MÉTODO HORIZONTAL PARA LA INVESTIGACIÓN DE Listeria monocytogenes

“Basado en la norma ISO 11290-1 (Diciembre 1997)”

Definición:

Listeria monocytogenes: Microorganismos que forman colonias características en los medios

selectivos especificados y que poseen las características bioquímicas, morfológicas y
fisicoquímicas descritas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

Medios de cultivo:

 Caldo Fraser semi (FS).

 Caldo Fraser completo (FC).
 Agar OXFORD.
 Agar PALCAM.
 Agar triptona de soja-extracto de levadura (TSYEA)
 Agar sangre (AS).
 Caldo para la utilización de los glúcidos (ramnosa y xilosa).
 Agar SIM.

Reactivos:

 Solución de peróxido de hidrógeno.

 Suplemento para el medio Fraser semi.
 Suplemento para el medio Fraser completo.

Cepas:

 Cepa de Rhodococcus equi (ATCC 25923)

 Cepa de Staphylococcus aureus (ATCC 6939).
 Listeria monocytogenes (ATCC 7644)

Siembra:

Pre-enriquecimiento:

•Preparar la dilución madre añadiendo 225 mL de FS a 25 mL o 25 g de muestra ( x mL o x g. de

muestra + 9 x ml. de medio).

• Incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.

Enriquecimiento:

•Sembrar 0,1 mL del cultivo en un tubo con FC.

• Incubar a 37°C ± 1°C durante 48 h + 2 h.

Aislamiento:

•Sembrar el cultivo de pre-enriquecimiento en agar OXFORD.

• Sembrar el cultivo de pre-enriquecimiento en agar PALCAM.

•Sembrar el cultivo de enriquecimiento en agar OXFORD.

•Sembrar el cultivo de enriquecimiento en agar PALCAM.

• Incubar a 37°C ±1°C durante 24 h± 2 h (+ 24 h si es necesario).

NOTA 1: En agar OXFORD, al cabo de 24 h de incubación, las colonias de Listeria spp son
pequeñas, de color grisáceo, rodeadas de un halo negro. Después de incubar 24 h más, doblan
su tamaño, se vuelven más oscuras, a veces con reflejos verdosos, apareciendo un halo negro y
una depresión central.

En agar PALCAM, al cabo de 24 h de incubación, las colonias de Listeria spp. son pequeñas de
color verde con reflejos grisáceos, eventualmente con un centro negro y siempre rodeados de
un halo negro. Después de incubar 24 h más, aparece una depresión central.

6. Confirmación de Listeria sp:

• A partir de cada placa incubada, tomar 5 colonias presuntivas de Listeria spp. (si una tiene
menos de 5 colonias, retenerlas todas).

• Aislar en TSYEA.

• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h-24 h (o hasta que haya un desarrollo satisfactor

NOTA 2: En el medio TSYEA, las colonias de Listeria spp. son pequeñas, convexas, loras,
translúcidas y con bordes regulares.

Prueba de la catalasa:

Realizar la prueba en una colonia aislada en TSYEA.

Coloración de Gram:

Las colonias de Listeria spp. se presentan en forma de pequeños y finos bacilos Gram

Examen de movilidad:

•Sembrar por picadura una colonia en AM.

• Incubar a 25°C 1°C durante 48 h (+ 3 días si es necesario).

• Examinar el desarrollo alrededor de la picadura. Listeria spp. son móviles y dan un cultivo
pico en forma de sombrilla.

7. Confirmación de Listeria monocytogenes:

Investigación de la hemólisis:

•Sembrar por picadura en AS una colonia aislada en TSYEA.

•Sembrar cultivos de control positivo (Listeria monocytogenes) y negativo (Listeria)

• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h±2 h.

•Examinar con luz blanca. Listeria monocytogenes presenta una estrecha zona de clara genera
ẞ-hemólisis.

Utilización de glúcidos:

• Sembrar en xilosa y ramnosa una colonia aislada en TSYEA.

• Incubar a 37°C ± 1°C durante 5 días. La reacción es positiva si aparece una coloración
amarilla.
Test de CAMP:

•Sembrar en paralelo en AS las cepas de Rhodococcus equi y de Staphylococcus aure

• Sembrar en perpendicular las cepas problema, junto con dos cepas control de Listeria
monocytogenes y Listeria innocua).

NOTA 3: La reacción es positiva si hay un aumento de la zona de B-hemólisis en la intersección

de la cepa a ensayar con cada uno de los otros cultivos.

REQUERIMIENTO DE MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO CON LA NORMA ISO 11290-1

MEDIO DE CULTIVO OBSERVACIONES

 Caldo Fraser semi (FS). Contiene suplemento
 Caldo Fraser completo (FC). Contiene suplemento
 Agar OXFORD. De acuerdo con la formulación
puede requerir suplemento
 Agar PALCAM. De acuerdo con la formulación
puede requerir suplemento
 Agar triptona de soja-extracto de
levadura (TSYEA)
 Caldo para la utilización de los
glúcidos (ramnosa y xilosa).
CEPAS ATCC
 Cepa de Rhodococcus equi (ATCC 25923)
 Cepa de Staphylococcus aureus (ATCC 6939)
 Listeria monocytogenes (ATCC 7644)

NOTA: La lista es en base a partes de las ISO de la primera parte, para más comprensión y
entendimiento se solicita la compra de ambas ISO que se encuentran en el catálogo de
IBNORCA

ISO 11290-1 Y ISO 11290-2

En la versión 2 muestra el método actual que incluye un método más sencillo con el uso del
medio cromógeno
ISO 11920-2:2017 Microbiología de la cadena alimentaria — Método horizontal para la
detección y enumeración de Listeria monocytogenes y de Listeria spp. — Parte 2: Método de
enumeración

Se adjunta una tabla que posee 2 colores:

 verde (Medio que se tiene en laboratorio)

 amarillo (medio, reactivo y cepa que se requiere en laboratorio)

ETAPA MEDIO DE CULTIVO

PREPARACION DE LA MUESTRA BUFFER DE AGUA PEPTONADA
SEMBRADO AGAR CROMOGENO
Listeria Agar (Base) acc. OTTAVIANI and
AGOSTI
*CM 1080 MEDIO
*SR0257E SUPLEMENTO
*SR0258E SUPLEMENTO
CONFIRMACION AGAR NUTRITIVO

AGAR SOYA TRIPTICASA CON EXTRACTO DE

LEVADURAS
AGAR SANGRE
PRUEBAS BIOQUIMICAS MB1128A
MB1249A
PRUEBA DE CATALASA KG55555 CATALASA DE 30 ml
CEPA ATCC Listeria monocytogenes ATCC 7644

REQUERIMIENTO DE MEDIO DE CULTIVO PARA Bacillus coagulans:

*Glucose Yeast Extract Agar. (de acuerdo a la formulación puede requerir o no una solución
mineral)