ANDREA SERRANO ALEGRE

Protocolo de extracción de ARN

El procedimiento de extracción de ARN comprende el lisado de las células sanguíneas y

la homogenización de la muestra para liberar el ARN, recuperación del ARN por
separación de fases utilizando Trizol y cloroformo, precipitación con isopropanol,
lavados en alcohol, y re suspensión en agua libre de nucleasas.

Los equipos biomédicos que se deben utilizar son: cabina de bioseguridad,

microcentrífuga refrigerada, centrifuga de tubos de 15ml, vórtex, refrigeradora,
congeladora a -20 grados.

Los materiales médicos no fungibles son: micro pipetas de 20-200 y 100-1000

microlitros, y el rack para tubos de 2 y 15ml.

Los materiales fungibles son los guantes de nitrilo, el mandil de laboratorio, mascarillas,
tubos de 1,5 y 15ml, puntas con filtro para micro pipetas de 200 y 1000 microlitros,
pipeta Pasteur, tubo con EDTA de 3ml y envases de descarte de material bio-
contaminado.

Los reactivos que se pueden observar en este tipo de extracción son: el buffer de lisis de
glóbulos rojos, trizol, cloroformo, alcohol absoluto, isopropanol y agua de PCR.

En cuanto al procedimiento;

Una vez recibimos la muestra de la cual necesitamos al menos 3ml de la misma que se
colecta en un tubo con anticoagulante EDTA, verificamos la información y la evaluamos.
Colocamos el código del laboratorio que le corresponde al tubo de muestra y a la orden
médica y por últimos conservamos la muestra a unos 4 grados centígrados un máximo
de 48 horas.

Una vez tenemos la muestra, procedemos a la extracción del ARN; para ello,
necesitamos limpiar la cabina de bioseguridad con alcohol al 96% y prender la luz UV de
la cabina durante 15 minutos. Después, rotulamos el tubo de 15ml con el código de la
muestra con la que vamos a trabajar y en un tubo de 15ml agregamos 9 de buffer de
lisis de glóbulos rojos y 3 de la muestra. Luego homogenizamos la mezcla con ayuda del
vórtex y la incubamos durante 15 minutos a 4 grados centígrados. Mas tarde,
centrifugamos a 2,200 rpm por 12 minutos a temperatura ambiente y removemos el
sobrenadante. A continuación, añadimos 3ml de buffer al precipitado, lo
homogenizamos y lo incubamos durante 5 minutos a 4 grados de nuevo pero esta vez lo
centrifugamos a 2,200 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente y de nuevo
removemos el sobrenadante. Por último, adicionamos 1ml de Trizol y transferimos con
una pipeta Pasteur la homogenización de la mezcla a un tubo de 1,5ml ya rotulado y lo
incubamos a -20 grados centígrados hasta el siguiente día.

Al día siguiente, colocamos la muestra a temperatura ambiente hasta su

descongelamiento y adicionamos 0,4ml de cloroformo y lo homogenizamos en el vórtex
por 15 segundos y lo incubamos 10 minutos a temperatura ambiente. Para finalizar,
centrifugamos a 12,000 rom por 15 minutos a 4 grados. Podremos observar 3 fases, de
ellas debemos transferir la fase acuosa, es decir, la superior a un nuevo tubo de 1,5 ml
rotulado. En ese tubo, adicionamos 0,65 ml de isopropanol e incubamos por 2 horas a -
20 grados. Luego, centrifugamos a 12,000 rpm por 15 minutos a 4 grados y removemos
el sobrenadante. Añadimos 1ml de etanol al 70% y homogenizamos en el vórtex algunos
segundos, centrifugamos a 10,000 rpm por 8 minutos a 4 grados, pero esta vez
descartamos el sobrante. Finalmente, homogenizamos mediante el pipeteo y
almacenamos a -20 grados centígrados hasta su posterior uso para la cuantificación. 1.
¿Cuál es la razón por la que durante el proceso de extracción de ARN se deben tomar
precauciones adicionales, como el uso de una cabina de flujo laminar y el tratamiento
de materiales para eliminar RNasas, comparado con la extracción de ADN?

-La razón principal por la que se deben tomar precauciones adicionales durante el
proceso de extracción de ARN en comparación con la extracción de ADN se debe a la
susceptibilidad del ARN a la degradación por ribonucleasas (RNasas). Las RNasas son
enzimas que degradan el ARN, y están presentes en el entorno, incluidas las células y los
tejidos. El ARN es generalmente más susceptible a la degradación que el ADN debido a
su estructura de cadena sencilla y al hecho de que las RNasas pueden actuar más
fácilmente sobre esta estructura.

2. Describe brevemente cómo podría afectar la calidad de la muestra de ARN extraída

el omitir el paso de lavado con alcohol etílico al 70% durante el protocolo de extracción
y cómo podría identificar si este paso se omitió basándose en los resultados de la
espectrofotometría.

El paso de lavado con alcohol etílico al 70% durante el protocolo de extracción de ARN
es crucial para eliminar residuos de sales y contaminantes que podrían afectar la calidad
de la muestra. Si este paso se omite, puede haber consecuencias negativas para la
pureza y la calidad del ARN extraído.

Cómo podría afectar la calidad de la muestra de ARN:

• Contaminantes residuales: El alcohol etílico al 70% se utiliza para eliminar

contaminantes y sales que pueden co-precipitar con el ARN. La omisión de este
paso podría resultar en la presencia de impurezas que afecten la pureza del ARN.
• Interferencia con la espectrofotometría: Los contaminantes residuales pueden
afectar las lecturas espectrofotométricas. La espectrofotometría se utiliza para
medir la concentración de ácidos nucleicos, y la presencia de contaminantes
puede generar lecturas inexactas, dando la impresión de que hay más ARN del
que realmente está presente.