FARMACOPEA EUROPEA 9.0 2.6.

12 Pruebas de recuento microbiano

07/2010:20612

2.6.12. EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS NO ESTÉRILES: PRUEBAS

DE RECUENTO MICROBIANO(1)

1. INTRODUCCIÓN

Las pruebas aquí descritas permiten el recuento cuantitativo de bacterias mesófilas y hongos que
pueden crecer en condiciones aeróbicas.

Las pruebas están diseñadas principalmente para determinar si una sustancia o preparación cumple
con una especificación establecida para la calidad microbiológica. Cuando se usan para tales
propósitos, seguir las instrucciones que se presentan a continuación, incluyendo el número de
muestras que se deben tomar, e interpretar los resultados como se indica a continuación.

Los métodos no se aplican a productos que contienen microorganismos viables como ingredientes
activos.

Se pueden usar procedimientos microbiológicos alternativos, incluyendo métodos automatizados,

siempre y cuando se haya demostrado su equivalencia con el método farmacopeico.

2. PROCEDIMIENTOS GENERALES

Realizar la determinación en condiciones diseñadas para evitar la contaminación microbiana

extrínseca del producto por examinar. Las precauciones tomadas para evitar la contaminación
deben ser tales que no afecten a los microorganismos que se van a revelar en la prueba.

Si el producto por examinar tiene actividad antimicrobiana, ésta se debe eliminar o neutralizar tanto
como sea posible. Si se usan inactivadores para este propósito, se debe demostrar su eficacia y su
ausencia de toxicidad para los microorganismos.

Si para la preparación de la muestra se usan sustancias tensoactivas, se debe demostrar su ausencia

de toxicidad para los microorganismos y su compatibilidad con los inactivadores.

3. MÉTODOS DE RECUENTO

Usar el método de filtración por membrana o los métodos de recuento en placa, según se indique.
El método del número más probable (NMP) es generalmente el método de recuento microbiano
menos exacto; sin embargo, para algunos grupos de productos con una biocarga muy baja, puede
resultar el método más apropiado.

La elección del método se basa en factores tales como la naturaleza del producto y el límite de
microorganismos requerido. El método seleccionado debe permitir que se someta a prueba un
tamaño de muestra suficiente para juzgar el cumplimiento con la especificación. Se debe establecer
la idoneidad del método seleccionado.

(1)
Este capítulo ha sido armonizado entre las farmacopeas. Vea el capítulo 5.8. Armonización farmacopeica.

1
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4. PRUEBA DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO, IDONEIDAD DEL MÉTODO DE

RECUENTO Y CONTROLES NEGATIVOS

4-1. CONSIDERACIONES GENERALES

Se debe establecer la habilidad de la prueba para detectar microorganismos en presencia del producto
por examinar.
Se debe confirmar la idoneidad si se introduce un cambio en la ejecución de la prueba o en el
producto, que pudiera afectar el resultado de la prueba.

4-2. PREPARACIÓN DE LAS CEPAS DE PRUEBA

Usar suspensiones estables estandarizadas de cepas de prueba o prepararlas como se indica a
continuación. Se usan técnicas de mantenimiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote
de siembra), de forma tal que los microorganismos viables empleados para inoculación
correspondan a no más de 5 pases a partir del lote de siembra maestro original. Cultivar por
separado cada cepa de prueba de bacterias y hongos como se indica en la Tabla 2.6.12.-1.

Para preparar las suspensiones de prueba, usar una solución amortiguada de cloruro de sodio–
peptona pH 7.0 o una solución amortiguadora de fosfato pH 7.2; para suspender esporas de A.
brasiliensis, se puede agregar en la solución amortiguadora 0.05% de polisorbato 80. Utilizar las
suspensiones dentro de 2 horas o dentro de 24 horas si se almacenan a una temperatura entre 2 y
8ºC. Como alternativa para la preparación y posterior dilución de una suspensión fresca de las
células vegetativas de A. brasiliensis o B. subtilis, preparar una suspensión estable de esporas y
luego usar un volumen apropiado de la suspensión de esporas para la inoculación de prueba. La
suspensión estable de esporas puede mantenerse a una temperatura entre 2 y 8ºC durante un
período de tiempo validado.

4-3. CONTROL NEGATIVO

Para verificar las condiciones de prueba, se realiza un control negativo utilizando el diluyente
seleccionado en vez de la preparación de prueba. No debe haber crecimiento de microorganismos.
También se realiza un control negativo cuando la prueba de los productos se realiza como se
describe en la sección 5. Una falla del control negativo requiere una investigación.

4-4. PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO DE LOS MEDIOS

Analizar cada lote de medio listo para usar y cada lote de medio preparado a partir de medio
deshidratado o de los ingredientes indicados.

Inocular porciones/placas de caldo digerido de caseína y soya y gar digerido de caseína y soya con
un número pequeño (no más de 100 UFC) de los microorganismos indicados en la Tabla 2.6.12.-1,
empleando una porción/placa separada de medio para cada uno. Inocular placas de Agar Sabouraud
Dextrosa con un número pequeño (no más de 100 UFC) de los microorganismos indicados en la
Tabla 2.6.12.-1, empleando una placa separada de medio para cada uno. Incubar de acuerdo a las
condiciones descritas en la Tabla 2.6.12.-1.

Para los medios sólidos, el crecimiento obtenido no debe diferir en un factor mayor de 2 con
respecto al valor calculado para un inóculo estandarizado. Para un inóculo recién preparado, ocurre
un crecimiento de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con un lote de medio
previamente analizado y aprobado. Los medios líquidos son adecuados si se produce un
crecimiento claramente visible de microorganismos, comparable al obtenido previamente con un
lote de medio analizado y aprobado previamente.

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Tabla 2.6.12.-1. – Preparación y uso de los microorganismos de prueba

Microorganismo Preparación de la Promoción del crecimiento Adecuabilidad del método de
cepa de prueba recuento en presencia del producto
Recuento total de Recuento total de Recuento total de Recuento total de
microorganismos levaduras microorganismos levaduras
aerobios y hongos aerobios y hongos
Staphylococcus Agar digerido de Agar digerido de Agar digerido de
aureus caseína y soya o caseína y soya y caseína y
por ejemplo: caldo digerido de caldo digerido de soya/NMP caldo
ATCC 6538 caseína y soya caseína y soya digerido de
- -
NCIMB 9518 30-35°C ≤ 100 UFC caseína y soya
CIP 4.83 18-24 h 30-35ºC ≤ 100 UFC
NBRC 13276 ≤ 3 días 30-35ºC
≤ 3 días
Pseudomonas Agar digerido de Agar digerido de Agar digerido de
aeruginosa caseína y soya o caseína y soya y caseína y
por ejemplo: caldo digerido de caldo digerido de soya/MPN caldo
ATCC 9027 caseína y soya caseína y soya digerido de
- -
NCIMB 8626 30-35ºC ≤ 100 UFC caseína y soya
CIP 82.118 18-24 h 30-35ºC ≤ 100 UFC
NBRC 13275 ≤ 3 días 30-35ºC
≤ 3 días
Bacillus subtilis Agar digerido de Agar digerido de Agar digerido de
por ejemplo: caseína y soya o caseína y soya y caseína y
ATCC 6633 caldo digerido de caldo digerido de soya/MPN caldo
NCIMB 8054 caseína y soya caseína y soya digerido de
- -
CIP 52.62 30-35ºC ≤ 100 UFC caseína y soya
NBRC 3134 18-24 h 30-35ºC ≤ 100 UFC
≤ 3 días 30-35ºC
≤ 3 días
Candida albicans Agar Sabouraud- Agar digerido de Agar Sabouraud- Agar digerido de Agar Sabouraud-
por ejemplo: dextrosa o caldo caseína y soya dextrosa caseína y soya dextrosa
ATCC 10231 Sabouraud- ≤ 100 UFC ≤ 100 UFC ≤ 100 UFC ≤ 100 UFC
NCPF 3179 dextrosa 30-35ºC 20 - 25ºC 30-35ºC 20 - 25ºC
IP 48.72 20 - 25ºC ≤ 5 días ≤ 5 días ≤ 5 días ≤ 5 días
NBRC 1594 2 - 3 días MPN: no aplica
Aspergillus Agar Sabouraud- Agar digerido de Agar Sabouraud- Agar digerido de Agar Sabouraud-
brasiliensis dextrosa o agar caseína y soya dextrosa caseína y soya dextrosa
por ejemplo: papa-dextrosa ≤ 100 UFC ≤ 100 UFC ≤ 100 UFC ≤ 100 UFC
ATCC 16404 20 - 25ºC 30-35ºC 20 - 25ºC 30-35ºC 20 - 25ºC
IMI 149007 5 - 7 días, o hasta ≤ 5 días ≤ 5 días ≤ 5 días ≤ 5 días
IP 1431.83 alcanzar una MPN: no aplica
NBRC 9455 buena
esporulación

4-5. IDONEIDAD DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PRESENCIA DEL PRODUCTO

4-5-1. Preparación de la muestra. El método para preparar la mezcla depende de las

características físicas del producto a examinar. Si ninguno de los procedimientos que se describen a
continuación resultara satisfactorio, se debe desarrollar un procedimiento alternativo.

Productos solubles en agua. Disolver o diluir (usualmente se prepara una dilución 1 en 10) el
producto por examinar en solución amortiguada de cloruro de sodio–peptona pH 7.0, en solución
amortiguadora de fosfato pH 7.2 o en caldo digerido de caseína y soya. Si fuera necesario, ajustar a
un pH de 6 a 8. Si fuera necesario, preparar diluciones adicionales con el mismo diluyente.

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Productos no grasos insolubles en agua. Suspender el producto por analizar (usualmente se

prepara una dilución 1 en 10) en solución amortiguada de cloruro de sodio–peptona pH 7.0, en
solución amortiguadora de fosfato pH 7.2 o en caldo digerido de caseína y soya. Se puede agregar
un agente tensoactivo, tal como 1 g por L de polisorbato 80, para favorecer la suspensión de
sustancias poco humectables. De ser necesario, ajustar a un pH de 6 a 8. Si fuera necesario,
preparar diluciones adicionales con el mismo diluyente.

Productos grasos. Disolver en miristato de isopropilo esterilizado por filtración o mezclar el

producto por examinar con la cantidad mínima necesaria de polisorbato 80 estéril u otro reactivo
tensoactivo estéril no inhibidor, calentado si fuera necesario, a no más de 40°C o, en casos
excepcionales a no más de 45°C. Mezclar cuidadosamente y, si fuera necesario, mantener la
temperatura en un baño de agua. Agregar una cantidad suficiente del diluyente seleccionado
precalentado para obtener una dilución 1 en 10 del producto original. Mezclar cuidadosamente
mientras la temperatura se mantiene durante el menor tiempo necesario para la formación de una
emulsión. Se puede preparar una serie de diluciones decimales empleando el diluyente
seleccionado que contenga una concentración adecuada de polisorbato 80 estéril u otro agente
tensoactivo estéril no inhibidor.

Fluidos o sólidos en forma de aerosol. Transferir el producto asépticamente a un aparato con filtro
de membrana o a un contenedor estéril para muestreo posterior. Usar el contenido completo o un
número definido de dosis fijas de cada envase analizado.

Parches transdérmicos. Retirar las láminas protectoras (“cubiertas de protección”) de los parches
transdérmicos y colocarlas, con el lado adhesivo hacia arriba, en placas de vidrio o plástico
estériles. Cubrir la superficie adhesiva con un material poroso estéril (por ej., gasa estéril) para
prevenir que los parches se peguen unos a otros y transferir los parches a un volumen adecuado del
diluyente seleccionado que contenga inactivadores tales como polisorbato 80 y/o lecitina. Agitar la
preparación vigorosamente durante por lo menos 30 minutos.

4-5-2. Inoculación y dilución. Agregar a la muestra preparada como se describió anteriormente

(4-5-1) y a un control (sin incluir material de prueba) un volumen suficiente de suspensión
microbiana para obtener un inóculo de no más de 100 UFC. El volumen de la suspensión del
inóculo no debe exceder del 1% del volumen del producto diluido.

Para demostrar un recobro microbiano aceptable del producto, se debe usar el factor de dilución
más bajo posible de la muestra preparada para la prueba. Si esto no fuera posible debido a la
actividad antimicrobiana o la baja solubilidad, deben desarrollarse otros protocolos adecuados. Si
la inhibición del crecimiento por la muestra no puede evitarse de cualquier otra manera, la alícuota
de suspensión microbiana puede agregarse después de la neutralización, la dilución o la filtración.

4-5-3. Neutralización/eliminación de la actividad antimicrobiana. Comparar el número de

microorganismos recuperados a partir de la muestra preparada, diluida según se indica en 4-5-2 e
incubada siguiendo el procedimiento descrito en 4-5-4, con el número de microorganismos
recuperados a partir de la preparación de control.

Si se inhibe el crecimiento (reducción en un factor mayor de 2), modificar el procedimiento para la

prueba de recuento particular con el objeto de asegurar la validez de los resultados. La modificación
del procedimiento puede incluir, por ejemplo, (1) un aumento en el volumen del diluyente o medio
de cultivo, (2) incorporación de agentes neutralizantes generales o específicos en el diluyente, (3)
filtración por membrana, o (4) una combinación de todas las medidas anteriores.

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Agentes neutralizantes. Los agentes neutralizantes pueden usarse para neutralizar la actividad de
los agentes antimicrobianos (Tabla 2.6.12.-2). Pueden agregarse al diluyente seleccionado o al
medio, preferentemente antes de la esterilización. Si se usan, se debe demostrar su eficacia y la
ausencia de toxicidad para microorganismos mediante un blanco con neutralizador y sin el
producto.

Tabla 2.6.12.-2. – Agentes neutralizantes comunes para las sustancias que interfieren

Sustancia de interferencia Posible método neutralizante

Glutaraldehído, mercuriales Sulfito ácido de sodio (bisulfito de sodio)
Fenólicos, alcohol, aldehídos, sorbato Dilución
Aldehídos Glicina
Compuestos de amonio cuaternario (CAC), Lecitina
parahidroxibenzoatos (parabenos), bis-biguanidas
CAC, yodo, parabenos Polisorbato
Mercuriales Tioglicolato
Mercuriales, halógenos, aldehídos Tiosulfato
EDTA (edetato) Iones Mg2+ o Ca2+

Si no se encuentra un método de neutralización adecuado, puede suponerse que la imposibilidad de

aislar el microorganismo inoculado es atribuible a la actividad microbicida del producto. Esta
información sirve para indicar que no es probable que el producto se contamine con esa especie
determinada de microorganismo. No obstante, es posible que el producto inhiba solamente algunos
microorganismos aquí especificados pero que no inhiba otros microorganismos no incluidos entre
las cepas de prueba o aquellos para los cuáles éstas no son representativas. Por consiguiente,
realizar la prueba con el factor de dilución más alto compatible con el crecimiento microbiano y
con el criterio de aceptación específico.

4-5-4. Recobro de microorganismos en presencia del producto. Para cada uno de los
microorganismos en la lista, realizar pruebas individuales. Contar sólo los microorganismos de la
cepa de prueba agregada.

4-5-4-1. Filtración por membrana. Usar filtros de membrana con un tamaño nominal de poro no
mayor de 0,45 µm. Escoger el tipo de material del filtro de forma tal que la eficiencia en la
retención de bacterias no se vea afectada por los componentes de la muestra a investigar. Usar un
filtro de membrana para cada uno de los microorganismos mencionados.

Transferir una cantidad adecuada de la muestra preparada como se indica en 4-5-1 a 4-5-3 (que
preferiblemente represente 1 g del producto, o menos si se espera un gran número de UFC) al filtro
de membrana, filtrar inmediatamente y enjuagar el filtro de membrana con un volumen adecuado
de diluyente.

Para determinar el recuento total de microorganismos aerobios (TAMC), transferir el filtro de

membrana a la superficie de agar digerido de caseína y soya. Para determinar el recuento total
combinado de hongos y levaduras (TYMC), transferir la membrana a la superficie de agar
Sabouraud dextrosa. Incubar las placas como se indica en la Tabla 2.6.12.-1. Realizar el recuento.

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4-5-4-2. Métodos de recuento en placa. Realizar los métodos de recuento en placa al menos por
duplicado para cada medio y usar el recuento promedio del resultado.

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4-5-4-2-1. Método de vertido en placa

Para placas de Petri de 9 cm de diámetro, agregar a la placa 1 mL de la muestra preparada como se
indica en 4-5-1 a 4-5-3, y 15-20 mL de agar digerido de caseína y soya o agar Sabouraud dextrosa,
manteniendo la temperatura de ambos medios a no más de 45°C. Si se emplean placas de Petri más
grandes, aumentar la cantidad del medio de agar según corresponda. Emplear al menos dos placas
de Petri para cada microorganismo mencionado en la Tabla 2.6.12.-1. Incubar las placas como se
indica en la Tabla 2.6.12.-1. Calcular la media aritmética de los recuentos por cada medio y
calcular el número de UFC en el inóculo original.

4-5-4-2-2. Método de dispersión en la superficie

Para placas de Petri de 9 cm de diámetro, agregar en cada placa de Petri 15 a 20 mL de agar
digerido de caseína y soya o agar Sabouraud dextrosa aproximadamente a 45°C y dejar solidificar.
Si se emplean placas de Petri más grandes, aumentar el volumen del agar según corresponda. Secar
las placas, por ejemplo, en una campana de flujo de aire laminar o en una incubadora. Emplear al
menos dos placas de Petri para cada microorganismo mencionado en la Tabla 2.6.12.-1. Esparcir
un volumen medido de no menos de 0.1 mL de la muestra, preparada como se indica en 4-5-1 a 4-
5-3 sobre la superficie del medio. Incubar y realizar el recuento como se indica en 4-5-4-2-1.

4-5-4-3. Método del número más probable (NMP). La precisión y exactitud del Método del NMP
son menores que las del método de Filtración por Membrana o el Método de Recuento en Placa. Se
obtienen resultados no confiables, particularmente para el recuento de hongos. Por estas razones, el
Método del NMP se reserva para el TAMC en situaciones en las que no haya otro método
disponible. Si se justifica el empleo del método, proceder de la siguiente manera.

Preparar una serie de al menos tres diluciones decimales en serie del producto, como se indica en
4-5-1 a 4-5-3. A partir de cada nivel de dilución, usar tres alícuotas de 1 g o 1 mL para inocular tres
tubos con 9 a 10 mL de caldo digerido de caseína y soya. Si fuera necesario, se puede agregar al
medio un agente tensoactivo, tal como polisorbato 80, o un inactivador de agentes antimicrobianos.
Por lo tanto, si se preparan tres niveles de dilución, inocular nueve tubos.

Incubar todos los tubos a una temperatura de 30-35°C durante no más de 3 días. Si la lectura de los
resultados resulta difícil o dudosa, debido a la naturaleza del producto por examinar, subcultivar en
el mismo caldo o en agar digerido de caseína y soya durante un período de 1 a 2 días a la misma
temperatura, y usar estos resultados. A partir de la Tabla 2.6.12.-3, determinar el número más
probable de microorganismos por gramo o por mililitro del producto por examinar.

4-6. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN

Cuando se verifica la idoneidad del método de Filtración por Membrana o del Método de Recuento
en Placa, se debe obtener un recuento promedio de cualquiera de los microorganismos de prueba
que no difiera en un factor mayor de 2 del valor del control definido en 4-5-2 Cuando se verifica la
idoneidad del Método del NMP, el valor calculado a partir del inóculo debe estar entre los límites
de confianza de 95% de los resultados obtenidos con el control.

Si los criterios mencionados anteriormente no pueden cumplirse para uno o más de los organismos
analizados con cualquiera de los métodos descritos, usar el método y las condiciones de prueba que
más se aproximen a los criterios para examinar el producto.

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5. PRUEBA DE PRODUCTOS
5-1. CANTIDAD USADA PARA LA PRUEBA
A menos que se indique algo diferente, usar 10 g o 10 mL del producto por examinar, tomados con
las precauciones mencionadas anteriormente. Para líquidos o sólidos en forma de aerosol,
muestrear 10 envases. Para los parches transdérmicos, muestrear 10 parches.

Tabla 2.6.12.-3. – Valores del número más probable de microorganismos

Combinaciones observadas de números de tubos que NMP por gramo o Límites de
muestran crecimiento en cada conjunto por mililitro de confianza al 95 por
Número de gramos o mililitros de producto por tubo producto ciento
0.1 0.01 0.001
0 0 0 <3 0 - 9.4
0 0 1 3 0.1 - 9.5
0 1 0 3 0.1 - 10
0 1 1 6.1 1.2 - 17
0 2 0 6.2 1.2 - 17
0 3 0 9.4 3.5 - 35
1 0 0 3.6 0.2 - 17
1 0 1 7.2 1.2 - 17
1 0 2 11 4 - 35
1 1 0 7.4 1.3 - 20
1 1 1 11 4 - 35
1 2 0 11 4 - 35
1 2 1 15 5 - 38
1 3 0 16 5 - 38
2 0 0 9.2 1.5 - 35
2 0 1 14 4 - 35
2 0 2 20 5 - 38
2 1 0 15 4 - 38
2 1 1 20 5 - 38
2 1 2 27 9 - 94
2 2 0 21 5 - 40
2 2 1 28 9 - 94
2 2 2 35 9 - 94
2 3 0 29 9 - 94
2 3 1 36 9 - 94
3 0 0 23 5 - 94
3 0 1 38 9 - 104
3 0 2 64 16 - 181
3 1 0 43 9 - 181
3 1 1 75 17 - 199
3 1 2 120 30 - 360
3 1 3 160 30 - 380
3 2 0 93 18 - 360
3 2 1 150 30 - 380
3 2 2 210 30 - 400
3 2 3 290 90 - 990
3 3 0 240 40 - 990
3 3 1 460 90 - 1980
3 3 2 1100 200 - 4000
3 3 3 > 1100

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Se puede reducir la cantidad a analizar de las sustancias activas que se formulan en las siguientes
condiciones: la cantidad por unidad de dosificación (por ej., tableta, cápsula, inyección) es menor o
igual a 1 mg o la cantidad por gramo o mililitro (para preparaciones que no se presentan en
unidades de dosificación) es menor a 1 mg. En estos casos, la cantidad de la muestra por analizar
no es menor que la cantidad presente en 10 unidades de dosificación o en 10 g o 10 mL del
producto.

Para los materiales que se usan como sustancias activas en los que la cantidad de la muestra es
limitada o el tamaño del lote es extremadamente pequeño (es decir, menos de 1000 mL o 1000 g),
la cantidad analizada debe ser 1% del lote, a menos que se indique, justifique y autorice una
cantidad menor.

Para productos cuyo número total de entidades en un lote es menor de 200 (por ej. muestras que se
usan en ensayos clínicos), el tamaño de la muestra puede reducirse a dos unidades o a una unidad si
el tamaño es menor de 100. Escoger la(s) muestra(s) aleatoriamente a partir del material a granel o
de los envases disponibles de la preparación. Para obtener la cantidad requerida, mezclar los
contenidos de un número suficiente de envases para proporcionar la muestra.

5-2. EXAMEN DEL PRODUCTO

5-2-1. Filtración por membrana

Usar un aparato de filtración diseñado de forma tal que permita la transferencia del filtro al medio.
Preparar la muestra empleando un método cuya idoneidad se haya demostrado como se indica en la
sección 4, transferir la cantidad adecuada a cada uno de 2 filtros de membrana y filtrar
inmediatamente. Lavar cada filtro siguiendo el procedimiento que haya demostrado ser adecuado.

Para determinar el TAMC, transferir uno de los dos filtros de membrana a la superficie del agar
digerido de caseína y soya. Para determinar el TYMC, transferir la otra membrana a la superficie del
agar Sabouraud dextrosa. Incubar la placa de agar digerido de caseína y soya a una temperatura entre
30-35ºC durante un período de 3 a 5 días, y la placa de agar Sabouraud dextrosa a una temperatura
entre 20-25ºC durante un período de 5 a 7 días. Calcular el número de UFC por g o por mL del
producto.

Al examinar los parches transdérmicos, filtrar por separado 10% del volumen de la preparación
descrita en 4-5-1 a través de cada una de las 2 membranas de filtración estériles. Transferir una
membrana al agar digerido de caseína y soya para el TAMC y la otra membrana al agar Sabouraud
dextrosa para el TYMC.

5-2-2. Métodos de recuento en placa

5-2-2-1. Método de vertido en placa

Preparar la muestra empleando un método que haya demostrado ser adecuado, como se describe en
la sección 4. Para cada medio, preparar al menos 2 placas Petri para cada nivel de dilución. Incubar
las placas en agar digerido de caseína y soya a 30-35ºC durante 3 a 5 días, y las placas de agar
Sabouraud dextrosa a 20 - 25ºC durante 5 a 7 días. Seleccionar las placas que correspondan a una
dilución dada y que muestren el mayor número de colonias menor que 250 para TAMC y menor
que 50 para TYMC. Calcular la media aritmética de los recuentos por medio de cultivo y calcular
el número de UFC por gramo o por mililitro de producto.

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5-2-2-2. Método de dispersión en la superficie

Preparar la muestra empleando un método que haya demostrado ser adecuado como se describe en la
sección 4. Preparar al menos dos placas de Petri para cada medio y nivel de dilución. Para la
incubación y cálculo del número de UFC, proceder como se indica en el Método de vertido en placa.

5-2-3. Método del número más probable

Preparar y diluir la muestra empleando un método cuya idoneidad se haya demostrado como se
describe en la sección 4. Incubar todos los tubos durante un período de 3 a 5 días a una temperatura
de 30ºC a 35ºC. Subcultivar, si fuera necesario, empleando el procedimiento cuya idoneidad
se haya demostrado. Para cada nivel de dilución registrar el número de tubos que muestran
crecimiento microbiano. A partir de la Tabla 2.6.12.-3, determinar el número más probable de
microorganismos por g o por mL del producto por examinar.

5-3. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

El recuento total de microorganismos aerobios (TAMC) se considera igual al número de UFC

encontrado usando agar digerido de caseína y soya; si en este medio se detectan colonias de hongos,
contarlas como parte del TAMC. El recuento total combinado de levaduras y hongos (TYMC) se
considera equivalente al número de UFC encontradas empleando agar Sabouraud dextrosa; si en este
medio se detectan colonias de bacterias, contarlas como parte del TYMC.

Cuando se espera que el TYMC exceda el criterio de aceptación debido al crecimiento bacteriano, se
puede usar agar Sabouraud dextrosa que contenga antibióticos. Si el recuento se realiza mediante el
Método NMP, el valor calculado es el TAMC.
Cuando se indica un criterio de aceptación para la calidad microbiológica, éste se interpreta de la
siguiente manera:

– 101 UFC: recuento máximo aceptable = 20;

– 102 UFC: recuento máximo aceptable = 200;
– 103 UFC: recuento máximo aceptable = 2000; etc.

Las soluciones y los medios recomendados están descritos en el capítulo general 2.6.13.

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