Universidad Nacional del Santa

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA EN ACUICULTURA

FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO: BIOLOGÍA, MICROBIOLOGÍA Y

BIOTECNOLOGÍA

Bioquímica grupo A

TEMA PRÁCTICO SEMANA 05

Dosaje de hemoglobina y parámetros hematológicos en organismos acuáticos
RESPONSABLES:

• Mendoza Jiménez Geraldine Jimena

• Miranda Tapayuri Robert Rodrigo

• Hidalgo Valle Julián Mauricio

• García Córdoba Leydi Fiorella

DOCENTE:

MS.c Sorayda Mendoza Espinoza

CICLO IV

Nuevo Chimbote, enero 2024

I. INTRODUCCIÓN

La hemoglobina es una proteína conjugada de peso molecular 68000, consta de cuatro unidades,
dos cadenas alfa y dos cadenas beta, cada una de las cuales contiene un complejo de Fe2+ -
porfirina o complejo hemo. A diferencia de la mioglobina que consta de una sola cadena
polipeptídica y es el almacén de O2 de los músculos rojos, la hemoglobina transporta el oxígeno
desde los pulmones hasta los tejidos; además transporta el CO2 desde los tejidos hasta los
pulmones para su eliminación y actúa como un sistema buffer importante en el mantenimiento del
equilibrio ácido básico del organismo.

Los valores normales oscilan entre 11 a 16 mg% correspondiendo los valores más bajos a las
mujeres. Las variaciones patológicas pueden ser en el sentido de la disminución, constituyendo los
diversos tipos de anemia y en el sentido del aumento lo cual constituye las denominadas
policitemias de diferentes orígenes.

Existen diferentes métodos para cuantificar hemoglobina, en la práctica emplearemos el método

modificado de Sherd Sanford y Szizeli, que se basa en la transformación de la hemoglobina en
oxihemoglobina por acción de una solución de hidróxido de amonio al 4%.

II. OBJETIVOS
1. Determinar la concentración de hemoglobina en sangre.
III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS
1. Centrífuga
2. Espectofotómetro

MATERIALES Y REACTIVO

PROPORCIONADO POR EL ALMUNO

1. 01 frasco de alcohol medicinal
2. 01 bolsa de algodón
3. 01 aguja descartable N° 21

PROPORCIONADO POR EL LABORATORIO

1. Solución de hidróxido de amonio 4%

2. Tubos de ensayo 3.2.6 embudos
3. Pipetas de 1 y 10 ml
4. Micropipeta de Sali
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

MANEJO DE ORGANISMOS

El manejo de los animales antes de la toma de muestras de sangre es un aspecto crucial en este tipo
de análisis. Esto se debe a que la manipulación en sí misma puede alterar de manera significativa los
componentes sanguíneos. Por esta razón, previo a la extracción de la sangre (hemolinfa), los
camarones se deben introducir en un baño frío (5 °C por debajo de la temperatura inicial) con el fin
de disminuir el metabolismo. Esta medida previene el que algunos de los metabolitos plasmáticos,
como la glucosa y el lactato, sean alterados rápidamente por la manipulación.

OBTENCIÓN DE HEMOLINFA

FIG. 01, Obtención de hemolinfa

MATERIALES

• Jeringa hipodérmica desechable de 1 ml con aproximadamente 100 µL de SIC-EDTA (2-8 °C)

• Un pedazo de tela aproximadamente 30 cm x 30 cm (franela de algodón)

Pasados los cinco minutos, es decir, una vez que los animales han sido acondicionados al ambiente
de baja temperatura y de luz ambiental, es posible tomar las muestras de sangre. Al momento de
extraer al animal, debe cuidarse el alterar lo menos posible a los que quedan en la tara/hielera.
Como primer paso, es necesario secar perfectamente al organismo para evitar un posible contacto
entre la hemolinfa y el agua. Si durante la manipulación el animal cae, debe sustituirse porque
algunos metabolitos, como la glucosa y el lactato, se alteran rápidamente.

Para extraer la sangre deberá utilizar una jeringa desechable hipodérmica (de 1 ml con aguja
ultrafina de 29G x 13 mm para juveniles menores de 4g, y con aguja 25G x 16 mm para mayores de
4 g; 3 ml para reproductores). La jeringa deberá contener aproximadamente 100 µL de 6 solución
anticoagulante fría (2-8 °C) (solución isotónica para camarón, SIC-EDTA)(Anexo 1) (Vargas-Albores et
al., 1993).
Justo antes de la extracción de sangre, la solución anticoagulante debe descartarse completamente.
La hemolinfa se extrae del seno ventrolateral del abdomen con ayuda de la jeringa. La aguja se
inserta suavemente a través de la membrana artrodial de la quinta pata, para tener acceso al seno.
Lentamente se desliza la aguja y, al mismo tiempo, se retira suavemente el émbolo de la jeringa, de
tal forma que al momento en que la aguja entre en contacto con la sangre ésta pueda fluir hacia la
jeringa. Esta acción permitirá que no se formen burbujas en la hemolinfa, evitando así que se
acelere el proceso de coagulación, y con ello, la alteración de los componentes sanguíneos.

V. RESULTADOS

EVALUACIÓN DE LOS INDICADORES SANGUÍNEOS

Es necesario considerar que el volumen total de hemolinfa que debe ser obtenido es de 65 µL. Este
volumen se separará de la siguiente manera:

1. Para el análisis de la hemocianina se requieren 10 µL.

2. Para el análisis de los cinco metabolitos sanguíneos se requieren 55 µL (glucosa, lactato,
colesterol, acilglicéridos y proteínas). Así, se deberá procurar obtener como mínimo ese
volumen, aunque se recomienda obtener un mayor volumen.

HEMOCIANINA

MATERIALES

• Micropipeta de 2 - 20µL2
• Micropipeta de 100 - 1000µL2
• Puntas para micropipeta
• Vaso de precipitado de 50 ml con Agua destilada
• Cubetas Ultravioleta (UV) para espectrofotómetro

EQUIPO

• Espectofotómetro con lámpara de luz Ultra Violeta (absorbancia 540 nm)

Se coloca una cubeta de 1 ml en el espectro la cual deberá contener 990 µL de agua destilada. El
espectro deberá estar encendido y colocado en una longitud de onda de 540 nm. Debe asegurarse
el que la lámpara de UV se encuentre activada por lo menos 30 minutos antes de su uso.

Se calibra el espectro a 0 de absorbancia con la cubeta conteniendo 990 µL de agua destilada. Se

debe tener cuidado de no tocar con los dedos los lados de la cubeta UV por donde el
espectrofotómetro lee la absorbancia, y de limpiarla con un papel suave (que no deje pelusa) antes
de meterla al espectrofotómetro.

Se toman 10 µL de hemolinfa con una micropipeta adecuada y se mezclan con los 990 µL de agua
destilada. La mezcla se logra al succionar y pulsar varias veces el contenido de la punta de la
micropipeta. Una vez hecho esto, se revisa que la cubeta no contenga burbujas, ni marcas de dedos,
y se coloca en el espectro. Se lee la absorbancia tal y como lo hizo cuando calibró a cero con el agua
destilada. Anote el valor obtenido. Este análisis debe hacerse por duplicado. En cada análisis se
cambia el agua de la cubeta, se enjuaga dos veces con agua destilada, se seca con papel suave y se
repite la operación.

FIG. 02, resultados obtenidos en el espectofotómetro

METABOLITOS

OBTENCIÓN DE PLASMA

MATERIAL

• Tubos Eppendorf (1.5 ml) conteniendo 110 µL de SIC-EDTA (2-8 °C)

• Tubos Eppendorf (1.5 ml) nuevos
• Recipiente frío (0°C)
• Micropipeta 20 - 200 µL
• Puntas para micropipeta Equipo
• Centrífuga refrigerada
Los metabolitos plasmáticos no se evalúan directamente en la hemolinfa, sino que es necesario
diluirla en solución anticoagulante (SIC-EDTA): por cada volumen de hemolinfa se requieren dos de
SIC-EDTA. Por ejemplo, si se desean cuantificar los cinco metabolitos, se deben diluir 55 µL de
hemolinfa en 110 µL de SIC-EDTA (Anexo 2). En el caso de que se quieran analizar los cinco
metabolitos, se requerirán tubos Eppendorf (1.5 ml) previamente llenados con 110 µL del SIC-EDTA
(2-8 °C) y marcados de forma numérica progresiva con plumón indeleble (uno por cada muestra de
camarón). Se toman 55 µL de la muestra de hemolinfa y se mezclan con el anticoagulante en el tubo
Eppendorf. Ya con la hemolinfa diluida, los tubos Eppendorf se centrifugan a 800 g por 3 min a 4 °C.
Las muestras con hemolinfa + SIC-EDTA pueden refrigerarse hasta una hora, antes de ser
centrifugadas.

Después de centrifugar, a los tubos se les retira el sobrenadante (plasma + SIC-EDTA), introduciendo
lentamente la punta de la micropipeta sin tocar el fondo, donde es posible observar el paquete
celular, el cual para este tipo de análisis no interesa. El sobrenadante se deposita en tubos
Eppendorf nuevos y marcados con la misma secuencia de números que se siguió para las muestras
de sangre. En este caso, la cantidad de plasma + SIC-EDTA recuperado debe ser de
aproximadamente 165 µL. Una observación importante es que los tubos con el plasma siempre
deben mantenerse en una temperatura de 2-8 °C. Aunque se aconseja realizar las evaluaciones
plasmáticas en fresco, se ha observado que el plasma puede mantenerse hasta por 36 horas en 2-8
°C sin alteraciones importantes de la concentración de los componentes sanguíneos. En el anexo 3
se proporcionan los valores obtenidos para cada uno de los metabolitos, a diferentes tiempos de
preservación de muestras refrigeradas (2-8 °C) y congeladas (-40 °C), los cuales puede ser usados
como referencia en caso de que se requiera analizar muestras almacenadas.

VI. DISCUSIÓN
- Observando la figura número 1, donde se muestran todos los resultados obtenidos
desde el espectofotómetro a 540 nm, se entiende claramente que las 6 muestras
analizadas cuentan con absorbancias muy diferentes.
VII. CUESTIONARIO
1. Indique 5 organismos acuáticos que tiene hemoglobina

La hemoglobina es una proteína que se encuentra comúnmente en los glóbulos rojos de los
vertebrados y que desempeña un papel crucial en el transporte de oxígeno. Aunque los organismos
acuáticos suelen tener otras adaptaciones para obtener oxígeno disuelto en el agua, algunos han
desarrollado hemoglobina. Aquí te presento cinco organismos acuáticos que tienen hemoglobina:
 1. Peces: Muchas especies de peces poseen hemoglobina en sus glóbulos rojos para
transportar oxígeno a través de sus sistemas circulatorios.
2. Anfípodos: Algunos crustáceos, como los anfípodos, también tienen hemoglobina
para ayudar en el transporte de oxígeno.
3. Equinodermos: Algunos equinodermos, como las estrellas de mar y los erizos de
mar, tienen hemoglobina en sus fluidos corporales para facilitar el transporte de
oxígeno.
4. Moluscos: Algunos moluscos, como los calamares y los pulpos, pueden tener
hemoglobina en su sangre para ayudar en el transporte de oxígeno.
5. Anélidos: Algunos gusanos, como los anélidos marinos, también han desarrollado
hemoglobina para adaptarse a la vida acuática.

Es importante destacar que, aunque estos organismos tienen hemoglobina, su función y estructura
pueden variar en comparación con la hemoglobina presente en mamíferos, como los humanos.

2. Indique 3 diferencias entre hemoglobina y mioglobina

La hemoglobina y la mioglobina son dos proteínas relacionadas que se encuentran en los

organismos vertebrados y desempeñan funciones cruciales en el transporte y almacenamiento de
oxígeno. Aquí hay tres diferencias clave entre la hemoglobina y la mioglobina:

Función principal:

Hemoglobina: Su función principal es el transporte de oxígeno desde los pulmones hacia los tejidos
y la recogida de dióxido de carbono producido en los tejidos para llevarlo de vuelta a los pulmones.

Mioglobina: Se encuentra principalmente en los músculos y tiene como función principal almacenar
oxígeno en las células musculares, proporcionando una reserva local para su uso durante la
contracción muscular.

Tejidos en los que se encuentran:

Hemoglobina: Se encuentra principalmente en los glóbulos rojos de la sangre circulante.

Mioglobina: Se encuentra principalmente en las células musculares, específicamente en las células

musculares esqueléticas y cardíacas.

Estructura y afinidad por el oxígeno:

Hemoglobina: Tiene una estructura cuaternaria, con cuatro subunidades (dos cadenas de globina
alfa y dos cadenas de globina beta en humanos). La hemoglobina muestra una curva de saturación
de oxígeno sigmoidal, lo que significa que su afinidad por el oxígeno aumenta a medida que se ligan
más moléculas de oxígeno.

Mioglobina: Tiene una estructura más simple en comparación con la hemoglobina, siendo una
proteína con una sola subunidad. La mioglobina muestra una curva de saturación de oxígeno
hiperbólica, lo que indica una mayor afinidad por el oxígeno en condiciones de baja presión de
oxígeno, lo que facilita la liberación de oxígeno en los tejidos cuando es necesario.

Estas diferencias reflejan las funciones especializadas de la hemoglobina y la mioglobina en el

transporte y almacenamiento de oxígeno en los tejidos cuando es necesario.

Estas diferencias reflejan las funciones especializadas de la hemoglobina y la mioglobina en el

transporte y almacenamiento de oxígeno en el cuerpo.

3. Investigue que otros métodos se podrían usar para el dosaje de hemoglobina

Para la medición de los niveles de hemoglobina en un contexto médico o clínico, se utilizan

métodos estándar y éticos. Algunos de los métodos comunes para medir la hemoglobina incluyen:

Análisis de Sangre Completa (CBC): Este análisis de sangre evalúa varios componentes sanguíneos,
incluida la hemoglobina. Proporciona información detallada sobre los glóbulos rojos y otros
parámetros sanguíneos.

Hematómetro: Es un dispositivo utilizado en laboratorios clínicos para contar y medir las

características de los glóbulos rojos, incluyendo la concentración de hemoglobina.

Pruebas de Hemoglobina Glicosilada (HbA1c): Estas pruebas miden el nivel de hemoglobina que se
ha unido a la glucosa en la sangre durante un período de tiempo más prolongado y se utiliza para
evaluar el control a largo plazo del azúcar en la sangre en personas con diabetes.

Espectrofotometría: Un método que utiliza la absorción de luz para medir la concentración de

hemoglobina en una muestra de sangre.

Cromatografía de HPLC (High-Performance Liquid Chromatography): Esta técnica se utiliza para

separar y cuantificar diferentes componentes de la sangre, incluida la hemoglobina.

Es importante enfatizar que cualquier manipulación de los niveles de hemoglobina con el objetivo
de mejorar el rendimiento deportivo y que viole las reglas antidopaje es ilegal y puede tener
consecuencias graves tanto para la salud como para la integridad en el ámbito deportivo. Si tienes
preguntas específicas sobre la medición de la hemoglobina en un contexto médico, te recomendaría
consultar con un profesional de la salud.
 4. Que aplicación tendrá la práctica realizada en el campo de su especialidad

La práctica de manipular o ajustar los niveles de hemoglobina en el campo de la biología,

específicamente en la acuicultura, puede tener varias aplicaciones importantes y beneficiosas. Aquí
se presentan algunas de las posibles aplicaciones:

Mejora de la oxigenación en sistemas acuícolas:

Ajustar o mejorar los niveles de hemoglobina en organismos acuáticos podría ayudar a aumentar la
capacidad de transporte de oxígeno en la sangre. Esto podría ser beneficioso en situaciones donde
se requiere una mejor oxigenación, como en estanques de cultivo, sistemas de recirculación de
agua o condiciones de densidad poblacional elevada.

Adaptación a condiciones ambientales cambiantes:

Algunos estudios podrían explorar la posibilidad de mejorar la capacidad de los organismos

acuáticos para adaptarse a cambios en las condiciones ambientales, como variaciones en la
temperatura, salinidad o niveles de oxígeno disuelto.

Resistencia a enfermedades:

Investigar la influencia de la hemoglobina en la resistencia a enfermedades podría ser otra

aplicación. Una mayor capacidad de transporte de oxígeno podría fortalecer el sistema
inmunológico y mejorar la resistencia a patógenos en ambientes acuáticos.

Optimización de la producción acuícola:

Entender cómo la manipulación de la hemoglobina puede afectar el crecimiento y la salud de los

organismos acuáticos podría llevar a prácticas más eficientes y sostenibles en la acuicultura.

Investigación sobre especies acuáticas específicas:

La aplicación de técnicas relacionadas con la hemoglobina puede ser valiosa en la investigación de

especies específicas utilizadas en la acuicultura. Comprender mejor la fisiología y los mecanismos de
transporte de oxígeno en estas especies puede contribuir al desarrollo de prácticas de cultivo más
efectivas.

Es importante destacar que cualquier aplicación en este sentido debería llevarse a cabo de manera
ética y respetando los estándares de bienestar animal. Además, estas investigaciones deben ser
realizadas por profesionales en el campo de la biología acuática y la acuicultura para garantizar la
validez científica y la seguridad de las prácticas implementadas.
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- Barnabé, G. Bases Biológicas y ecológicas de la acuicultura. Edit. Acribia. 1ª. Edic., 1996.
Zaragoza, España. 519 pp.
- Boone W.R. y Schoffeniels E. 1979. Hemocyanin synthesis during hypo-osmotic stress in
the shore crab Carcinus maenas (L.). Comp. Biochem. Physiol. 63B: 207-214.
- Chen, J-Chu, Sha.-Y, Cheng. 1993. Hemolymph PCO2, Hemocyanin, protein levels and
urea excretion of Penaeus monodon exposed to ambient ammonia. Aquatic Toxicology
27: 281-292.
- Chen, J-Chu, Sha.-Y, Cheng, y Chung-T, Chen 1994. Changes of haemocyanin, protein
and free amino acid levels in the haemolymph of Penaeus japonicus exposed to
ambient ammonia. Comp. Biochem. Physiol. 109A (2): 339-347.
- Cheng, Sha-Y y J-Chu, Chen. 1999. Hemocyanin oxygen affinity, and the fractionation of
oxyhemocyanin and deoxyhemocyanin for Penaeus monodon exposed to elevated
nitrite. Aquatic Toxicology 45: 35-46.
- Djangmah, J.S. 1970. The effects of feeding and starvation on copper in the blood and
hepatopancreas, and on blood proteins of Crangon vulgaris (Fabricius). Comp.
Biochem. Physiol. 32: 709-731.
- Gilles, R. 1977. Effects of osmotic stress on the protein concetration and pattern of
Eriocheir sinensis blood. Comp. Biochem. Physiol. 56A:109-114.
- Hagerman, L. 1986. Haemocyanin concentration on Crangon crangon (L.) after
exposure to hypoxia. Comp. Biochem. Physiol. 85A:721-724.