhibición no competitiva

El inhibidor se puede unir a la enzima libre o bien con el complejo enzima-sustrato, interfiriendo
en la acción de ambos (Figura 3.6). Los inhibidores no competitivos se unen a un sitio de la enzima
diferente al sitio activo, provocando en éste un cambio conformacional que no permitirá la formación
del complejo enzima-sustrato, o bien si se unen al complejo ES no permitirá la descomposición de éste
para dar lugar a los productos. La unión con el inhibidor produce dos formas inactivas: los complejos
EI y ESI. En consecuencia, el valor de KM permanecerá constante dado que el sustrato no compite con
el inhibidor por el sitio activo, mientras que el valor de Vmáx disminuirá en presencia del inhibidor.

Fig. 3.6. Esquema de la inhibición no competitiva.

3.3.3. Modelo de Michaelis-Menten para inhibición enzimática

A continuación, se presentan las representaciones gráficas de Michaelis-Menten (Figura 3.7) y de
Lineweaver-Burk (Figura 3.8) para cada tipo de inhibición, donde se puede observar la variación de las
constantes KM y Vmáx en reacciones con y sin inhibidor.

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 BIOTECNOLOGÍA

Fig. 3.7. Gráfica de Michaelis-Menten para inhibición competitiva y no competitiva.

Fig. 3.8. Gráfica de Lineweaver-Burk para inhibición competitiva y no competitiva.

En el caso de la inhibición competitiva, la ecuación de Michaelis-Menten puede escribirse como:

[S]
v = Vmáx . (Ec. 3.3)
K MI + [S]

[I]
donde: K MI = K M . (1 + )
KI

Para la inhibición no competitiva:

[S]
v = Vmáx I . (Ec. 3.4)
K M + [S]

Vmáx
donde: Vmáx I =
[I]
(1 + )
KI

Es importante destacar, que hay ciertas enzimas alostéricas que no siguen la cinética de Michaelis-
Menten. Son enzimas que poseen varios sitios alostéricos específicos para la unión de sustratos, además
del sitio activo. Comúnmente exhiben una cinética sigmoidal y son importantes en la regulación de los
procesos metabólicos.

17
 BIOTECNOLOGÍA

Tema 4:

METABOLISMO CELULAR

4.1. Catabolismo y anabolismo

El conjunto de las reacciones químicas que ocurren dentro de la célula se denomina metabolismo,
y a las moléculas de estas reacciones se las conoce como metabolitos. El metabolismo se divide en dos
categorías principales: el catabolismo, que implica reacciones de degradación y generadoras de energía,
y el anabolismo cuyas reacciones se relacionan con la biosíntesis y el consumo de energía. Si bien dichos
procesos son contrarios, los dos funcionan de manera simultánea e interdependiente (Figura 4.1). Por
ejemplo, la división celular, el movimiento y la ósmosis, son procesos celulares que dependen de la
disponibilidad de energía y de varios compuestos simples, así como de la unión entre el catabolismo y
el anabolismo.
Durante el catabolismo, suceden reacciones catalizadas por enzimas, donde las macromoléculas
como lípidos, hidratos de carbono y proteínas que el organismo obtiene del entorno en el que vive o de
sus propias sustancias de reserva, se oxidan a moléculas sencillas. Sin embargo, estas transformaciones
químicas no ocurren en un solo paso, sino que se generan compuestos intermediarios que no tienen otra
función celular más que formar parte de una secuencia de reacciones (vía) que liberan energía. La
energía que se libera durante el catabolismo, una parte será almacenada en forma de ATP (adenosina
trifosfato), que son compuestos que contienen grupos fosfato unidos por un enlace fosfoéster de alta
energía, y la restante se disipará como calor.
Por el contrario, durante el anabolismo, precursores sencillos se convierten mediante reacciones
enzimáticas de reducción en moléculas complejas. Las reacciones catabólicas aportan las materias
primas y la energía necesaria para las reacciones anabólicas. Este acoplamiento de reacciones que
liberan energía y otras que requieren energía es posible gracias al ATP.

Fig. 4.1. Unión entre el catabolismo y anabolismo.

18
 BIOTECNOLOGÍA

Cuando hay hidratos de carbono en el medio, es común que éstos sean hidrolizados a unidades de
glucosa por enzimas extracelulares, debido a que es el compuesto base que se metaboliza para formar
los demás componentes celulares. Sin embargo, hay otras moléculas (aminoácidos, ácidos grasos) que
pueden entrar en determinados puntos de la vía catabólica de la glucosa, convergiendo para la
producción de energía y de pequeñas moléculas simples (CO2, H2O y NH3). Inversamente, algunos de
los compuestos intermediarios del catabolismo son los puntos de partida de vías anabólicas. Ahora bien,
las vías metabólicas no son reversibles: la vía seguida en la degradación de una sustancia es diferente a
la vía de síntesis correspondiente, pudiendo inclusive ocurrir en compartimientos celulares diferentes.
Esta separación facilita la regulación enzimática del metabolismo, que ocurre con el menor desperdicio
de materia y energía.
Es necesario destacar que, además del ATP que actúa como molécula transportadora de energía,
otras coenzimas son esenciales en el metabolismo celular. Entre ellas, la nicotinamida adenina
dinucleótido (NAD en su forma oxidada y NADH en su forma reducida) participa en las reacciones
redox como transportadora de electrones (e-) de una reacción a otra. Esta coenzima se encuentra en sus
dos formas en las células: NAD y NADH. El NAD, que es un agente oxidante, acepta e- de otras
moléculas y se reduce a NADH, que puede ser utilizado entonces como agente reductor para donar e-.
Estas reacciones de transferencia de e- son la principal función del NAD que permiten la generación de
energía (ATP) de todas las células.
Otra coenzima que interviene en numerosas vías metabólicas es la nicotinamida adenina
dinucleótido fosfato (NADP en su forma oxidada y NADPH en su forma reducida), que proporciona
parte del poder reductor necesario para las reacciones de reducción de la biosíntesis.

4.2. Glucólisis y fermentación

La glucólisis es el primer paso en la degradación de la glucosa para la producción de energía para
el metabolismo celular. Esta ruta involucra la oxidación de la glucosa hasta dos moléculas de ácido
pirúvico (piruvato), obteniendo como ganancia neta dos moles de ATP. Es un proceso anaeróbico que
tiene lugar en el citoplasma de todas las células vivas.
Normalmente, el piruvato no se acumula en las células, sino que se oxida parcialmente a un gran
número de compuestos orgánicos mediante la fermentación. Este proceso también es anaeróbico, y de
acuerdo al tipo de microorganismo y condiciones ambientales presentes, se generan sustancias como
acetona, butanol, etanol, ácido láctico, ácido acético, etc. La fermentación y la glucólisis son dos pasos
importantes en la generación de energía. La glucólisis puede existir sin la fermentación, debido a que es
un requisito previo de esta última, por lo que, la fermentación asegura la continuidad de la glucólisis en
ciertas situaciones.
Los procesos fermentativos conjuntamente con la biocatálisis son las formas más antiguas de la
biotecnología. La fermentación es la aplicación del metabolismo microbiano para transformar una
materia en productos de valor añadido. Este proceso puede producir una increíble variedad de sustancias
útiles, por ejemplo: ácido cítrico, antibióticos, biopolímeros, proteínas unicelulares, etc. El potencial es
inmenso y muy variado. Solamente es necesario conocer el microorganismo adecuado, controlar su
metabolismo y crecimiento, y poderlo utilizar a gran escala.

4.3. Respiración y ciclo de Krebs

La ruta glucolítica puede continuar de dos maneras diferentes: en ausencia de oxígeno, tal como
ya se mencionó anteriormente, se produce la fermentación, mientras que, si hay oxígeno en el medio,
las moléculas terminarán su oxidación en la cadena respiratoria. Del mismo modo que la fermentación,
la respiración es una las principales vías del catabolismo. Sin embargo, estos procesos difieren tanto en

19
 BIOTECNOLOGÍA

la cantidad de energía liberada como en si los productos finales resultan de la oxidación total o parcial
del piruvato (Figura 4.2).
En presencia de oxígeno, el piruvato generado en la glucólisis entra en el ciclo de Krebs que
conjuntamente con la cadena respiratoria (fosforilación oxidativa) permiten su oxidación total a CO2 y
H2O, liberando una gran cantidad de energía como ATP (36-38 moles) y aportando muchos
intermediarios necesarios para las rutas biosintéticas.

Fig. 4.2. Respiración y fermentación.

En la respiración, el último aceptor de e- es el O2, pero éste no participa directamente del ciclo.
Los e- obtenidos en las sucesivas oxidaciones del ciclo de Krebs se utilizan para formar coenzimas como
el NADH, que luego entrarán en la cadena transportadora de e-, donde allí se produce el ATP y se
requiere O2. No obstante, el NADH necesita oxidarse a NAD para nuevamente participar del ciclo de
Krebs, por lo que libera e- que irán pasando por una serie de transportadores (reacciones redox) hasta el
O2 que se reduce para formar H2O. Ese traspaso de e- libera una cierta cantidad de energía que da lugar
a la generación de ATP (Figura 4.3).

Fig. 4.3. Ciclo de Krebs y la cadena respiratoria.

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 BIOTECNOLOGÍA

4.4. Vía de la pentosa fosfato

Muchas células poseen otra vía para la degradación de la glucosa, la cual se relaciona no tanto con
la generación de energía (NADH y ATP), sino con la formación de poder reductor, es decir, compuestos
intermediarios como el NADPH que sirve como donador de e- en las reacciones de biosíntesis. Esta vía
es muy activa en los tejidos donde se lleva a cabo la síntesis de ácidos grasos, tales como glándula
mamaria, tejido adiposo, corteza suprarrenal e hígado.
Además, la vía de la pentosa fosfato se encarga de producir ribosa, que es una pentosa de gran
importancia biológica por ser uno de los principales componentes del ARN. Por lo que, en otras células
como las de los músculos y las del cerebro, esta ruta metabólica tiene como función principal la
formación de ribosa para la biosíntesis de nucleótidos. Por ejemplo, el ARN debe rehacerse
constantemente debido a la síntesis de proteínas, por lo tanto, la demanda de azúcares es continua para
que las reacciones bioquímicas tengan lugar.

4.5. Vías anapleróticas

El ciclo de Krebs funciona, no sólo como un proceso generador de energía, sino también es muy
importante en el suministro de precursores para las vías anabólicas. La remoción de estos compuestos
del ciclo de Krebs detendría finalmente el ciclo; sin embargo, existen procesos enzimáticos por medio
de los cuales se puede reponer a esos compuestos intermediarios. Estas vías se conocen como
anapleróticas.

4.6. Metabolismo primario y secundario

Existen vías metabólicas primarias, que son comunes a todos los microorganismos, y vías
metabólicas secundarias específicas. La activación de unas u otras depende del microorganismo y de las
condiciones ambientales en que crece. Los metabolitos primarios están relacionados con el crecimiento
celular y la transformación de los nutrientes en biomasa (división celular); los principales ejemplos son
el etanol, el ácido láctico y los aminoácidos. En cambio, los metabolitos secundarios no son necesarios
para el metabolismo celular, pero permiten la supervivencia en ambientes extremadamente
competitivos, donde los nutrientes son escasos. Son ejemplos de éstos los antibióticos, los alcaloides,
los pigmentos y algunas enzimas y toxinas.
Cuando un medio de crecimiento con cantidad limitada de nutrientes se inocula con células, la
población pasa por diversas fases (Figura 4.4):

Fig. 4.4. Fases del crecimiento celular.

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 BIOTECNOLOGÍA

▪ Fase lag o de latencia: ocurre inmediatamente después de la inoculación. Es un período de

adaptación en el que, a pesar de que no ocurre la división celular, se sintetizan enzimas y otros
compuestos celulares requeridos para la evolución en este nuevo medio.
▪ Fase log o logarítmica: la población celular crece de manera exponencial a velocidad constante,
consumiendo los nutrientes continuamente y sintetizando numerosos metabolitos primarios.
▪ Fase estacionaria: debido al agotamiento de los nutrientes, a la acumulación de productos
tóxicos de excreción, y/o al cambio en las condiciones físicas del medio, algunas células mueren
mientras que otras logran dividirse, por lo que no hay crecimiento neto. Hacia el final de la fase
log y el inicio de la fase estacionaria comienzan a sintetizarse los metabolitos secundarios.
▪ Fase de declinación o muerte: sin la renovación de los nutrientes, la velocidad de muerte o lisis
celular será mayor que la de crecimiento, provocando la disminución de la densidad de células.
Los nutrientes del medio permiten el crecimiento celular y la formación de metabolitos primarios,
que pueden ser utilizados por las células para sintetizar metabolitos secundarios o bien, éstos pueden
sintetizarse también directamente a partir de alguna sustancia del medio. Para desarrollar un bioproceso
se deberá elegir al microorganismo en función de sus vías metabólicas, y las condiciones de cultivo
dependerán de si el producto deseado es un metabolito primario o uno secundario.

22
 BIOTECNOLOGÍA

Tema 5:

INGENIERÍA GENÉTICA

5.1. LA BIOTECNOLOGÍA MODERNA

La biología molecular ha hecho posible el hallazgo más importante de la biotecnología: mediante
la tecnología del ADN recombinante, hoy se puede separar el gen responsable de codificar la producción
de ciertas sustancias y transferirlo a otro organismo hospedador, consiguiendo así producir más
eficientemente ciertas proteínas útiles. Gracias a este avance, en la actualidad se producen
biotecnológicamente y a gran escala hormonas, vacunas, factores de coagulación de la sangre y enzimas.
Esta área de la biotecnología ofrece asimismo la posibilidad de obtener nuevas proteínas. Por
ejemplo, la producción de enzimas como biocatalizadores, en los cuales su capacidad específica está
gobernada por la estructura molecular, y por medio de la técnica del ADN recombinante se pueden
modificar selectivamente los genes que codifican la síntesis celular de enzimas, y obtenerse una nueva
cepa productora de la enzima deseada.

5.2. TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

La tecnología del ADN engloba una serie de procedimientos para extraer, cortar, sintetizar, marcar,
identificar, amplificar y secuenciar el ADN. Con estas técnicas se logra la captación de un fragmento de
ADN de una fuente conocida y su introducción en vectores, que son vehículos para el transporte de
determinados genes hacia las células vivas, y que probablemente tienen la habilidad de insertarse en el
genoma celular para realizar cambios permanentes.
La extracción del ADN es un procedimiento relativamente simple. De modo general, la ruptura de
paredes y membranas de la célula libera el contenido celular, del cual se eliminan el ARN y las proteínas
del ADN, que precipita con alcohol. Una vez extraído y purificado, el ADN se trata para aislar el gen
de interés, mediante el uso de tijeras moleculares denominadas endonucleasas de restricción.

5.2.1. Endonucleasas de restricción

Las endonucleasas de restricción son herramientas imprescindibles en biología molecular,
ingeniería genética y biotecnología. Son enzimas capaces de cortar el ADN en sitios específicos, al
reconocer determinadas secuencias de nucleótidos (de 4 a 8 bases). El mecanismo del corte del ADN se
realiza a través de la ruptura de dos enlaces fosfodiéster en la doble hebra, lo que da lugar a dos tipos de
extremos. Estos pueden ser romos, si el corte se produce a lo largo del eje de simetría de la doble hebra;
o cohesivos, cuando el corte ocurre de manera escalonada (Figura 5.1). Estos últimos resultan muy útiles
por su tendencia a unirse de modo espontáneo a otros extremos coincidentes, mediante interacciones
por puente hidrógeno entre bases complementarias. Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo
pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas (Figura 5.2).

Fig. 5.1. Extremos romos y cohesivos.

23
 BIOTECNOLOGÍA

Fig. 5.2. Unión de extremos cohesivos.

5.2.2. Vectores de clonación

El ADN fragmentado por las enzimas de restricción, posteriormente debe estudiarse, y para ello es
necesario disponer de muchas copias del mismo. El proceso de amplificación se conoce como clonación
y se lleva a cabo insertando el fragmento de ADN que ha de amplificarse en vectores, que son
determinadas moléculas portadoras de ADN capaces de reproducirse autónomamente.
Los vectores utilizados en las técnicas de clonación son diversos y su elección depende de las
dimensiones y cantidad de ADN que puedan producir. A continuación, se describen algunos de ellos
como son los plásmidos y los bacteriófagos.

- Plásmidos:
Además de su ADN cromosómico de longitud aproximadamente igual a cuatro millones de pares
de bases, las bacterias poseen pequeñas moléculas de ADN circular llamadas plásmidos, integradas por
unos pocos miles de pares de bases. Los plásmidos son portadores de genes que confieren a las bacterias
su resistencia a antibióticos, así como de un origen de replicación que permite duplicarse en el interior
de las bacterias de manera autónoma respecto del ADN bacteriano principal.
La estrategia básica para la clonación del ADN en un plásmido (Figura 5.3), consiste en utilizar la
misma enzima de restricción para cortar tanto el fragmento de ADN que ha de amplificarse, como el
plásmido en que dicho ADN ha de insertarse. Se forman así dos moléculas con extremos cohesivos
compatibles que pueden asociarse por complementariedad de las bases. Luego, se procede a una reacción
en la que los dos tipos de moléculas de ADN, en presencia de la enzima ADN ligasa, se enlazan una con
otra. Este procedimiento produce plásmidos recombinantes, los cuales se insertan luego en células
bacterianas huésped mediante un proceso llamado transformación celular. En condiciones de
crecimiento adecuadas, la célula bacteriana huésped se duplica y genera millones de células, cada una
de las cuales contiene varios ejemplares del plásmido recombinante. Además, dado que los plásmidos
recombinantes son portadores de resistencia a un determinado antibiótico, se puede utilizar un medio de
cultivo que contenga el antibiótico para seleccionar únicamente aquellas células bacterianas que poseen
las moléculas de ADN recombinante. Los plásmidos hacen posible el ligamiento de fragmentos de ADN
extraño (exógeno) de una longitud del orden de los 10.000 pares de bases.
En consecuencia, para que resulte utilizable en la amplificación de fragmentos de ADN exógeno,
un vector plasmídico debe poseer ciertas características: la presencia en su ADN de una secuencia que
le confiera la capacidad de autoreplicarse; la presencia de un gen que lo haga resistente a un antibiótico
para poder seleccionar los clones de células bacterianas que contengan los plásmidos; y, por último, la

24
 BIOTECNOLOGÍA

presencia de secuencias de reconocimiento por parte de enzimas de restricción para poder integrar los
fragmentos de ADN exógeno.

Fig. 5.3. Clonación de un fragmento de ADN en plásmidos.

- Bacteriófagos:
Otro tipo de vectores utilizados son los bacteriófagos (fagos) dado a las reducidas dimensiones de
su genoma y su facilidad de crecimiento in vitro. Éstos son virus que necesitan células viables para poder
replicarse, por lo que infectan bacterias para replicarse en su interior. Uno de los bacteriófagos más
famosos es el fago lambda de la bacteria E. coli. Su genoma está constituido por una única molécula de
ADN circular de doble hélice, integrada por 49.000 pares de bases. Los fagos pueden contener hasta
15.000 pares de bases de ADN exógeno para su clonación, siendo posible insertar fragmentos de ADN
exógeno mayores que los contenidos en los plásmidos. La estrategia de clonación es conceptualmente
la misma que la utilizada para los plásmidos.

- Otros vectores:
Existen otras opciones de vectores de clonación como son los cósmidos, que pueden transportar
casi 50.000 pares de bases de ADN insertado; y los cromosomas artificiales de levadura llamados yac,
que permiten clonar grandes fragmentos de ADN, de 100.000 a 1.000.000 de pares de bases.

5.3. ANTICUERPOS MONOCLONALES

A partir de la tecnología de hibridomas, basada en la fusión de células de mamíferos, se producen
anticuerpos altamente específicos conocidos como anticuerpos monoclonales, los cuales se aplican en
áreas como el diagnóstico y en fármacos de acción específica. Éstos conjuntamente con la tecnología
del ADN recombinante son los principales avances de la biotecnología moderna.

25
 BIOTECNOLOGÍA

El procedimiento de obtención de los anticuerpos monoclonales comienza en el laboratorio (Figura

5.4), introduciendo un antígeno (molécula que puede desencadenar la respuesta inmune) en un ratón.
Éste comienza a producir linfocitos B (células productoras de anticuerpos) para defenderse del antígeno,
y es posible aislarlos del suero sanguíneo del animal. Sin embargo, estas células no pueden cultivarse in
vitro, por lo que se deben fusionar habitualmente con células
de mieloma (células tumorales de médula ósea) que si pueden
cultivarse in vitro y son de rápida proliferación. Así, se
producen los llamados hibridomas que conservan la propiedad
de reproducirse rápidamente en el laboratorio y, al mismo
tiempo, expresan anticuerpos específicos. Posteriormente, las
células híbridas obtenidas se seleccionan, cultivan y ensayan
para identificar aquellas que produzcan anticuerpos con
determinada especificidad.
Los anticuerpos monoclonales son de gran importancia
tanto en las pruebas de diagnóstico clínico o ambiental como
en el control de calidad de los alimentos. También para la
preparación de productos terapéuticos, aunque su empleo
demoró mucho más de lo esperado. Producidos en células de
ratón, los anticuerpos monoclonales son reconocidos como
extraños (no propios) al ser inyectados en el hombre, formando
complejos inmunes que dañan gravemente a los riñones. Para
evitar estas reacciones, se comenzó la elaboración de
anticuerpos monoclonales quiméricos (33% proteína animal) y
humanizados (10% proteína animal), lo cuales conservan parte
de las secuencias de ratón, especialmente las que reconocen al
antígeno, mientras que el resto de la molécula es reemplazado
por secuencias humanas.
La incorporación de técnicas de ingeniería genética a la
elaboración de los anticuerpos monoclonales abrió nuevos
caminos para el diagnóstico y el tratamiento de las
enfermedades.

Fig. 5.4. Anticuerpos monoclonales

obtenidos por la tecnología de hibridomas.

5.4. MEJORAMIENTO DE CEPAS INDUSTRIALES

La genética se puede usar de muchas maneras para mejorar las características deseadas de un
organismo. Por medio de técnicas de reproducción sexual y parasexuales (cuando no esté disponible
ningún ciclo sexual), se busca incorporar los fenotipos deseables de dos cepas en una al recombinar el
material genético. Los ciclos sexuales dependen de la meiosis y solo puede lograrse entre cepas de la
misma especie. No obstante, el ciclo sexual de muchos organismos de importancia comercial aún se
desconoce, por lo que alternativamente, se puede usar la mutagénesis, la fusión de protoplastos y la
ingeniería genética para el mejoramiento de cepas industriales, no solo en referencia al rendimiento del
producto, sino también a la estabilidad del crecimiento, al crecimiento mejorado, a la resistencia a
determinadas sustancias o condiciones, o la eliminación de subproductos.
La mutagénesis dirigida es una técnica utilizada para crear intencionalmente mutaciones puntuales
en la secuencia de nucleótidos, en una cadena de ADN de un gen específico. Los programas de mutación
y selección han demostrado ser muy exitosos en aumentar el rendimiento de la producción de
antibióticos y otras sustancias como las proteínas. Dado a que la frecuencia natural de la mutación es
baja, la inducción de la mutación dirigida y específica es necesaria. Los tipos de mutantes aislados en

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 BIOTECNOLOGÍA

tales técnicas generalmente reflejan cambios en las etapas limitantes del producto de las rutas
metabólicas, como liberar la inhibición del producto final, reducir o abolir la formación de subproductos,
aumentar la cantidad o calidad de enzimas, o incrementar la producción del producto de la célula al
disminuir el grado de inhibición que el producto final le genera a ésta.
Los programas de mejoramiento de cepas también incluyen la fusión de protoplastos, que es una
técnica en la que se produce la hibridación de células somáticas de distintas cepas, e incluso especies,
para obtener un híbrido que retiene las características favorables de ambas. Las células somáticas, a
diferencia de las germinales, son aquellas que se dividen por mitosis.
Esta metodología de fusión celular se realiza típicamente con protoplastos vegetales, esto es,
células vegetales cuya pared celular se ha removido mediante el tratamiento con enzimas. En etapas
subsiguientes los protoplastos purificados de cada especie se fusionan por medio de un tratamiento con
polietilenglicol. Luego, se identifican y clonan los protoplastos híbridos, para finalmente regenerar
plantas híbridas fértiles. Las células híbridas de especies con parentesco lejano, muy pocas veces
regeneran plantas o, si las regeneran, las plantas suelen ser estériles. El uso de este método para obtener
híbridos somáticos se recomienda en aquellos casos en los que no es posible obtenerlos por hibridación
sexual. En la actualidad, esta tecnología ha permitido obtener organismos más productivos a través de
remediar carencias, mejorar especies y proporcionar resistencia a plagas y enfermedades a un buen
número de especies vegetales.
Si bien, los organismos obtenidos por mutagénesis dirigida o fusión celular, al no emplear técnicas
de la biotecnología moderna, podrían ser considerados como no genéticamente modificados, se sugiere
que, independientemente de la técnica de mejoramiento genético empleada, las nuevas variedades de
organismos sean evaluados de acuerdo a sus nuevas características y al producto final que se genere. No
obstante, la mejora genética de cepas industriales a través de la ingeniería genética clásica (como la
mutagénesis o la fusión de protoplastos) ha cedido el paso en los últimos 20 años a la tecnología del
ADN recombinante.

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 BIOTECNOLOGÍA

Tema 6:

CULTIVO BATCH DE CÉLULAS

6.1. CINÉTICA DEL CRECIMIENTO

El crecimiento se considera como el aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de un
organismo. Para los organismos unicelulares es el aumento en el número de individuos de la población,
puesto que, en un medio de cultivo adecuado, las bacterias aumentan de tamaño y se dividen en dos por
fisión binaria. En este capítulo, se considerará la cinética del crecimiento de los organismos procarióticos
unicelulares, como son las bacterias.
Para que un organismo se multiplique se requiere: un inóculo viable, una fuente de energía,
nutrientes, ausencia de inhibidores de crecimiento y condiciones físico-químicas adecuadas. Es
importante destacar que una célula no viable es aquella que, incubada en un medio adecuado para el
crecimiento por un período suficientemente largo, es incapaz de multiplicarse. Mientras que, una célula
que aparentemente no crece, aún puede ser viable, pero el medio es incapaz de apoyar el crecimiento
debido a la disminución de un nutriente esencial, presencia o producción de materiales tóxicos, o un
cambio en el medio físico (disminución de O2, cambios en el pH o temperatura). Algunas células pueden
vivir en ese estado sin crecimiento, como esporas.
En un cultivo discontinuo (batch) cuando un medio de crecimiento adecuado se inocula con células,
se produce el ciclo de crecimiento que consta de cuatro fases, tal como se describió en el capítulo 4 (Fig.
4.4). Durante la fase exponencial, el crecimiento de las células sucede en un ambiente no limitado, por
lo que la biomasa (X) aumenta de manera: X0 → 2X0 → 4X0 → 8X0 → 16X0 → nX0
El tiempo necesario para que a partir de una biomasa inicial (X0) se genere una biomasa 2X0 es
constante y se denomina tiempo de duplicación (td). En consecuencia, la cantidad de veces que la
población microbiana se duplica en un tiempo dado, se conoce como el número de generaciones o
duplicaciones (n), y está dado por la ecuación 6.1. Mientras que, la densidad celular luego del tiempo t
(Xt), se relaciona con la cantidad de biomasa inicial (X0) de acuerdo a la ecuación 6.2.

t
n= (Ec. 6.1)
td

X t = X o . 2n (Ec. 6.2)

Reacomodando tales ecuaciones y tomando logaritmos se obtiene la ecuación 6.3. Ahora bien, en
una gráfica de log X en función de t se produce una línea recta cuya pendiente es 0,693/ td que equivale
a la velocidad específica de crecimiento, µ (Ec. 6.4). µ se define como el aumento de la concentración
celular por unidad de tiempo (h-1), y al igual que el tiempo de duplicación, es constante durante el
crecimiento exponencial para un organismo y condiciones dadas.

(log Xt − log Xo ) 0,693 (Ec. 6.3)

2,303. =
t td

0,693
μ= (Ec. 6.4)
td

Finalmente, para un proceso batch, la velocidad de crecimiento de las células (rx) está dada por:

dX (Ec. 6.5)
𝑟𝑥 = = µ .X
dt

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 BIOTECNOLOGÍA

6.2. FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO

Los factores que afectan a la velocidad específica de crecimiento (µ) son principalmente la
concentración del sustrato limitante, altas concentraciones de producto, la temperatura y el pH.

6.2.1. Concentración de sustrato

El efecto de la concentración del sustrato limitante sobre µ fue estudiado por Monod, quien observó
experimentalmente que ambos parámetros se relacionaban con una curva de saturación (Figura 6.1),
similar a la que describe la cinética enzimática del tipo Michaelis-Menten.

Fig. 6.1. Efecto de la concentración del sustrato sobre µ.

La ecuación de Monod (Ec. 6.6) es utilizada para describir el efecto de las distintas concentraciones
de sustrato sobre µ. Donde S es la concentración de sustrato, µmáx es la velocidad específica de
crecimiento máxima, y KS es la constante de Monod.

S
µ = µmáx . (Ec. 6.6)
KS + S

KS representa la afinidad de los microorganismos por el sustrato y se define como la concentración

de sustrato que produce la mitad del valor de µmáx. En general, los valores de KS son muy bajos y, en
consecuencia, difíciles de determinar. Para esto, la ecuación de Monod se puede linealizar tomando sus
recíprocos para obtener la ecuación 6.7. Así, en una gráfica de 1/µ en función de 1/S se obtiene una línea
recta, cuya pendiente es KS/µmáx, el punto de corte con el eje de las ordenadas equivale a 1/µmáx y el corte
con el eje de las abscisas es igual a -1/KS.

1 KS 1 1
= . + (Ec. 6.7)
µ µmáx S µmáx

La relación de Monod se aplica al caso de crecimiento no inhibido. Sin embargo, es común que el
cultivo se vea afectado por concentraciones relativamente altas de sustrato. Si la concentración inicial
de éste se incrementa a un valor considerablemente más alto que la concentración mínima de saturación
(>10-20 KS), µ disminuye debido a la inhibición por sustrato. Esto se debe probablemente, al alto
esfuerzo osmótico impuesto a las células que causa su deshidratación y problemas difusionales. Esta
característica es la razón por la cual algunos alimentos pueden ser conservados en soluciones con alta
concentración de azúcar o sal. Solo algunos organismos, llamados halófilos, son capaces de crecer bajo
estas condiciones. El valor de µ en el caso de inhibición por alta concentración de sustrato, puede
calcularse a través de la ecuación 6.8, donde KIS es la constante de inhibición por sustrato.

29
 BIOTECNOLOGÍA

S
µ = µmáx . S (Ec. 6.8)
(KS + S)(1 + )
KIS

Alternativamente, puede ocurrir la inhibición del crecimiento a bajas concentraciones de sustrato

como resultado de la inhibición de enzimas metabólicas clave. No obstante, estas bajas concentraciones
de sustrato favorecerán el crecimiento si el sustrato es tóxico para la población microbiana.

6.2.2. Concentración de producto

El crecimiento de las poblaciones microbianas también puede ir acompañado por la formación de
productos finales tóxicos que causan la inhibición del crecimiento. Un ejemplo conocido es la
producción de etanol por levaduras y bacterias, que en concentraciones superiores de 1-2% el etanol
comienza a inhibir el crecimiento. Aproximadamente al 12% usualmente se logra la inhibición total, lo
cual es la razón por la que la mayoría de los vinos contienen alrededor del 12% de alcohol.
En estos casos, el valor de µ puede calcularse a través de la ecuación 6.9, donde KP es la constante
de inhibición por producto.
S
µ = µmáx . (Ec. 6.9)
P
(KS + S)(1 + )
KP

6.2.3. Temperatura
La temperatura es uno de los factores ambientales más importantes que afectan al crecimiento de
los microorganismos, puesto que las especies bacterianas crecen generalmente en rangos estrechos de
temperatura. Por ejemplo, las bacterias mesófilas crecen entre 25 y 40 °C, las psicrófilas se desarrollan
adecuadamente debajo de los 20 °C, y las termófilas entre 40 y 65 °C.
Como regla general, por cada aumento de 10 °C la velocidad específica de crecimiento se duplica.
Esta aproximación es sólo válida hasta una determinada temperatura, arriba de la cual el crecimiento
comienza a decrecer, ya que generalmente por encima de los 50 °C se produce la desnaturalización de
enzimas y proteínas. A su vez, a temperaturas cercanas a los 0 °C el crecimiento se detiene. Las bacterias
resisten mejor las bajas temperaturas, ya que para esos casos se pueden encapsular y recobrar su
actividad cuando las condiciones mejoran. En cambio, cuando son sometidas a temperaturas elevadas
las células mueren.

6.2.4. pH
Al igual que la temperatura, el pH afecta significativamente a la actividad microbiana. Cada
organismo tiene un rango de pH óptimo para su crecimiento y, aún dentro de ese intervalo
frecuentemente cambian su metabolismo como resultado de variaciones en el pH. En general, el pH
óptimo para las bacterias está ubicado en un rango de 5 a 8, el de las levaduras y mohos entre 3 y 7,
mientras que el de las células eucarióticas superiores se ubica entre 6,5 y 7,5. No obstante, ciertas
especies pueden crecer con un pH inferior a 2 o mayor a 10. Los que crecen a pH bajos se llaman
acidófilos, tales como los hongos que en general tienden a ser más tolerantes al ácido que las bacterias.
Aquellos microorganismos que poseen pH óptimos de crecimiento entre 10 y 11, se conocen como
alcalófilos.
Estos intervalos de pH para el crecimiento pueden resultar útiles durante el manejo de los cultivos
celulares para reducir la posibilidad de contaminación. Por ejemplo, las fermentaciones de levaduras
con frecuencia operan a un pH tan bajo como económicamente sea posible, para evitar la contaminación
bacteriana, con la consecuente reducción de costos de esterilización. Asimismo, durante las

30
 BIOTECNOLOGÍA

fermentaciones es muy importante el control del pH, particularmente cuando se forman productos ácidos
o cuando los sustratos son ácidos o bases, de modo que al consumirse, el pH del medio cambiará de
manera importante. A menudo se usan soluciones buffer para evitar estas fluctuaciones en el medio.

6.3. MANTENIMIENTO CELULAR

Además de consumirse sustrato para producir nuevas células, parte del mismo debe utilizarse
exclusivamente para el mantenimiento de la actividad celular, fundamentalmente como suministro de
energía. La ecuación de velocidad para el mantenimiento celular (rm), independientemente de si las
células crecen o no, es de la forma:

𝑟𝑚 = m . X (Ec. 6.10)

Un valor habitual de m es 0,05 kg de sustrato/kg de células·h = 0,05 h-1, aunque depende en gran
medida de las condiciones del medio de cultivo.

6.4. CINÉTICA DE FORMACIÓN DE PRODUCTO

En la formación de producto se puede diferenciar entre sistemas asociados y no asociados con el
crecimiento, en los cuales se generan metabolitos primarios y secundarios respectivamente. En el primer
caso, el producto aparece en proporciones relativamente constantes a la masa celular que se acumula y
al sustrato consumido. Mientras que, en el segundo caso la formación de producto no es necesariamente
proporcional a la utilización de sustrato o aumento de masa celular.
La velocidad de formación de producto (rp) puede expresarse mediante la ecuación 6.11, donde qp
es la constante de velocidad específica de formación de producto (h-1).

dP (Ec. 6.11)
𝑟𝑝 = = qp . X
dt

6.5. CINÉTICA DE CONSUMO DE SUSTRATO

En primer lugar, es necesario definir los rendimientos de biomasa (Yx/s) y de producto (Yp/s) que
son parámetros muy importantes, puesto que representan la eficiencia de conversión del sustrato en
biomasa y producto. Las ecuaciones 6.12 y 6.13 expresan dichos parámetros respectivamente, que se
definen como la masa de biomasa o de producto formado por unidad de masa de sustrato consumido, en
un período de tiempo dado.

ΔX (Ec. 6.12)
Yx/s =
ΔS

ΔP (Ec. 6.13)
Yp/s =
ΔS

Por lo tanto, el crecimiento celular y la formación de producto pueden relacionarse con la

utilización del sustrato mediante las siguientes expresiones:

dX dS
𝑟𝑥 = = Yx/s . (Ec. 6.14)
dt dt

dP dS (Ec. 6.15)
𝑟𝑝 = = Yp/s .
dt dt

31
 BIOTECNOLOGÍA

Ahora bien, para calcular la velocidad de consumo de sustrato (rs) es necesario relacionarla con las
velocidades de crecimiento celular (rx), de formación de producto (rp) y de mantenimiento celular (rm).
En general, se puede escribir el siguiente balance de materia aplicado al sustrato:

Consumo para Consumo para Consumo para

Consumo
= crecimiento + formación de + mantenimiento
de sustrato
celular producto celular

dS 𝑟𝑥 𝑟𝑝 (Ec. 6.16)
𝑟𝑠 = = + + m.X
dt Yx/s Yp/s

Se pueden presentar dos casos según si el producto se forma en la fase de crecimiento exponencial
o en la fase estacionaria. En el primer caso, puede no ser posible distinguir entre la cantidad de sustrato
consumida para el crecimiento celular, de la consumida para formar producto. Bajo estas circunstancias
todo el sustrato consumido se agrupa en el coeficiente de rendimiento Yx/s y la velocidad de consumo
del sustrato es:

Consumo para Consumo para

Consumo
= crecimiento celular y + Mantenimiento
de sustrato
formación de producto celular

dS 𝑟𝑥
𝑟𝑠 = = +m .X (Ec. 6.17)
dt Yx/s

En cambio, si el producto se obtiene durante la fase de crecimiento estacionaria, rx = 0 y la

velocidad de consumo de sustrato es:

Consumo para Consumo para

Consumo
= formación de + mantenimiento
de sustrato
producto celular

dS 𝑟𝑝
𝑟𝑠 = = + m.X (Ec. 6.18)
dt Yp/s

32
 BIOTECNOLOGÍA

Tema 7:

CULTIVO CONTINUO DE CÉLULAS

7.1. TIPOS DE CULTIVO CONTINUO

El cultivo continuo es una forma de cultivar células en un sistema abierto, donde la población
microbiana se mantiene en un estado continuo de crecimiento balanceado, al eliminar de manera
continua parte del cultivo y reemplazando con medio nuevo a la misma rapidez.
Existen dos tipos de sistemas de cultivo continuo:
▪ El quimiostato en el que su operación es controlada mediante la composición química del
sistema, manteniendo constante la composición de la corriente de entrada y su velocidad de
flujo, con el consecuente ajuste de la densidad celular y la velocidad de crecimiento del cultivo.
▪ El turbidostato donde el control de su operación se ejerce a través del mantenimiento de una
densidad celular constante, regulando la velocidad de flujo de acuerdo a la turbidez del caldo,
por lo que se suministrará medio nuevo a medida que se requiera.
Aunque el método para controlar la velocidad de crecimiento es diferente, ambos sistemas son
complementarios y pueden describirse por expresiones cinéticas similares. Además, un requerimiento
básico de los dos sistemas es el control de un volumen de reacción constante, como así también de otros
parámetros importantes del medio como son la temperatura, el pH y el oxígeno disuelto.

7.2. EL QUIMIOSTATO SIMPLE

El quimiostato es el sistema de cultivo continuo más utilizado. Consiste básicamente en un reactor
de tanque agitado, que mantiene el cultivo bacteriano en la fase de crecimiento exponencial y permite
elegir la densidad de células a la que se quiere trabajar. Al mantener constante el caudal volumétrico de
la alimentación, el cultivo puede operar en régimen estacionario indefinidamente. La Figura 7.1 muestra
el esquema del quimiostato, con las corrientes de entrada y salida, y la nomenclatura correspondiente
que permitirá expresar los balances de materia para las células, el sustrato limitante y el producto.

Donde:
F = caudal volumétrico
V = volumen del reactor
X0, X = concentración de células
S0, S = concentración de sustrato
P = concentración de producto

Fig. 7.1. Quimiostato de una sola etapa.

7.2.1. Balance de células

El balance de células será de acuerdo a la siguiente ecuación general:

Acumulación Entrada Salida Crecimiento Muerte

de células
=
de células
– de células
+
de células
– de células

33
 BIOTECNOLOGÍA

Considerando que la corriente de entrada no contiene células vivas (estéril), y que se puede anular
el término de muerte celular porque se opera en la fase de crecimiento exponencial, se obtiene:

dX FX
=− +µX (Ec. 7.1)
dt V

La relación F/V se denomina velocidad de dilución (D), que es el número de volúmenes de medio
que pasan a través del reactor por hora; por consiguiente, la ecuación anterior puede escribirse como:

dX
= − D X + µ X = X (µ − D) (Ec. 7.2)
dt

Durante el cultivo en régimen estacionario, dX/dt = 0 y, por lo tanto, µ = D. Esto demuestra una
de las características más importantes del quimiostato, que permite controlar la velocidad específica de
crecimiento celular mediante el ajuste del caudal volumétrico de alimentación (velocidad de dilución).

7.2.2. Balance de sustrato

El balance en relación al sustrato limitante será:

Consumo para Consumo para Consumo para

Acumulación Entrada Salida
de sustrato
=
de sustrato
– de sustrato
– crecimiento – mantenimiento – formación de
celular celular producto

dS F. S0 F. S 𝑟x 𝑟p
= − − − m.X − (Ec. 7.3)
dt V V Yx/s Yp/s

En general, durante la fase de crecimiento exponencial, el consumo de sustrato para mantenimiento

celular es mucho menor que el utilizado para el crecimiento. Además, puede no ser posible distinguir
entre la cantidad de sustrato consumida para el crecimiento celular, de la consumida para formar
producto. Bajo estas circunstancias el término de mantenimiento puede ignorarse y todo el sustrato
consumido se agrupa en el coeficiente de rendimiento Yx/s resultando la ecuación 7.4.

dS F. S0 F. S µ.X
= − − (Ec. 7.4)
dt V V Yx/s

En régimen estacionario dS/dt = 0 y F/V= D, por lo que se obtiene la Ec. 7.5, que reacomodándola
y sabiendo que µ = D se obtiene finalmente la Ec 7.6.

µ.X
= D (S0 − S) (Ec. 7.5)
Yx/s

X = Yx/s (S0 − S) (Ec. 7.6)

7.2.3. Balance de producto

El balance de materia para el producto de interés será:

Acumulación Entrada Salida Formación de

de producto
=
de producto
– de producto
+
producto

Si no hay producto en la alimentación al reactor, y tomando las consideraciones generales para

régimen estacionario, se obtiene:
D . P = 𝑟p (Ec. 7.7)

34
 BIOTECNOLOGÍA

7.2.4. Ecuaciones de diseño

En el régimen estacionario y para reacciones que siguen una cinética de Monod, la concentración
de cada especie se puede obtener a partir de las siguientes expresiones.

Concentración de sustrato Concentración de células Concentración de producto

Dado que: De acuerdo a la Ec. 7.6: Según la Ec. de rendimiento:

S X = Yx/s (S0 − S) (P − P0 ) = Yp/s (S0 − S)
µ = µmáx .
KS + S
S Reemplazando por el valor de S: Reemplazando por S:
D = µmáx .
KS + S
KS . D KS . D
X = Yx/s (S0 − ) P = Yp/s (S0 − )
Despejando S: µmáx − D µmáx − D
KS . D
S= (Ec. 7.8) (Ec. 7.9) (Ec. 7.10)
µmáx − D

7.2.5. Velocidad de dilución crítica

Cuando la velocidad de dilución a la que opera el quimiostato es demasiado elevada (D > µmáx),
sucede que la generación de microorganismos será inferior a la cantidad de éstos que son arrastrados
por la corriente de salida y, en consecuencia, se llegaría a la situación de que no quedara ningún
microorganismo en el interior del reactor. Este caso se conoce como lavado del reactor. Por lo tanto, la
velocidad de dilución crítica (DC) se define como la menor velocidad de dilución a la cual ocurre el
lavado celular. En la práctica, DC es aproximadamente igual a µmáx.
En la Figura 7.2 se muestra la concentración celular (la de producto tendría una forma análoga) y
la de sustrato para el régimen estacionario, según el valor de D al que se esté operando.

Fig. 7.2. Relación entre la biomasa, el sustrato, la productividad

y la velocidad de dilución en estado estacionario.

De acuerdo a lo observado en la gráfica se puede decir que, al operar con caudales volumétricos
pequeños, el valor de D se aproxima a 0 y así lo hace también S. La interpretación es que el sustrato se
consume inmediatamente al entrar en el reactor. Contrariamente, al operar con caudales volumétricos
grandes, D también es grande, con lo que S aumenta en el interior del reactor: primero linealmente y
luego bruscamente a medida que D se aproxima al valor de µmáx, al mismo tiempo en que X disminuye.
Cuando esto se produce D = DC, X = 0 y S = S0 ya que no se consume sustrato, porque no hay más
células en el reactor. En consecuencia, se puede escribir:

35
 BIOTECNOLOGÍA

S0
DC = µmáx . (Ec. 7.11)
K S + S0

Por lo tanto, a velocidades de dilución cercanas a DC el quimiostato se vuelve menos estable, ya

que ligeras fluctuaciones en la velocidad de flujo debidas a errores de bombeo, etc., provocan grandes
cambios en la concentración celular de salida, que pueden conducir rápidamente al lavado del reactor.
De aquí que el quimiostato trabaja mejor a velocidades de dilución bajas, donde los cambios en la
concentración de células y sustrato son pequeños, y cualquier fluctuación en la rapidez del flujo tendrá
poco efecto sobre el régimen estacionario.
En cambio, en el turbidostato se puede trabajar muy bien a altas velocidades de dilución porque
como ya se dijo, éste opera manteniendo constante la densidad celular. Es decir, si por alguna fluctuación
en el caudal disminuye la cantidad de células en el interior del reactor, se corta el suministro de
alimentación de manera que pueda mantenerse en los valores de operación y, por consiguiente, no se
producirá el lavado celular.

7.2.6. Velocidad de dilución óptima

Para determinar el valor de la velocidad de dilución óptima a la que debe operar el reactor (Dm)
hay que definir la productividad celular, cuyas unidades serán [masa de células/volumen.hora] y se
muestra en la gráfica anterior (Fig. 7.2).

KS . D
Productividad = D . X = D . Yx/s (S0 − ) (Ec. 7.12)
µmáx − D

La velocidad de dilución óptima será aquella que dé lugar a la máxima productividad, y se puede
calcular al hacer cero la derivada primera de la ecuación 7.12. Por lo general, ésta no es la misma que
da el rendimiento o conversión máxima de sustrato a células, por lo que se debe establecer un acuerdo
entre la productividad y la cantidad de sustrato en la corriente de salida.

KS
Dm = DC . [1 − √( )] (Ec. 7.13)
KS + S

Aunque los valores de S, X y P se pueden obtener sustituyendo D por el valor de Dm en las

correspondientes ecuaciones, resulta todavía más sencillo obtener estos valores de la gráfica anterior
(Fig. 7.2). Lógicamente, se puede obtener el volumen del reactor correspondiente mediante la ecuación
7.14 y, de acuerdo a los conceptos de diseño de reactores, el tiempo de residencia será el inverso de la
velocidad de dilución.

F
Dm = (Ec. 7.14)
Vopt

7.3. QUIMIOSTATO CON RECIRCULACIÓN

Es posible mejorar la eficacia de operación de un quimiostato simple y evitar el lavado del mismo,
mediante un proceso de recirculación celular en el que la corriente de salida del reactor se trata en un
sedimentador o en una centrifugadora, separándose una solución concentrada de microorganismos que
se retroalimenta al reactor (Figura 7.3). En este caso, necesariamente el alimento al reactor no es estéril
como consecuencia de la corriente de recirculación que aporta células.

36
 BIOTECNOLOGÍA

Fig. 7.3. Quimiostato con recirculación de células.

Esta configuración del quimiostato de inoculación continua, permite que sea operado a velocidades
de dilución mayores que µmáx. Otra ventaja, es la capacidad para trabajar a valores cercanos a Dm sin
dejar sustrato excesivo sin consumir en la corriente de salida (normalmente a Dm el sustrato permanece
en la salida), puesto que, mediante la recirculación de células se puede mantener una mayor
concentración de biomasa en régimen estacionario que da como resultado mayor consumo de sustrato.
Esta es una característica valiosa en el tratamiento continuo de aguas residuales, puesto que permite que
la materia orgánica se reduzca en mayor grado y a mayor rapidez.

7.4. QUIMIOSTATO DE DOS ETAPAS

En la industria también suele ser frecuente el uso de reactores en serie para aumentar la
productividad o cambiar las condiciones de operación en cada uno de ellos.
El cultivo continuo de etapas múltiples requiere que la corriente de salida de la primera etapa actúe
como alimentación que inocula continuamente a la segunda etapa (Figura 7.4). La segunda etapa puede
tener también aporte de sustrato y operar a una D mayor o tener medios diferentes en cada etapa. Un
ejemplo, sería maximizar la producción de biomasa en la primera etapa y la formación de producto en
la segunda.

Fig. 7.4. Quimiostato de dos etapas.

37
 BIOTECNOLOGÍA

En el quimiostato de una sola etapa puede ser difícil producir productos no relacionados con el
crecimiento (metabolitos secundarios), por lo que un método adecuado es el uso de un quimiostato de
dos etapas. El crecimiento para obtener una alta densidad de células se puede lograr a través de una
primera etapa con la fuente de carbono como sustrato limitante, cuya salida se alimenta directamente en
la segunda etapa que contiene un medio adecuado en el que, el crecimiento se mantiene en un mínimo
mientras se estimula la formación de producto. Sin embargo, como el flujo hacia cada etapa debe ser
idéntico, podría ocurrir el lavado celular en esta segunda etapa. Esto se puede evitar al aumentar el
volumen del reactor, lo cual produce una disminución en la velocidad de dilución.

7.5. VENTAJAS DEL CULTIVO CONTINUO

Las principales ventajas del cultivo continuo con respecto a los sistemas batch son:
- La velocidad específica de crecimiento se puede controlar y mantener indefinidamente.
- La concentración de biomasa se puede mantener constante variando la velocidad de dilución.
- Se puede optimizar la composición del medio de cultivo para la formación de biomasa y
producto, con la técnica de pulsos. Esta consiste en inyectar (pulsar) nutrientes directamente en
el quimiostato y observar los cambios en X y S. Si X aumenta, el nutriente se agrega al depósito
de alimentación y se establece un nuevo régimen estacionario.
- Mayor productividad y menor pérdida de tiempo en tiempo improductivo que incluye limpieza,
preparación, esterilización, etc.
- Se puede mantener la producción de metabolitos secundarios en forma simultánea con el
crecimiento en sistemas multietapas.

Entre las desventajas más importantes se presentan:

- No siempre se puede alcanzar la producción de algunos productos no relacionados con el
crecimiento.
- El cultivo continuo por largos períodos puede ocasionar problemas de contaminación y
mutación, ocasionando la pérdida de la cepa original debido a que otra cepa crece más rápido.
- La planta y los equipos de control son más complejos, ya que deben ser confiables para evitar
la interrupción mecánica, etc.

38
 BIOTECNOLOGÍA

Tema 8:

INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS Y CÉLULAS

8.1. ENZIMAS INMOVILIZADAS

Muchas enzimas son lábiles bajos las condiciones normales de operación y, por lo tanto, tienen una
vida muy limitada. Además, debido a que las enzimas libres son solubles en agua, son difíciles de separar
de sus sustratos y productos, por lo que su reutilización es difícil, aumentando considerablemente los
costos del proceso. De este modo, el concepto de enzimas inmovilizadas tiene gran atractivo en la
intensificación de los bioprocesos.
La inmovilización es el método por el cual las enzimas pueden transformarse en catalizadores
heterogéneos. Consiste en mantener a la biomolécula unida o atrapada en un soporte físico, conservando
su actividad catalítica y permitiendo el flujo de sustratos y productos. En comparación con el uso de
enzimas suspendidas, la inmovilización de enzimas en partículas insolubles en agua, presenta ventajas
tales como aumentar considerablemente su estabilidad y actividad en función del pH y la temperatura,
y poder separarlas con facilidad del caldo de reacción permitiendo su reutilización, o bien, establecer un
proceso continuo, mejorando la economía del mismo. Sin embargo, la desventaja de las enzimas
inmovilizadas es su naturaleza heterogénea que impone limitaciones difusionales que reducen y alteran
su actividad catalítica, además del costo adicional que supone el proceso de inmovilización. Es por ello,
que la sencillez y el bajo costo de los diferentes métodos juegan un papel fundamental en la selección
de los protocolos de inmovilización.

8.1.1. Métodos de inmovilización de enzimas

Los métodos de inmovilización de enzimas se clasifican en dos categorías: métodos reversibles e
irreversibles. Estos últimos implican el enlace permanente del biocatalizador a un soporte, el cual no
puede ser liberado sin destruir el soporte o modificar su actividad biológica. Los procedimientos más
comunes son mediante la unión covalente, el entrecruzamiento, el atrapamiento y el micro-encapsulado.
En cambio, en los métodos reversibles las enzimas pueden ser desprendidas del soporte bajo
condiciones no extremas. Su uso es altamente atractivo, principalmente por razones económicas, debido
a que el soporte puede regenerarse y recargarse con enzimas nuevas cuando la actividad enzimática
decae, siendo la adsorción el procedimiento más común. A continuación, se describe brevemente cada
uno de ellos.

- Unión covalente
La inmovilización basada en la formación de enlaces covalentes está entre los métodos más usados.
Consiste en enlazar covalentemente a la enzima con un soporte insoluble como puede ser vidrio poroso,
cerámica, acero inoxidable, celulosa, polímeros sintéticos y óxidos metálicos. El enlace se da entre algún
grupo funcional reactivo de la enzima y el soporte previamente activado, generalmente recubierto con
grupos funcionales orgánicos en su superficie.
La ventaja de este procedimiento radica en que la unión por enlace covalente confiere a la enzima
una inmovilización más estable a cambios de pH y temperatura en el medio, al tener estabilizada su
estructura terciaria. Generalmente, se emplea cuando existe un requerimiento estricto de ausencia de
enzimas en el producto. Aunque es indispensable que los aminoácidos esenciales para la actividad
catalítica no involucren un enlace covalente con el soporte, lo que puede resultar difícil de lograr en
algunos casos.

39
 BIOTECNOLOGÍA

- Entrecruzamiento
En esta técnica los soportes no son necesarios, ya que la inmovilización se da por un enlace entre
enzimas. Generalmente se añade un agente de unión (ej. glutaraldehído) a las enzimas en solución,
uniendo covalentemente los grupos funcionales de las mismas, para formar agregados. Este método es
muy sencillo, pero susceptible a pequeños cambios de pH y temperatura en las condiciones de operación.

- Atrapamiento
Se basa en la retención física de las enzimas dentro de una red polimérica que permite una fácil
difusión de sustratos y productos. Este método difiere de los de acoplamiento covalente descritos
anteriormente, ya que las enzimas no están enlazadas a la matriz o soporte. La matriz puede ser de origen
natural o sintético y de diversos materiales (sílica gel, poliacrilamida, agarosa, alginatos, entre otros).
Consiste en colocar a las enzimas en una solución que posteriormente es gelificada (por temperatura o
adición de polimerizantes), quedando atrapadas dentro de la matriz.
Este método tiene la ventaja de mantener intacta la estructura de la proteína, por lo que su actividad
no se ve afectada. Sin embargo, el tamaño de los poros no puede ser controlado, es difícil de escalar y
reutilizar, ya que el gel puede disolverse bajo ciertas condiciones o tras poco tiempo de uso. La
aplicación práctica de estos métodos puede ser limitada debido a la baja transferencia de masa a través
de las membranas o geles.

- Micro-encapsulación
En esta técnica las enzimas están rodeadas por membranas semipermeables que permiten el paso
de sustratos y productos, pero no de las enzimas. Puede ser por microencapsulación en soportes porosos
(esferas de sílice con nanoporos, micropartículas de CaCO3, etc.); o por microemulsión, combinando la
enzima con agentes emulsificantes para formar micelas que la protegen de medios ácidos/alcalinos.
En la microencapsulación generalmente la enzima queda atrapada en la superficie exterior (en lugar
del interior de la matriz) y puede desprenderse tras varios ciclos de uso. Esto puede solucionarse
controlando el tamaño de poros de las esferas y mediante un tratamiento con un agente que encapsule
la proteína evitando su fuga, además, este método por su naturaleza de interacción suave, permite una
alta actividad y resistencia a cambios de pH y temperatura. Por su parte, la microemulsión tiene la
ventaja de ser muy sencilla, suficientemente porosa para permitir que la enzima funcione en un sistema
en solución, y al mismo tiempo protegida del ambiente degradante.

- Adsorción
Este método emplea soportes orgánicos o inorgánicos que presentan un adsorbente activo en los
cuales, las enzimas son atraídas y retenidas por medio de interacciones iónicas o fuerzas débiles (puentes
de hidrogeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones hidrofóbicas). Consiste en poner en contacto a la
enzima en solución acuosa con el soporte por un tiempo dado (2-48 h), para después lavar el soporte y
eliminar la enzima que no fue inmovilizada. Presenta la ventaja de mantener intacta la actividad de la
enzima, ya que la unión es débil y no afecta su conformación, al mismo tiempo, esta característica hace
que la unión sea reversible y sensible a cambios de pH y temperatura.

8.1.2. Selección de soportes

Las características físicas de los soportes, tales como el tamaño medio de partícula, la resistencia
mecánica a la compresión, etc., son de gran importancia en el comportamiento del sistema de
inmovilización y determinará el tipo de reactor a usar. En particular, el diámetro de poro y el tamaño de
partícula establecerán el total del área superficial, por lo que la adecuada selección incidirá en la
capacidad de enlace de las enzimas. Los soportes no porosos muestran pocas limitaciones difusionales,
pero presentan baja capacidad de carga. Por lo tanto, los soportes porosos son generalmente preferidos

40
 BIOTECNOLOGÍA

por su elevada área superficial que permite una alta carga de enzimas, así como también porque las
enzimas inmovilizadas quedan aisladas del medio ambiente. Asimismo, se debe controlar la distribución
del tamaño de poro en los soportes porosos para optimizar la capacidad y las propiedades de flujo. A
pesar de las muchas ventajas de los soportes inorgánicos (ej. alta estabilidad ante degradación física,
química y microbiana), la mayoría de las aplicaciones industriales se realizan con soportes orgánicos.
Otro de los factores más importantes es el carácter hidrofílico, el cual se utiliza para determinar el
nivel de actividad de las enzimas inmovilizadas. Una excelente matriz o soporte que ha sido utilizada es
la agarosa, que además de su alta porosidad que influye en su elevada captación de enzimas, también
presenta carácter hidrofílico, es de fácil obtención, la ausencia de grupos con carga que previene la
adsorción no específica del sustrato y los productos, y es de bajo costo.

8.1.3. Efectos de la inmovilización

Generalmente, la inmovilización altera significativamente el comportamiento de las enzimas. En
primer lugar, se incrementa su estabilidad, ya que se produce una alteración del microentorno de la
enzima, debido a la interacción con el soporte. Por ejemplo, si una enzima sensible al oxígeno (como
las nitrogenasas o hidrogenasas) se sitúa en la superficie de un soporte cargado, la fuerza iónica en el
microentorno de la enzima será muy alta y, como consecuencia, la concentración de oxígeno disuelto
será mucho menor en esa zona que en el medio de reacción. En otros casos, el soporte tiene un efecto
tamponador de tal manera que mantiene el pH óptimo de la enzima en su microentorno, aunque en la
disolución se produzcan cambios importantes de pH. Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas
por enzimas inmovilizadas en presencia de disolventes orgánicos, la hidrofilia del soporte regula la
actividad de la enzima. Es decir, cuanto mayor es la hidrofilia del soporte, mayor será su capacidad para
retener agua y la enzima poseerá la cantidad necesaria en su microentorno para mantener su
conformación activa.
Por otro lado, la enzima inmovilizada es un sistema heterogéneo en el cual todos los componentes
que intervienen en el proceso catalítico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores, activadores,
etc.) se encuentran en interfase: en el medio de reacción y en la fase constituida por el soporte con la
enzima. Como consecuencia, la actividad enzimática se ve afectada por efectos de tipo difusional,
estérico y del microentorno.

8.2. CÉLULAS INMOVILIZADAS

Entre las principales ventajas que presentan los sistemas biotecnológicos que utilizan células
inmovilizadas, se encuentra su facilidad para el manejo de una mayor densidad celular comparado con
los procesos tradicionales, un mejor control en sistemas continuos, y la posible recuperación de la
biomasa para su posterior reutilización.
Comparado con las enzimas inmovilizadas, el uso de células inmovilizadas elimina la necesidad
de extraer y purificar la enzima, y a menudo el sistema celular es menos sensible a cambios en las
condiciones de operación como el pH. Sin embargo, la desventaja del sistema celular inmovilizado es
que no se pueden emplear para obtener productos que no sean excretados de las células y, dado que
impone barreras difusionales adicionales (pared celular), se puede requerir de la permeabilización de las
células, siendo en este caso difícil mantener su integridad.

8.2.1. Métodos de inmovilización de células

En primer lugar, los materiales para inmovilizar células deben cumplir importantes requisitos
como: ser grado alimenticio (por cuestiones de seguridad), bajo costo, disponibilidad, no degradables,
y aptos para condiciones de pH y temperatura suaves.

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 BIOTECNOLOGÍA

En cuanto a los métodos para la inmovilización de células, los más usados son la autofloculación,
la adsorción sobre soportes y la incorporación en matrices sólidas. La floculación es un proceso que
puede ser natural como ocurre en los mohos, o inducido como en el caso de bacterias y levaduras
mediante el uso de polielectrolitos o entrecruzantes. Sin embargo, los sistemas floculados son difíciles
de manejar debido a que la floculación depende de factores como el pH, temperatura, agitación, etc.
La adsorción consiste en la adhesión de las células a la superficie externa de un soporte, que puede
ser chips de madera, óxidos metálicos, piedras, pequeñas bolitas de vidrio, poliestireno, poliacrilamida,
etc. Es un método sencillo, pero al basarse en un fenómeno fundamentalmente electrostático, durante
procesos continuos especialmente por efecto de la agitación, las células se liberan del soporte. Además,
es difícil inmovilizar grandes cantidades de biomasa.
Por otro lado, la incorporación de células a matrices sólidas se realiza por el atrapamiento de las
mismas en el seno de un material polimérico. Las matrices más adecuadas son polímeros naturales como
el alginato, el carragenato y el agar, ya que polimerizan en condiciones muy suaves. Este método permite
conseguir grandes concentraciones de biomasa en los reactores, y a su vez, se pueden inmovilizar en
matrices independientes células que no podrían coexistir en contacto directo. Otra ventaja importante es
que el soporte protege a las células de la acción de inhibidores, metales pesados, fenoles y temperaturas
extremas. A diferencia de los flóculos de biomasa, estos sólidos son más sencillos de manejar y permiten
un mejor control de la actividad catalítica en reactores de tipo batch y continuos. No obstante, este
método de inmovilización presenta desventajas como los posibles problemas de difusión de nutrientes
y productos a través de la matriz porosa, y la pobre resistencia mecánica de los soportes sólidos.

8.3. USOS Y APLICACIONES

Las aplicaciones más importantes de los sistemas inmovilizados se pueden clasificar en:
- Aplicaciones analíticas mediante el uso de biosensores, que son dispositivos electrónicos de
monitoreo que usan la especificidad de las enzimas y células y de la técnica de inmovilización,
para detectar y/o cuantificar analitos específicos.
- Aplicaciones médicas en tratamientos de enfermedades con enzimas inmovilizadas.
- Aplicaciones en la industria química, farmacéutica, alimentaria y de tratamiento de residuos.
Por ejemplo, en la producción de diversos L-aminoácidos, ampliamente empleados en la
industria de los alimentos, nutrición, medicina y cosméticos, así como materiales iniciadores de
síntesis químicas. También, en la producción de jarabe de alta fructosa a partir de la glucosa,
muy utilizado en la industria de las bebidas light.

42
 BIOTECNOLOGÍA

Tema 9:

BIORREACTORES

9.1. TIPOS DE BIORREACTORES

El biorreactor es la parte principal de cualquier proceso bioquímico, cuya función es proporcionar
un medio ambiente controlado que permita el crecimiento eficaz de las células, la formación de algún
producto y/o la degradación de residuos en el sistema celular empleado.
Los biorreactores son comúnmente recipientes cilíndricos, variando en tamaño desde algunos
mililitros hasta metros cúbicos, y que deben cumplir con los siguientes objetivos:
- Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen del cultivo.
- Proporcionar un sistema de aireación adecuado para cubrir las necesidades metabólicas de los
microorganismos.
- Mantener constante y homogénea la temperatura y el pH.
- Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes.
- Prevenir la sedimentación y la floculación.
- Mantener un ambiente aséptico.
- Reducir al máximo el tiempo del proceso.
Un bioproceso comienza con la elección del agente biológico adecuado (microorganismo o
enzima), continúa con la transformación de la materia prima, en condiciones que pueden exigir
esterilización, aireación y control del proceso (pH, temperatura, etc.), y finaliza con la separación y
purificación del producto final (Figura 9.1).

Fig. 9.1. Etapas del bioproceso.

Los tipos más comunes de biorreactores utilizados en procesos industriales son los de tanque
agitado, columnas de burbujeo, air lift, de lecho empaquetado y de lecho fluidizado.

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 BIOTECNOLOGÍA

9.1.1. Biorreactor de tanque agitado

Actualmente, la mayoría de los bioprocesos industriales se desarrollan, ya sea en modo continuo o
discontinuo, en este tipo de reactores que cuentan con aireación y agitación mecánica (Figura 9.2).
Aquellos utilizados para experimentos de laboratorio y hasta recipientes de 20 L se construyen de vidrio,
mientras que para volúmenes mayores se hacen de acero inoxidable.
En cuanto a sus características generales, son cilíndricos y alargados con una relación altura a
diámetro de 2:1 o mayor, diseño que permite un adecuado tiempo de contacto de las burbujas de aire
con el líquido conforme ascienden. La base del tanque se redondea para evitar zonas estancadas y se
mantienen homogéneos mediante agitación mecánica, para lo cual poseen un eje central movido por un
motor que soporta uno o más agitadores. Este eje puede estar soportado por la parte superior o desde el
fondo del reactor. Además, poseen deflectores (baffles) para mantener la turbulencia, favorecer el
mezclado e impedir la formación de vórtices. Usualmente se instalan cuatro bafles con una relación
ancho a diámetro del reactor de 1:10 a 1:12.
Se debe tener en cuenta, que la formación de espuma a menudo es un problema en los sistemas con
aireación en gran escala, y no siempre se puede añadir antiespumantes, ya que pueden tener efectos
inhibitorios sobre el crecimiento de los microorganismos. Por consiguiente, se puede romper la espuma
mediante métodos mecánicos. Los dispositivos más simples tienen rastrillos montados en el eje del
agitador sobre la superficie del líquido.

Fig. 9.2. Biorreactor de tanque agitado.

En cuanto a la agitación, ésta es muy importante en un biorreactor, puesto que permite dispersar
las burbujas de aire en el seno del líquido, mantener las células en suspensión e impedir la formación de
agregados celulares, eliminar gradientes de concentración de nutrientes, y mejorar la transferencia de
calor para mantener la temperatura uniforme en todo el recipiente.
Existen distintos tipos de agitadores (Figura 9.3), cuya elección depende de la viscosidad del
líquido que se va a mezclar y la sensibilidad del sistema a la cizalla mecánica. El agitador de paletas
planas (turbina de disco de Rushton), es utilizado comúnmente para líquidos de baja viscosidad. Este da
un flujo radial (Figura 9.4) que es bueno para dispersar el aire cuando es introducido por debajo del
agitador, y al ser golpeado por las paletas se divide en miles de burbujas pequeñas. En cambio, el
agitador de paletas inclinadas a 45° es útil cuando se necesita un flujo axial que permita mantener los
sólidos en suspensión. Por otro lado, el agitador de hélice se suele utilizar como un único agitador de
gran tamaño y baja fuerza de cizalla para cultivos de células sensibles al corte, y los agitadores de diseño
hidrodinámico para fermentaciones con alta viscosidad.
En el diseño del biorreactor el número de agitadores depende de la relación altura a diámetro del
tanque (ΦT), siendo el diámetro del agitador ~⅓ ΦT y debe estar colocado a una distancia ~⅓ ΦT desde
el fondo. Los agitadores adicionales están espaciados entre sí a una distancia ~1 a 2 veces ΦT.

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 BIOTECNOLOGÍA

A B C

D E

Fig. 9.3. Tipos de agitadores.

(A) Turbina de Rushton. (B) Agitador de paletas inclinadas. (C) Agitador de hélice.
(D y E) Agitadores de diseño especial con flujo radial/axial y flujo axial, respectivamente.

Flujo radial Flujo axial

Fig. 9.4. Patrones de flujo generados por los agitadores.

9.1.2. Biorreactor de columna de burbujeo

Este tipo de biorreactor carece de un sistema mecánico de agitación, es básicamente un contenedor
cilíndrico en el que se inyecta el aire por el fondo mediante un disco perforado (difusor). El mezclado
lo proporciona el movimiento ascendente de las burbujas de gas a través del líquido (Figura 9.5). En los
procesos aeróbicos, el gaseo del líquido con aire proporciona el oxígeno necesario para el proceso,
además de la agitación. Mientras que en los procesos anaeróbicos los propios gases (CO2) liberados en
la fermentación proporcionan la agitación. Generalmente operan en modo continuo, y el diseño del
mismo debe poseer una relación altura a diámetro de 6:1 o mayor
para lograr una transferencia de oxígeno eficaz.
Entre sus ventajas se destacan su estructura sencilla, bajo
costo, la ausencia de un agitador que elimina el riesgo de
contaminación, el bajo esfuerzo de corte por lo que la fuerza de
cizalla que sufren los organismos es mínima, y la adecuada
transferencia de materia y calor.
Son usados principalmente en la producción de levaduras
de panificación, cerveza, vinagre, fermentaciones aerobias poco
viscosas, tratamiento de aguas residuales.
Fig. 9.5. Reactor de columna de burbujeo.

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 BIOTECNOLOGÍA

9.1.3. Biorreactor air lift

En los reactores de tipo air lift es el mismo aire inyectado al cultivo lo que promueve la agitación.
Básicamente consiste en dos cilindros concéntricos y por la base de uno de ellos, por ejemplo, el cilindro
interior se inyecta aire. De este modo, se genera una circulación
ascendente de aire y líquido en el compartimiento interno, el gas sale por
la parte superior, dejando el líquido libre de burbujas, que recircula en
forma descendente por el espacio exterior (Figura 9.6). La densidad del
fluido es menor en la zona ascendente (que recibe el aire), respecto a la
zona descendente. Esta diferencia de densidad del líquido en las dos
columnas, genera la circulación que favorece el mezclado.
Por el bajo esfuerzo de corte, este tipo de biorreactores se aplican
para el cultivo de células animales (sensibles), para la producción de
proteínas biofarmacéuticas, con catalizadores inmovilizados, etc.
Fig. 9.6. Biorreactor tipo air lift.

9.1.4. Biorreactor de lecho empaquetado

También conocidos como reactores de lecho fijo, consisten en uno o más tubos verticales rellenos
o empaquetados con partículas de catalizador, es decir, la célula o enzima está unida a un soporte, a
través del cual pasa el sustrato que puede ser alimentado por la parte superior o inferior de la columna,
o por goteo (con lluvia spray) que son los más usuales (Figura 9.7). Las partículas deben ser
incompresibles y capaces de soportar su propio peso sin deformarse y obstruir el flujo del líquido. Estos
operan como un reactor de flujo pistón, lo que significa que no se produce el mezclado entre los
elementos del fluido a lo largo de la dirección del flujo y, por lo tanto, existe
una disminución gradual y continua de la concentración de sustrato, y un
aumento de la concentración de producto en la dirección del flujo.
El uso de estos reactores permite trabajar con una mayor densidad y
concentración de biomasa, y no requiere la separación del catalizador como
en el caso de las reacciones catalíticas homogéneas. Sin embargo, cuando
se utiliza un reactor con flujo ascendente se presentan ciertas desventajas
tales como la formación de gas que puede disminuir la superficie de
contacto entre el sustrato y la enzima, la formación de canales que
disminuye la eficiencia de conversión de sustrato a producto, y además es
difícil la regulación de la temperatura y del pH.
Fig. 9.7. Biorreactor de
lecho fijo por goteo.

9.1.5. Biorreactor de lecho fluidizado

A diferencia del caso anterior, aquí el biocatalizador no está fijo en el
lecho del reactor, sino que se mantiene en suspensión en el fluido, como
enzimas inmovilizadas o flóculos microbianos, gracias a la corriente de líquido
que circula en dirección ascendente y la fuerza gravitacional que evita que
sean arrastradas (Figura 9.8). Estos biorreactores pueden ser burbujeados con
aire en caso de cultivos aerobios, lo que aumenta la agitación.
Los elevados flujos a los cuales se debe introducir la solución de sustrato
para fluidizar las partículas del biocatalizador, pueden ocasionar que no se
alcancen niveles de conversión altos, por lo que es necesario reciclar el
sustrato.

Fig. 9.8. Reactor de lecho fluidizado.

46
 BIOTECNOLOGÍA

9.2. AIREACIÓN DEL BIORREACTOR

En cultivos aerobios el oxígeno disuelto en el medio es indispensable, por lo tanto, se deberá
suministrar aire al biorreactor, y de manera constante ya que éste es escasamente soluble en solución
acuosa. El aire se inyecta por la parte inferior del tanque y es distribuido por una corona que posee
pequeños orificios espaciados regularmente. Al ser golpeado por las paletas de la turbina inferior se
generan miles de pequeñas burbujas de aire, desde las cuales difunde hacia el seno del líquido.
Es importante destacar, que en los biorreactores invariablemente hay tres fases (gas-líquido-
sólido), por lo que la transferencia de masa efectiva entre las fases es crucial. La transferencia de oxígeno
del gas hacia los microorganismos se lleva a cabo en varias etapas. Primeramente, el oxígeno debe viajar
a través del gas hacia la interfase gas-líquido, después a través de la interfase, a través del líquido y
finalmente, hacia el microorganismo. El proceso completo es impulsado por la diferencia entre la
concentración del oxígeno en el gas y en el organismo.
El balance de materia para el oxígeno está dado por la ecuación 9.1, donde kLa (h-1) es el coeficiente
volumétrico de transferencia de oxígeno a la fase líquida, C* (mg/L) es la concentración máxima de
oxígeno (saturación), C (mg/L) es la concentración de oxígeno disuelto en el seno del líquido, y YO2 es
el rendimiento de oxígeno en biomasa.

Acumulación Transferencia de oxígeno Consumo de oxígeno

de oxígeno
=
en el biorreactor
– por las células

dC µ
= [k L a . (C ∗ − C)] − [ . X] (Ec. 9.1)
dt YO2

El coeficiente kLa depende de las propiedades físico-químicas del medio, del área superficial de las
burbujas de aire y de las condiciones de operación del biorreactor. Por consiguiente, su valor puede ser
controlado por la velocidad de agitación y el flujo de aire. Por ejemplo, el efecto tras aumentar la
agitación se puede observar en la figura 9.9. Si se mantiene constante el caudal de aire, a baja velocidad
de agitación el régimen es dominado por el flujo gas-líquido por encima del impulsor, y se dice que éste
está inundado. Al aumentar la velocidad se crea un patrón de flujo dominado por el agitador, en el cual
las burbujas de aire son dispersadas horizontalmente, y superando cierta velocidad las burbujas son
distribuidas a todas partes del recipiente. Al aumentar el caudal de aire a una velocidad constante de
agitación, se obtiene una secuencia opuesta de eventos.

Fig. 9.9. Efecto sobre la aireación en reactores agitados.

Ahora bien, en los biorreactores hay presencia de sólidos cuya concentración puede cambiar con
el tiempo, por lo que es importante evitar el asentamiento de éstos en el fondo del recipiente y mantener
una distribución uniforme. A concentraciones muy altas de sólidos (>30% del volumen) la potencia
requerida de agitación será independiente del flujo de aire, tal como en fluidos de alta viscosidad y, por
lo tanto, será más difícil controlar el tamaño de las burbujas. Éstas tenderán a aumentar su tamaño, lo
que conduce a una disminución del área interfacial gas-líquido (menor kLa).

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 BIOTECNOLOGÍA

Por otro lado, la velocidad de consumo de oxígeno depende de las condiciones del cultivo, el tipo
de microorganismo, la fase de crecimiento y la naturaleza de la fuente de carbono. Es decir, que será
función de µ y del grado de conversión del oxígeno que el organismo utiliza para sintetizar biomasa y
mantener el funcionamiento general de la célula. Considerando que el término de mantenimiento puede
ignorarse, que µ/YO2 = qO2 (velocidad específica de consumo de oxígeno), y que en régimen estacionario
dC/dt = 0, la expresión anterior puede escribirse de la siguiente forma:

k L a . (C ∗ − C) = qO2 . X (Ec. 9.2)

Debe tenerse en cuenta que existe un límite máximo para la transferencia de oxígeno, que se
alcanza cuando el gradiente (C* - C) es máximo, y esto se da cuando C = 0. Entonces, la concentración
máxima de células que puede haber en el cultivo estará dada por la ecuación 9.3. Si la concentración
máxima de células es menor que la concentración de células requerida para trabajar, será necesario
mejorar el valor de kLa. Por consiguiente, es necesario conocer el valor del kL.a crítico (Ec. 9.4), el cual
se define como el mínimo valor requerido para mantener la concentración de oxígeno disuelto por arriba
de la concentración de oxígeno crítica (C > Ccrít).

kLa . C∗
Xmáx = (Ec. 9.3)
qO2

qO2 . X
(k L a)crít = (Ec. 9.4)
(C ∗ − Ccrít )

9.3. TRANSFERENCIA DE CALOR

A diferencia de muchos procesos químicos, los bioprocesos no utilizan condiciones extremas de
energía, puesto que operan a temperaturas y presiones cercanas a las ambientales, minimizando así el
suministro de energía. Asimismo, los efectos de la energía son importantes porque los catalizadores
biológicos son muy sensibles al calor y a los cambios de temperatura. Como se describió en capítulos
anteriores, las reacciones anabólicas y catabólicas se producen simultáneamente por lo que, la energía
desprendida en una reacción se utiliza para producir otras reacciones. Las células utilizan la energía
química de manera bastante eficiente, aunque algunas veces es inevitable el desprendimiento de calor.
En los procesos a gran escala, el calor desprendido durante la reacción puede causar la muerte de las
células o la desnaturalización de las enzimas si no se elimina rápidamente.

9.3.1. Balance de energía

En el balance de energía para cultivos celulares se considera que los medios son generalmente
soluciones acuosas diluidas con un comportamiento cercano al ideal, incluso aunque la composición del
cultivo cambie conforme se consume el sustrato y se forman los productos, las variaciones en los calores
de mezcla de estos solutos son despreciables. De igual manera, aunque exista una diferencia de
temperatura entre las corrientes de entrada y salida, la variación total de entalpía debida al calor sensible
también es pequeña. Generalmente, los únicos efectos energéticos que se consideran en los balances de
energía de los biorreactores son el calor de reacción, el calor latente de cambio de fase y el trabajo
mecánico debido a la agitación. La evaporación es el cambio de fase más probable en la operación de
un biorreactor, de manera que, si se controla la evaporación, los efectos del calor latente pueden también
ignorarse.
De acuerdo a lo expresado, el balance de energía se puede escribir según la ecuación 9.5, donde Ʃ
es sumatoria, M es la masa de las sustancias involucradas en la reacción, h es la entalpía específica, W
es la potencia del agitador, y Q es el calor a retirar del biorreactor.

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 BIOTECNOLOGÍA

Energía de Energía de Trabajo Energía eliminada

Energía
acumulada
= la corriente – la corriente + mecánico – por el sistema de
de entrada de salida (agitación) enfriamiento

dE (Ec. 9.5)
= (Ʃ M h)ent − (Ʃ M h)sal + Wagit − Q
dt

Ahora bien, el calor de reacción (ΔHr) resultante de la actividad enzimática o del metabolismo
celular, es la energía desprendida o absorbida durante la reacción, y es igual a la diferencia de entalpía
entre los productos y los reactivos. Como los productos están contenidos en el flujo de salida y los
reactivos en el de entrada, ΔHr es aproximadamente igual a la diferencia de entalpía entre las corrientes
de entrada y de salida. Luego, tomando las consideraciones generales para régimen estacionario, el
balance de energía puede escribirse como sigue:

− ΔHr + Wagit = Q (Ec. 9.6)

El calor de reacción en cultivos anaerobios debe calcularse utilizando los calores estándar de
combustión (tabulados) para reactivos y productos, considerando también la producción de biomasa. El
calor de combustión para las bacterias puede tomarse como -23,2 kJ/g y para las levaduras -21,2 kJ/g.
En cambio, el calor de reacción en cultivos aerobios es directamente proporcional al consumo de
oxígeno por lo que, conociendo la cantidad de O2 tomada durante el cultivo, y sabiendo que la energía
desprendida por cada mol de O2 es 460 kJ, el calor de reacción puede calcularse directamente.

9.3.2. Formas de enfriamiento

La temperatura en un biorreactor se puede controlar removiendo el calor generado por medio de
encamisados o serpentines (Fig. 9.10). La velocidad a la cual se transfiere el calor está dada por:

Q = U . A . ΔT (Ec. 9.7)

Usualmente la variación de temperatura (ΔT) es pequeña a menos que se use agua de enfriamiento
refrigerada, lo cual significa que “UA” tiene que ser grande. Por consiguiente, el área (A) se puede
aumentar al máximo haciendo pasar el agua de enfriamiento también por los baffles. Por otro lado, el
coeficiente global de trasferencia de calor (U) depende del grado de agitación, de la forma del recipiente
y de la velocidad de circulación del agua de enfriamiento, por lo que, en el cultivo de células sensibles
al corte, la turbulencia deberá ser baja y consecuentemente se reducirá el valor de U. En este caso, la
transferencia de calor solo se puede incrementar al proporcionar más área de intercambio, que puede
lograrse al tener un reactor con una relación altura a diámetro más grande.

Fig. 9.10. Formas de remoción de calor en biorreactores.

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 BIOTECNOLOGÍA

En biorreactores muy grandes, mayores a 100 m3, donde la disipación de calor puede ser un
problema, se utilizan una combinación de encamisado, serpentín y de hasta 12 deflectores o baffles para
la circulación del refrigerante, incrementando así la superficie del área disponible para la transferencia
de calor. No obstante, aun añadiendo estas modificaciones, la efectividad de la transferencia de calor
disminuye con el incremento en la escala del fermentador, por lo que, además pueden ser equipados con
intercambiadores de calor externos que eliminan el calor.
Entre las diferentes formas de remoción de calor ilustradas en la figura 9.10, tanto el encamisado
(a) como el serpentín externo (b) se recomiendan para reactores pequeños, debido a su baja área de
transferencia de calor. Mientras que dicha área es alta en el serpentín interno (c) y serpentín interno
compacto (d), siendo más adecuados para grandes reactores. En un intercambiador externo (e) el área
de transferencia de calor es fácilmente ajustable y pueden probarse a escalas pequeñas. Es importante
tener en cuenta que el uso de serpentines internos presenta desventajas como la interferencia en el
mezclado, y la dificultad de limpieza ante la posibilidad de crecimiento celular sobre su superficie. En
los intercambiadores externos, no hay problemas para su limpieza, pero se imponen esfuerzos cortantes
sobre las células y la disminución del oxígeno disuelto.

9.4. ESTERILIZACIÓN
La esterilización se define como la destrucción completa de toda forma de vida microbiana
incluyendo las esporas bacterianas, que son una de las formas de vida con más alta resistencia a los
métodos de esterilización. En cambio, la desinfección implica que el material ha sido tratado a fin de
eliminar o reducir el riesgo de organismos patógenos, pero no implica que todos los organismos viables
hayan sido inactivados.
El mantenimiento de un ambiente aséptico es uno de los puntos de mayor relevancia que hay que
considerar en un bioproceso. Es fundamental evitar la competencia por los nutrientes en medios de
cultivo, permitiendo que los microorganismos específicos que se utilizan, produzcan los rendimientos
esperados en biomasa y/o metabolitos específicos. Debe considerarse la esterilización del medio de
cultivo, del aire, y del equipamiento incluyendo todos los conductos de entrada y de salida de las
válvulas correspondientes.

9.4.1. Métodos de esterilización

La esterilización se lleva a cabo eliminando los organismos viables como ocurre en la filtración, o
matándolos con algunos de los siguientes métodos: calentando en presencia o ausencia de agua,
irradiando con radiaciones UV, o tratando con productos químicos en solución o en forma gaseosa. A
continuación, se describe brevemente cada uno de ellos.

- Calor húmedo
Este es el más usado de los métodos de esterilización debido a la acción penetrante del calor
húmedo. Se aplica principalmente a todo material resistente a la temperatura de trabajo y para medios
de cultivo. El ciclo de esterilización más empleado es el vapor saturado a una temperatura de 121 °C
durante no menos de 15 minutos de exposición. Este procedimiento se logra con vapor de agua a 1 atm
de sobrepresión con respecto a la presión atmosférica, consiguiéndose así, destruir todas las formas
vegetativas y esporas. Se debe tener en cuenta que en la práctica se requiere un tiempo adicional para
que se alcance la temperatura letal, de modo que deben tomarse en cuenta los períodos de calentamiento
y de enfriamiento en los tiempos de esterilización.
Las soluciones acuosas, los biorreactores de laboratorio pequeños o matraces que contienen medio
de cultivo se esterilizan en autoclaves, los cuales son recipientes metálicos que generan internamente el
vapor presurizado. Los biorreactores de 20 L o más, normalmente pueden esterilizarse conjuntamente

50
 BIOTECNOLOGÍA

con el medio de cultivo en su interior, mediante la inyección in situ del vapor en el medio o por el calor
generado en la camisa de termostatización en la que se hace circular el vapor. No obstante, pueden
originarse problemas si no se alcanza la temperatura adecuada en todos los puntos del biorreactor, por
ejemplo, en recipientes con gran área superficial, tal como en los reactores de elevación de aire se pueden
presentar zonas de enfriamiento, de modo que se requiere alguna forma de aislación. Un biorreactor con
mezcla deficiente también puede causar problemas, por lo que a menudo se requiere agitar durante la
esterilización.
Para evitar tales inconvenientes de llevar un gran volumen de medio hasta 121 °C uniformemente,
muchos biorreactores grandes se esterilizan vacíos y más tarde se llenan con medio estéril. Esto se lleva
a cabo por esterilización continua del medio en un intercambiador de calor de tubos o de placas o, como
alternativa, por inyección directa con vapor en un circuito externo (Figura 9.11). Dicho sistema tiene las
ventajas de que reduce los tiempos de calentamiento y enfriamiento, permite un alto caudal y puede ser
operado durante tiempos cortos a temperaturas superiores a los 120 °C. Además, un biorreactor vacío
se esteriliza con relativa rapidez, reduciéndose el tiempo de operación improductivo.

Fig. 9.11. Sistema de inyección continua de vapor.

- Calor seco
Este método se recomienda cuando no se quiere que el vapor o presión tenga contacto completo y
directo con el material a esterilizar. Se puede aplicar a materiales de laboratorio que no se deterioran por
acción de las altas temperaturas a la que son sometidos, temperaturas a las cuales es necesario llegar
para asegurar una perfecta esterilización debido al escaso poder penetrante del calor seco. La
temperatura de trabajo debe ser de 160 °C y el tiempo depende del volumen del material (por lo menos
2 horas). Se usa principalmente a nivel industrial para esterilizar material de vidrio y otros materiales
sólidos estables al calor como pinzas quirúrgicas, tijeras, etc. Cabe mencionar que el material debe
acondicionarse convenientemente, por ejemplo, en una estufa de esterilización a seco se prepara el
material envolviendo en papel o protegiéndolo de otra forma para mantener la esterilidad luego del
proceso.
Otra forma de eliminar microorganismos por calor seco es mediante la incineración, que se utiliza
para destruir material descartable contaminado, o por la acción directa a la llama donde se lleva al rojo
el material de metal como ansas, bisturíes, agujas de disección.

- Pasteurización y tindalización
La pasteurización no es estrictamente un método de esterilización, sino que se logra que los
alimentos y bebidas sean seguros para su consumo. La técnica incluye el calentamiento de la sustancia
durante corto tiempo a una temperatura menor a la usada para la esterilización, que es suficiente para

51
 BIOTECNOLOGÍA

matar muchos microorganismos. Por ejemplo, el uso más difundido es la pasteurización de la leche,
donde ésta se calienta a 62 °C durante 30 minutos.
La tindalización se utiliza para esterilizar medios de cultivo que no pueden sufrir la acción de altas
temperaturas. Consiste en someter al material a calentamientos intermitentes a 60-100 °C durante 30
minutos, en tres días sucesivos, seguidos de períodos de reposo o incubación a temperatura ambiente o
a 37 °C. Esto se basa en que, en presencia de formas vegetativas y esporuladas, el primer calentamiento
destruye sólo las formas vegetativas, o sea, no mata las esporas. Mientras que en el proceso de reposo
las formas esporuladas germinan y las bacterias resultantes se hacen más sensibles al calentamiento, por
lo que posteriores calentamientos sirven para completar el proceso.

- Esterilización química
Se han utilizado distintos productos químicos para desinfectar aparatos, material de vidrio, etc.,
aunque no son apropiados para la esterilización preparativa del medio de cultivo. El hipoclorito es un
ejemplo de desinfectante que se usa a menudo para colocar pipetas y material de vidrio infectados, como
vía para restringir la contaminación. Cuando se usa un esterilizante químico, éste debe ser no tóxico y
volátil, de modo que pueda eliminarse fácilmente después de su uso. Otro ejemplo es el óxido de etileno,
usado para la esterilización de productos médicos o farmacéuticos que no soportan altas temperaturas.

- Radiación UV
Se usan lámparas germicidas que emiten concentraciones elevadas de luz ultravioleta, pero como
tiene muy poca capacidad para penetrar la materia, solo los microorganismos que se encuentran en la
superficie de los objetos que se exponen directamente a la acción de la luz UV son susceptibles de ser
destruidos. Generalmente, se instalan estas lámparas en las salas de cultivo de laboratorios, como medio
eficaz para matar los microorganismos del aire, pero solo pueden operarse en ausencia de personas.
También se utiliza para esterilizar material plástico de laboratorio, placas de Petri y otros similares.

- Filtración
A diferencia de los métodos que emplean condiciones letales para eliminar microorganismos, la
filtración es la exclusión física de éstos, y es el método elegido para esterilizar aire que va a introducirse
para oxigenar un biorreactor. También puede usarse para emulsiones oleosas, y soluciones termolábiles
como líquidos biológicos (sueros de animales, soluciones de enzimas, algunas vitaminas y antibióticos).
Los filtros utilizan fibra de vidrio, que no son absolutos ya que los espacios entre las fibras son
mayores que los microorganismos, pero la profundidad de la cama filtrante asegura que todos éstos sean
removidos. En primer lugar, los filtros deben ser esterilizados pasando vapor a través de la cama del
mismo. No obstante, la fibra de vidrio tiene limitaciones, es hidrófila y se humedecerá con el agua
permitiendo el crecimiento de bacterias dentro de sí misma, y además tendrá un flujo restringido de aire.

9.4.2. Cinética de extinción

Para entender la esterilización y las diferentes técnicas, es necesario comprender la cinética de la
extinción de los microorganismos, que se define como la pérdida en la capacidad para crecer y dividirse.
La muerte de microorganismos como consecuencia de la exposición a condiciones letales, sigue una
cinética exponencial. La ecuación 9.8 rige la fase de muerte celular, que resolviéndola puede escribirse
como la ecuación 9.9, donde N es el número de microorganismos viables en el tiempo t, N0 es el número
de microorganismos al comienzo del tratamiento, y k es la constante cinética de muerte.

dN
= −k . N (Ec. 9.8)
dt

(Ec. 9.9)
N = N0 . e− k .t

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 BIOTECNOLOGÍA

Cuando se grafica el logaritmo de células viables en función del tiempo, se obtiene una recta cuya
pendiente es la velocidad de extinción, que depende de la resistencia del tipo de organismo al proceso
de esterilización (Tabla 9.1) y de la temperatura de exposición (Figura 9.12).

Tabla 9.1. Resistencia relativa al calor húmedo.

Resistencia relativa
Bacterias y levaduras 1
Virus y bacteriófagos 1-5
Esporas de moho 2-10
Esporas bacterianas 3.106

Para estudiar el efecto de la temperatura de esterilización, se utiliza el tiempo de reducción decimal

(D), que se define como el tiempo necesario para destruir el 90% de los organismos de una población,
que es equivalente a un ciclo logarítmico, es decir, D = N/N0 = 1/10. El valor D mide la rapidez con que
muere un microorganismo a determinada temperatura (D = 2,303/k). Conforme la temperatura aumenta,
los microorganismos son destruidos más rápidamente y el valor D es menor (Figura 9.12).

Fig. 9.12. Velocidad de extinción a diferentes temperaturas.

Por lo tanto, el tiempo requerido para matar un cierto número de células en una suspensión a una
temperatura específica, se puede calcular de acuerdo a la ecuación 9.10, donde n es el número de ciclos
logarítmicos entre el inicio y el final del tratamiento térmico (número de reducciones decimales). El
tiempo requerido para la esterilización dependerá también del tamaño de la población inicial, y se
considera que un material está estéril cuando la probabilidad de contaminación es menor o igual a 10-6.

t = n .D (Ec. 9.10)

Otro parámetro de letalidad térmica utilizado, es el valor z, equivalente a la temperatura requerida

para reducir en un 90% los microorganismos, en un tiempo determinado. Indica el incremento en la
temperatura necesario para que el valor de D se reduzca a la décima parte (Figura 9.13). El valor z puede
calcularse a partir de la ecuación 9.11, donde ΔT es el incremento de temperatura, D1 y D2 son los
valores de D a las dos temperaturas estudiadas.

ΔT
z= (Ec. 9.11)
log (D1 ⁄D2 )

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 BIOTECNOLOGÍA

Fig. 9.13. Cambio en el valor D con el cambio de la temperatura.

Finalmente, conociendo los valores de la constante cinética k y la temperatura usada, se puede

diseñar un proceso de esterilización para hacer frente a los organismos más resistentes, como son las
esporas.

9.5. CAMBIO DE ESCALA

La capacidad de un biorreactor varía entre 1 y 10 L para escala laboratorio, alcanzando 5.000 L en
una planta piloto y 100.000 L en una planta industrial. Una operación simple de laboratorio puede ser
impracticable o poco rentable si se realiza a gran escala. Después de las primeras experiencias en el
laboratorio a muy pequeña escala, el proceso se estudia en un biorreactor de hasta 10 L de capacidad,
en el que se analizan las variables fisicoquímicas, con vistas a un cambio de escala. Como al aumentar
el tamaño del equipamiento se altera la relación superficie/volumen, las condiciones de operación en la
planta piloto deben ajustarse de forma tal que las aproxime a las de un proceso comercial. Si esta
experiencia es exitosa, el proceso podrá dimensionarse en un biorreactor industrial (Figura 9.14).

Fig. 9.14. El cambio de escala.

Una regla general que se aplica a menudo en el aumento de escala, es la similitud geométrica entre
los recipientes pequeños y grandes. Sin embargo, se deben considerar los parámetros críticos, los cuales
tienen mayor influencia sobre el crecimiento celular y la velocidad de mezclado, afectando a la
productividad. Por ejemplo, si variando la aireación, la velocidad de agitación o cualquier otro

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 BIOTECNOLOGÍA

parámetro, la productividad no cambia, entonces no sería un parámetro crítico. El crítico es el que se

debe tratar de mantener constante porque es determinante para el éxito del sistema.
Los criterios normales elegidos para el cambio de escala son el flujo de aireación por unidad de
volumen y la potencia por unidad de volumen. Por lo tanto, en la práctica, se deben seleccionar los
criterios importantes que requieren ser controlados y entonces determinar el tamaño del recipiente
adecuadamente.

9.6. PURIFICACIÓN DE PRODUCTOS

La recuperación del producto representa una fracción considerable del costo de un proceso
fermentativo, hasta el 60% del total excluyendo los costos de la compra de materia prima. El diseño y
la operación eficiente de los procesos de purificación, son elementos vitales para obtener los productos
deseados para uso comercial. Deberían reflejar la necesidad de no perder más que lo absolutamente
necesario del producto final. Este procesamiento final involucrará, principalmente, la separación inicial
de la mezcla de cultivo hacia una fase líquida y una sólida, con la subsecuente concentración y
purificación del producto deseado.
Por consiguiente, si el producto es extracelular, que es aquel secretado fuera de la célula, se dispersa
en un volumen grande de agua y es necesario separarlo por decantación o filtración. Pero si el producto
es intracelular, es decir que permanece dentro de las células habrá que romperlas para extraerlo. El
producto se concentra por sedimentación, precipitación, filtración, centrifugación, extracción con
solventes, destilación, evaporación del solvente y secado. Si fuera necesario purificarlo, se aplicarán
otros procedimientos, como la cristalización y los métodos cromatográficos. El procesamiento
seguramente involucrará más de una operación.

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 BIOTECNOLOGÍA

Tema 10:

TRATAMIENTO BIOLÓGICO DE EFLUENTES

10.1. AGUAS RESIDUALES

Las aguas cloacales están formadas por excrementos (heces y orina), aguas de uso doméstico (baño,
lavado de ropa, etc.) y, eventualmente, algunos desechos de origen industrial. Si se liberan directamente
a los cursos de agua, se genera un desequilibrio en las poblaciones microbianas que al multiplicarse
consumen el oxígeno provocando la muerte de peces y crustáceos. Por lo tanto, antes de su disposición
final es esencial su tratamiento, el cual generalmente combina métodos físicos con métodos biológicos
de degradación.

10.1.1. Etapas del tratamiento

El tratamiento de las aguas servidas y efluentes (residuos líquidos) es un ejemplo clásico de la
biotecnología tradicional, de suma importancia para el medioambiente. Generalmente ocurre en cuatro
etapas:
- Tratamiento primario: consiste en diferentes operaciones de filtración para la remoción de
materiales gruesos y arena, seguidamente de un tanque de sedimentación, donde se separa la
grasa sobrenadante y los sólidos livianos por flotación, y sedimentan aquellas partículas (como
lodos) que no han sido eliminadas previamente. A menudo se utilizan sustancias químicas como
floculantes y/o coagulantes para facilitar la remoción de los sólidos en suspensión en dicho
tanque. Además, se suele disponer de tanques de ecualización que permiten la mezcla y
homogenización de las descargas.
- Tratamiento secundario: el líquido de salida de la etapa primaria es tratado mediante sistemas
biológicos extensivos o intensivos, para la eliminación de la materia orgánica biodegradable. La
depuración biológica de las aguas residuales consiste en lograr el desarrollo de floras
microbianas (que forman parte de la naturaleza misma y sin necesidad de cuidados asépticos),
dentro de las plantas de tratamiento, que se alimentan de la carga contaminante orgánica. En
condiciones aerobias los productos finales de la biodegradación de la materia orgánica son CO2
y H2O; en condiciones anaerobias se forma biogás constituido principalmente por CH4 y CO2.
Los microorganismos de interés para la depuración biológica, en orden de importancia (por la
cantidad en que participan) son: bacterias, hongos, algas, protozoos, rotíferos, y crustáceos.
Estos se utilizan en todo el mundo debido a que es un sistema eficaz y de más bajo costo que
muchos procesos mecánicos o químicos. En apartados posteriores se describen los diferentes
sistemas para el tratamiento biológico.
- Tratamiento terciario: elimina sustancias inorgánicas y orgánicas (N y P principalmente),
mediante procedimientos tales como la filtración, la volatilización del amoníaco, la
precipitación del fosfato, etc.
- Tratamiento avanzado: si bien la degradación microbiana de los residuos orgánicos no elimina
totalmente a los microorganismos patógenos, la carga restituida al ambiente disminuye
considerablemente. Sin embargo, a veces es necesario aplicar algunos procedimientos
adicionales como la cloración, irradiación UV y tratamiento con ozono, a fin de eliminar los
microorganismos patógenos recalcitrantes.
Dependiendo de cada caso particular, se puede utilizar la mejor combinación entre las diferentes
alternativas tecnológicas disponibles, con el propósito de lograr la mejor ecuación que minimice las
inversiones, los costos de operación y mantenimiento; que junto a la optimización de espacios, permita

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 BIOTECNOLOGÍA

concretar la solución más conveniente. Asimismo, para lograr una gestión integral de todos los residuos,
se debe incluir la estabilización y disposición final de sólidos (retenidos en zarandas, sedimentados, o
purgas de barros de la etapa biológica), ya sea mediante landfarming o con el uso de equipamiento
especialmente diseñado para su tratamiento y reciclaje.

10.1.2. Caracterización de las descargas

La caracterización de los efluentes resulta de suma importancia para el diseño de la instalación de
depuración. A continuación, se presentan las variables y parámetros fundamentales para el diseño del
tratamiento secundario (Tabla 10.1 y 10.2).

Tabla 10.1. Variables fundamentales.

Variable

pH 6,5 ≤ pH ≤ 8

Temperatura 8 ≤ T ≤ 40 °C

Oxígeno disuelto 1,0 ≤ OD ≤ 3,0

Demanda química Medida del contenido total de materia orgánica (biodegradable +

de oxígeno (DQO) no biodegradable) presente en la muestra de agua residual.

Demanda biológica Medida del contenido de materia orgánica biodegradable presente

de oxígeno (DBO5) en la muestra de agua residual.

Medida del nivel de contaminación de las aguas. Si es >0,4 el

efluente es biodegradable y puede ser tratado por tratamientos
Relación DBO5/DQO
biológicos. Si es <0,3 el efluente será poco biodegradable y es
conveniente someterlo a tratamientos físico-químicos.

Sólidos suspendidos
Medida de la cantidad de biomasa en el reactor.
(SS) mg/L

Sólidos sedimentables Medida del volumen de biomasa. Se mide el volumen de sólidos

(SSed.) mL/L que sedimentan luego de un período de reposo.

Concentración de
Importante para el diseño del tratamiento terciario.
nitrógeno y fósforo

Tabla 10.2. Parámetros fundamentales.

Parámetro Fórmula

Índice volumétrico volumen de biomasa SSed

de lodos (mL/g)
SVI = =
concentración de biomasa SS

Carga orgánica (DBO5 o DQO) . caudal volumétrico

(kg/m3.día) CV =
volumen del reactor

Relación carga orgánica de entrada CV

sustrato/biomasa
F/M = =
concentración de biomasa SS

Los valores óptimos de CV y F/M se encuentran tabulados, pudiendo obtener el volumen del
reactor con las fórmulas dadas. Además, durante el funcionamiento de la planta, se debe tratar
de mantener la relación óptima F/M, por ej., si el valor fuese menor al rango adecuado, significa
que hay demasiado barro, y habría que eliminar un poco para alcanzar la relación óptima.

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 BIOTECNOLOGÍA

10.2. TRATAMIENTO BIOLÓGICO EXTENSIVO

En la medida que se disponga de extensas áreas de terreno, puede pensarse en realizar una
depuración natural de los líquidos residuales, mediante lagunas de estabilización. Es importante asegurar
la adecuada impermeabilización del fondo y superficies laterales, a efectos de no contaminar las napas
de aguas subterráneas. En función de la carga orgánica por unidad de superficie con que se diseñan las
lagunas de estabilización, se las puede clasificar de la siguiente manera.

10.2.1. Lagunas anaeróbicas

Se utilizan para estabilizar los sólidos que se separan por sedimentación de la corriente de efluentes
a tratar. Se construyen con profundidades del orden de los 4 a 6 metros. Prácticamente en este tipo de
lagunas no existe oxígeno disuelto en todo su volumen, por lo tanto, en función de las características del
proceso anaeróbico, y al estar abiertas al ambiente, generan malos olores. Por esto, su empleo puede
aceptarse en zonas rurales, alejadas de centros poblados, donde el problema ambiental que pueda generar
no sea significativo. El rendimiento de depuración de este tipo de lagunas es del 40-50%, con un tiempo
de retención hidráulico usual de 3 a 5 días.

10.2.2. Lagunas aireadas

Cuando sea necesario lograr un líquido tratado de buena calidad, se recurre al empleo de aireación
mecánica para garantizar que el proceso se realice en condiciones aeróbicas. Si bien la superficie
ocupada por las instalaciones disminuye, aumentan considerablemente los gastos de operación (energía
eléctrica) y mantenimiento de los aireadores (que funcionan las 24 horas del día y durante todo el año).
El rendimiento de depuración de este tipo de laguna es del 50-60%, lo cual se debe a la condición
de mezcla que existe en el medio, determinando que el líquido de salida contenga sólidos en suspensión
biodegradables que consecuentemente disminuyen el rendimiento de depuración. Entonces, este tipo de
laguna aireada debe ir acompañada posteriormente por otra de tipo facultativa, donde los sólidos puedan
sedimentar y realizarse una depuración adicional, lográndose una eficiencia global del 90%.

10.2.3. Lagunas facultativas

Este tipo de laguna puede utilizarse como única etapa de depuración, diseñada de tal manera que
permita que el oxígeno del aire se disuelva en el agua a tratar, o también como laguna de afinamiento
del efluente ya tratado en pasos anteriores (laguna anaeróbica y/o laguna aireada). Se proyectan con un
tiempo de retención hidráulico de 10 a 12 días, y una profundidad estimada entre 1,50 a 1,80 metros,
operando con una eficiencia del 70-80%.
Con el tiempo, los sólidos sedimentados propios del líquido cloacal o los generados en la laguna
aireada, van reduciendo la altura útil de la laguna facultativa, lo que determina una cierta vida útil. En
consecuencia, será necesario construir otra laguna para permitir que la primera pueda dejarse secar
durante un período de tiempo de varios años, para luego poder extraer el barro depositado. Sin embargo,
puede darse el caso, según las características propias de cada lugar, que la napa freática se encuentre
alta en forma permanente impidiendo que la laguna pueda secarse. En este caso se deben extraer los
barros en forma mecánica y enviarse a una playa de secado.

10.3. TRATAMIENTO BIOLÓGICO INTENSIVO

Cuando no se disponga de grandes extensiones de terreno para la construcción de sistemas de
saneamiento de tipo extensivo, se hace necesario proyectar y construir sistemas de tipo intensivo, que

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 BIOTECNOLOGÍA

implica el uso de obra civil y el de maquinaria de proceso, con el consiguiente consumo de energía para
su funcionamiento.

10.3.1. Lechos percoladores

Dentro de los sistemas de tratamiento intensivos aeróbicos con menor consumo de energía y
superficie de terreno, se encuentran los lechos percoladores o lechos bacterianos (Figura 10.1). El
principio de funcionamiento consiste en hacer caer el líquido a tratar, en forma de lluvia, sobre una masa
de material de gran superficie específica, que sirva como soporte a los microorganismos depuradores,
los cuales forman sobre el relleno una película (biofilm) adherida al mismo. La aireación necesaria que
mantiene a los microorganismos del biofilm en condiciones aeróbicas, se produce por tiro natural, en
virtud de la alta porosidad del lecho utilizado, el cual deja canales en todo su espesor para la circulación
del aire.
El relleno poroso se puede realizar con piedras de tamaños de 5 a 9 cm, o también con piezas de
material plástico liviano. La recirculación del efluente tratado sobre el lecho percolador mejora la
eficiencia del tratamiento, evita la obstrucción del filtro y reduce los problemas derivados de olor y
moscas en verano. El rendimiento habitual de esta alternativa es del 70-75%.

Fig. 10.1. Esquema de un lecho percolador.

10.3.2. Sistemas por barros activados

El procedimiento por barros activados consiste en desarrollar un cultivo bacteriano aeróbico,
disperso en forma de flóculos en un tanque aireado, el cual es alimentado con el líquido residual que
debe ser depurado. En este tanque, la materia orgánica se degrada por acción metabólica de la flora
bacteriana en CO2 y agua, eliminándose la carga contaminante de tipo orgánico. El suministro del aire
se realiza mediante aireadores mecánicos o con difusores colocados en la base del tanque, con el fin de
evitar sedimentos y otorgar la agitación necesaria para homogeneizar la mezcla de los flóculos
bacterianos con el agua residual. Luego de un tiempo de contacto suficiente, el líquido tratado se envía
a un clarificador (sedimentador) destinado a separar el agua depurada de los lodos bacterianos, que se
recirculan al tanque de aireación para seguir con el tratamiento en forma continua (Figura 10.2).
Finalmente, el líquido clarificado se debe clorar para reducir la concentración de microorganismos
patógenos, y obtener una corriente totalmente inocua.
Es necesario tener en cuenta que la concentración de la masa bacteriana en el tanque de aireación
se debe mantener tan alta como sea posible a fin de obtener un efluente cuyo sustrato esté casi agotado.
Sin embargo, hay un límite práctico de 4-5 g biomasa/L por encima de la cual los sistemas de barros

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 BIOTECNOLOGÍA

activados normalmente no operan, debido a la dificultad para el asentamiento y aireación de los barros.
Este sistema de tratamiento es muy eficiente en cuanto a los niveles de depuración que puede alcanzar,
del orden del 90-95%; pero los montos de inversión son muy altos, como así también el costo de
funcionamiento y mantenimiento.

Fig. 10.2. Esquema del sistema de barros activados.

10.3.3. Sistemas de digestión anaeróbica

La digestión anaerobia es un proceso biológico en el que la materia orgánica, en ausencia de
oxígeno, y mediante la acción de un grupo de bacterias específicas, se descompone en productos
gaseosos, también llamado biogás (CH4 y CO2, con trazas de H2, H2S, etc.), y en digestato, que es una
mezcla de productos minerales (N, P, K, Ca, etc.) y compuestos de difícil degradación (Figura 10.3). El
proceso controlado de digestión anaerobia es uno de los más idóneos para la reducción de emisiones de
efecto invernadero, el aprovechamiento energético de los residuos orgánicos, y el mantenimiento y
mejora del valor fertilizante de los productos tratados.

Fig. 10.3. Esquema del sistema de digestión anaeróbica.

El sistema se diseña con uno o varios digestores que operan a temperatura mesófila (35-37 °C) o
termófila (55-60 °C). Consta de varias fases durante la degradación del sustrato e involucra diferentes
especies microbianas. Comienza con la hidrólisis de la materia orgánica, y posteriormente bacterias
acidogénicas generan ácidos de cadena corta en la acidogénesis. Algunas bacterias acetogénicas pueden
derivar estos ácidos en acetato, mientras que otras producen CO2 y H2. Finalmente, en la última fase, las

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 BIOTECNOLOGÍA

bacterias metanogénicas utilizan estos compuestos para generar gas metano (CH4), a partir del hidrógeno
o bien, a partir del acetato.
En general, la velocidad del proceso está limitada por la velocidad de la etapa más lenta, la cual
depende de la composición de cada residuo. Para sustratos solubles la fase limitante es la metanogénesis,
ya que las bacterias que realizan las fases de hidrólisis y acidogénesis tienen velocidades de crecimiento
más rápidas que las metanogénicas. Para aumentar la velocidad, la estrategia consiste en adoptar diseños
que permitan una elevada concentración de microorganismos acetogénicos y metanogénicos en el
reactor. Con esto se pueden conseguir sistemas con tiempo de proceso del orden de días. En cambio,
para residuos en los que la materia orgánica esté en forma de partículas, la fase limitante es la hidrólisis,
proceso enzimático cuya velocidad depende de la superficie de las partículas. Usualmente, esta
limitación hace que los tiempos de proceso sean del orden de dos a tres semanas. Para aumentar la
velocidad, una de las estrategias es el pretratamiento del sustrato para disminuir el tamaño de partículas
o ayudar a la solubilización (maceración, ultrasonidos, tratamiento térmico, entre otros).
Los sistemas de digestión anaerobia pueden aplicarse, entre otros, a residuos ganaderos, agrícolas,
así como a los residuos de las industrias de transformación de dichos productos. También es un proceso
adecuado para el tratamiento de aguas residuales de alta carga orgánica, como las producidas en muchas
industrias alimentarias, y es ampliamente utilizado como método de estabilización de lodos resultantes
del tratamiento aeróbico de efluentes.

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