SINTESIS DE RNA EN EUCARIOTAS

Blga. Roxana Mestas Valdivia Profesor Asociado Tiempo Parcial 20 Horas Departamento de Biologa Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias Universidad Nacional de San Agustn

 En la clula eucariota, la transcripcin tiene lugar en el ncleo y la traduccin en el citoplasma. En eucariotas la cromatina que contiene la secuencia promotora tiene que ser accesible a la maquinaria de transcripcin. En eucariotas la transcripcin la realizan 3 tipos de RNA polimerasas La clula eucariota tiene una regulacin de la transcripcin mas compleja, en la que participan numerosos factores de transcripcin. El RNA eucariota sufre un extenso proceso de procesamiento y maduracin.

La transcripcin y la traduccin son procesos simultneos.

La transcripcin y la traduccin no son procesos simultneos.

Las RNAs polimerasas

Mltiples subunidades: 8 -12 3 RNA polimerasas: De los procariontes De Bacteria Central De Archea Central A/A B D L K [+ otras 6] RNAP I (Pol I) RPA1 RPA2 RPC5 RPC9 RPB6 [+ otras 9] De los eucariontes RNAP II (Pol II) RPB1 RPB2 RPB3 RPB11 RPB6 [+ otras 7] RNAP III (Pol III) RPC1 RPC2 RPC5 RPC9 RPB6 [+ otras 11]

Desde el punto de vista estructural, estas polimerasas son similares entre s Desde el punto de vista funcional, son bastante distintas.

En eucariotas la transcripcin la realizan 3 tipos de RNA polimerasas

Polimerasa
RNA polimerasa I RNA polimerasa II

Localizacin
Nuclelo Ncleo

Genes transcritos
Genes de RNA ribosmico (rRNA) 28S; 18S y 5.8S Genes que codifican protenas (mRNA), genes de la mayora de los RNA nucleares pequeos (snRNA: U1,U2,U4,U5), genes de micro-RNA (miRNA) Genes de RNA de trasnferencia (tRNA), rRNA 5S,snRNA U6, RNA nucleolares pequeos (snoRNA)

RNA polimerasa III

Ncleo

Cada una trabaja sobre un grupo diferentes de genes, sin posibilidad de intercambio.

Transcripcin de los genes de clase I

El promotor de la RNA pol I se localiza en la regin anterior al

punto de inicio.
Promotor central o core. Rico en GC + regin conservada rica en AT en Inr. Unin de factor SL1 (TBP + 3 Prot.) Posicionamiento RNA pol I UCE (elemento de control corriente arriba) Unin de factor UBF Aumento de frecuencia de iniciacin

Ensamblaje del complejo de preiniciacin:

UBF se une a UCE SL1 se une a las dos regiones del promotor La RNA polI se une al elemento central

Posible esquema para la terminacin de la transcripcin de la RNA pol I

Reb1p / TTF-1, se une al DNA en una secuencia de reconocimiento localizada de 12 a 20 pb corriente abajo de la terminacin de la transcripcin. PTRF (factor de liberacin de pol I y transcrito) induce la disociacin de la polimerasa y el transcrito del DNA molde

Reb1p en Saccharomyces cerevisiae TTF-1 en ratones

Transcripcin de los genes de clase III

Los promotores de la RNA pol III

Tipo 1:genes del rRNA 5S Tipo 2: genes de tRNA Tipo 3: genes de algunos snRNA

Transcripcin de los genes de clase II

RNA polimerasa II

Dominio CTD: dominio carboxilo terminal de RPB1 con mltiples repeticiones de la secuencia

YSPTSPS, regulable por fosforilacin. Participan en el reconocimiento de seales de activacin y en la iniciacin de la Transcripcin. CTD no fosforilado, RNApol II puede iniciar la transcripcin pero no puede elongar CTD fosforilado, RNApol II puede elongar pero no iniciar

Los promotores de la RNA pol II se localizan en el lado 5 del

centro de iniciacin de la transcripcin:
BRE (elemento de reconocimiento para TFIIB) TATA (caja TATA) Inr (elemento iniciador) DPE (elemento promotor corriente a bajo)

La RNA polimerasa II no es capaz de reconocer a los promotores. Necesita factores de transcripcin para la iniciacion: TFII (A, B, C, D, ..) Los factores de transcripcin se unen primero a una secuencia especifica del DNA, y luego se unen entre ellos y a la RNA polimerasa.

Factores de transcripcin generales (GTF)

Cantidad de subunidades
2 1 1 11 2 3 9

GTF
TFIIA (factor de tarnscripcin para la polimerasa II A) TFIIB (factor de tarnscripcin para la polimerasa II B) TFIID (factor de tarnscripcin para la polimerasa II D) TBP (protena de unin a TATA) TAF (factores asociados a la protena de unin a TATA) TFIIE (factor de tarnscripcin para la polimerasa II E) TFIIF (factor de tarnscripcin para la polimerasa II F) TFIIH (factor de tarnscripcin para la polimerasa II H)

Las cantidades indicadas corresponden a las levaduras, pero son similares en otros eucariontes, incluidos los seres humanos.

GTF
TFIIA

Funcin
Se une corriente arriba del sitio de unin del factor TFIID y aparentemente estabiliza la unin TFIID-DNA, adems parece poseer una actividad antirepresora. Junto con TFIIA permiten la unin de la RNA polimerasa la cual est asociada al TFIIF, se une corriente abajo del sitio de unin de TFIID. El TFIIF aumenta la afinidad de la RNA polimerasa por el promotor y estabiliza su interaccin con el DNA. Influye en la seleccin del punto de inicio de la transcripcin, tambin parece poseer una actividad helicasa.

TFIIB

TFIID

TBP TAF

Define el sitio de inicio de la transcripcin. Reconocimiento de la secuencia TATA y, posiblemente, la secuencia Inr, forma una plataforma par la unin de TFIIB Reconocimiento del promotor central; regulacin de la unin de TBP Recluta a TFIIH y modula su actividad helicasa y posiblemente favorece la desnaturalizacin del promotor. Suprime las uniones no especficas de DNA y estabiliza el complejo de preinicializacin . Acta como helicasa y como quinasa. Como helicasa contribuye a la apertura de la doble hlice durante la transcripcin, y como quinasa fosforila el extremo carboxi-terminal de la RNA pol II.

TFIIE TFIIF TFIIH

Eventos generales de la transcripcin del DNA por la RNA polimerasa II

Ensamblaje: Construccin secuencial y ordenada del complejo de inciacin
Hasta el complejo de preiniciacin

1. Reconocimiento del promotor 2. Unin de la RNApol II (CTD desfosforilado)

Iniciacin: Desenrollado del molde y activacin de la polimerizacin.

1. Apertura del complejo 2. Activacin de la RNApol II 3. Fosforilacin del CTD

Hasta el desalojo del promotor

Elongacin: Crecimiento del trascrito por polimerizacin de NTPs sobre el molde.

1. Disociacin de GTF 2. Reclutamiento de factores de elongacin 3. Reclutamiento por CTD de RNPs para procesado

Mientras no termina

Terminacin: Acoplamiento de corte y poliadenilacin con terminacin.

Reclutamiento del complejo de poliadenilacin Corte y liberacin del transcrito (desactivacin de la RNApol) Poliadenilacin 3

ENSAMBLAJE DE LA RNApol II SOBRE EL PROMOTOR

1. Unin del factor TFIID al compartimento TATA. 2. Unin consecutiva de los factores TFIIA, IIB al compartimento TATA. 3. Reclutamiento de RNApol II unida a TFIIF. 4. Formacin del complejo cerrado de transcripcin mediante la unin de TFIIE y de TFIIH.

In vivo, el Inicio de la Transcripcin requiere protenas adicionales

Figura 1: La maquinaria transcripcional de levaduras El esquema representa la regin del inicio del gen (lnea negra). El promotor (flecha negra) recluta factores generales de transcripcin (GTFs, valos rosas). El complejo mediador (valos celestes, rojos y amarillos) acta de puente entre los coactivadores que recluta el enhancer (valos verdes) y los GTFs. Esto permite a la RNA polimerasa II reconocer a la regin promotora del gen e iniciar la transcripcin. Adaptado de (1).

En eucariotas los nucleosomas reprimen la transcripcin de todos los genes. Solo los genes activados son transcritos. Los activadores de la transcripcin unidos a sitios cercanos al gen reclutan complejos modificadores y remodelares de los nucleosomas y el complejo mediador, que en conjunto forman el complejo de pre-iniciacin.

Iniciacin de la transcripcin por la RNA pol II

CTD desfosforilado y unido a los mediadores y componentes del Aparato Bsico de Transcripcin. Tras la apertura del promotor se inicia la transcripcin.

Apertura del promotor

TFIIH

Abre la doble helice (helicasa) Fosforila CTD (quinasa) Promueve la separacin de la RNApol del promotor para iniciar la transcripcin

La fosforilacin del CTD promueve la separacin de la RNApol II del promotor. La elongacin del RNA naciente continua.

Fosforilacin de CTD

CTD (dominio carboxi terminal) constituido por repeticiones en tmden (mamferos 52 repeticiones) de la secuencia consenso heptapptica (tyr-ser-pro-treo-ser-pro-ser ) rica en Ser

Elongacin y Terminacin de la transcripcin por la RNA pol II

Despus de la fosforilacin del CTD y lejos del promotor, se reclutan los componentes para el splicing del pre-mRNA.

La RNA polimerasa II alcanza las seales de terminacin y factores requeridos para el clivaje y poliadenilacin.

Factores de elongacin
El TFIIS impide la detencin (suspensin completa de la elongacin). La elongina, TFIIS, CSB y ELL suprimen la pausa de la RNA polimerasa II, que puede aparecer cuando la enzima transcribe una regin donde se pueden formar pares de bases intracatenarios (por ejemplo una horquilla). El factor de elongacin FACT que facilitan la produccin de transcritos largos de RNA mediante la modificacin de las histonas (H2A y H2B) prximas al promotor. El Elongator se une a molculas de RNA polimerasa II con CTDs altamente fosforilados. Es un factor de elongacin que contiene actividad histona acetiltransferasa; que podra cambiar el estado de acetilacin de las regiones activamente transcritas.

Poliadenilacin y terminacin

CPSF: Factor de especificidad de poliadenilacin y

escisin interacta con el factor FTIID CstF: Factor estimulante de la escisin PADP: Protena de unin a poliadenilato

Secuencia de la seal poli(A):

localizada 10 a 30 nt corriente arriba del sitio de poliadenilacin Dinucletido 5-CA-3 Regin rica en GU

Maduracin de los RNA

Maduracin de los RNA Ribosmicos y de Transferencia

Eliminacin de intrones del pre-mRNA nuclear

El pre-ARN mensajero est formado por secuencias codificantes denominadas exones separados por secuencias no codificantes denominadas intrones.

El proceso de eliminacin de los intrones se realiza en el ncleo, mediante un mecanismo muy complejo denominado splicing.

TIPO DE INTRON
Intrones GU-AG Intrones AU-AC Grupo I Grupo II Grupo III Intrones gemelos Intrones de pre-tRNA

LOCALIZACION
Pre-mRNA nuclear eucarionte Pre-mRNA nuclear eucarionte Pre-rRNA nuclear eucarionte, RNA de rganulos, pocos RNA bacterianos RNA de orgnulos, algunos RNA procariontes RNA de orgnulos RNA de orgnulos Pre-tRNA nuclear eucarionte

Intrones GU-AG

Todos los intrones poseen una secuencia interna importante que se denomina centro de ramificacin. Esta secuencia se sita entre 20 y 50 nucletidos secuencia arriba del sitio de empalme 3. Los puntos de corte y empalme se especifican mediante las secuencias situadas en los extremos de los intrones

El grupo 2-OH de un nucletido dentro del intrn ataca el enlace fosfodister que liga el primer exn con el intrn El grupo 3-OH libre del exn 1 ataca el enlace fosfodister entre el intrn y el exn 2

Complejo de compromiso

Mecanismo de Splicing
Complejo de compromiso inicia una actividad de corte y empalme. Comprende: U1-snRNP SF1, U2AF35, U2AF65 Complejo pre-empalmosoma comprende: El complejo de compromiso U2-snRNP La asociacin entre U1-snRNP y U2-snRNP acerca el sitio de corte y empalme 5 al punto de ramificacin Empalmosoma se forma cuando se unen U4/U6snRNP y U5-snRNProtena de unin al punto de ramificacin

Complejo pre-empalmosoma

Empalmosoma

Protenas SR, importantes en la eleccin del sitio de corte y empalme ESE (Potenciadores de corte y empalme exnico), interacta con SR ESS (Silenciadores de corte y empalme exnico), homlogos a ESE CASP (protenas de tipo SR asociadas con CTD) SCAF (factores de tipo SR asociados con CTD) Establecen conexin fsica entre el empalmosoma y el CTD del complejo de transcripcin del la RNA pol II, actundo como eslabn entre la elongacin y el procesamiento del transcrito

Mecanismo de Splicing alternativo

Regulacin del corte y empalme durante la expresin de genes involucrados en la determinacin del sexo de

Drosophila

En machos, el mRNA contiene todos los exones, pero esto implica que se produce una protena truncada, porque el exn 3 contiene un codn de terminacin. En las hembras se saltea el exn 3, lo que da origen a una protena SXL funcional.

En las hembras, SXL bloque el sitio de corte y empalme 3 del primer intrn del pre-mRNA de tra. U2AF65 es incapaz de localizar este sitio y, en cambio, dirige el corte y empalme a un sitio crptico del exn 2. Esto da como resultado un mRNA que codifica una protena TRA funcional. En los machos, no hay SXL, de manera que el sitio de corte de empalme 3 no resulta bloqueado y se produce un mRNA disfuncional.

Degradacin de los RNA Eucariontes

Procesos de Degradacin
1. Complejo multiproteico denominado exosoma. Degrada transcritos en direccin 3 5 y contiene nucleasas relacionadas con las enzimas del degradosoma. 2. Desencapuchamiento dependiente de desadenilacin. Eliminacin de cola de poli(A). Escisin de la caperuza 5 por la enzima Dcp1p. 3. Degradacin del RNA mediada por mutaciones terminadoras (NMD) o Vigilancia del mRNA.

Transporte de RNA dentro de la Clula Eucarionte

1. Se movilizan usando los complejos de poros nucleares 2. Protenas receptoras Carioferinas Exportinas Importinas 3. Necesitan energa, proporcionada por la protena Ran (GTP en GDP).

Inhibidores de la transcripcin
Rifamicina B (Streptomyces
Antibitico que inhibe la RNA polimerasa procariota pero no la eucariota. Bloquea la elongacin por unin a la subunidad e impide el desalojo del promotor.
mediterranei).Rifampicina (derivado semisintetico).

-Amanitina.

Toxina contenida en la seta Amanita phalloides (octapptido). Inhibe predominantemente la RNA polimerasa II. Forma con ella un complejo e impide la elongacin.

Cordicepina (hongo Cordyceps).

Antibitico antitumoral terminador de cadena de la transcripcin. Se incorpora a la cadena en crecimiento y la detiene, ya que carece del grupo 3-OH a partir del cual puede continuar la elongacin.

Actinomicina D (Streptomyces).

Se une al DNA de doble hlice de forma especfica. Inhibe la transcripcin y la replicacin. Adems de su uso como antibitico tambin se usa en carcinoterapia.