Extracción DNA hongos (con micelio compacto)

Materiales

Mortero

Pistilo

Nitrógeno liquido

Hielo frapeado

Guantes y gafas de seguridad

Baño metabólico (baño maría)

Vortex

Reactivos

Solución de lisis CTAB (CTAB 2%, TRIS 100 Mm, EDTA 20 Mm, NaCl 10 Mm, PVP 1%)

Fenol:Cloroformo:Alcohol-isoamilico (25:24:1)

RNasa.

Obtención de biomasa.

La muestra puede ser obtenida a partir de cultivos líquidos o medios semisólido, en el primer caso
generalmente se forman “pelets” de micelio, por lo cual se tienen que recuperar con un asa
micológica, en el segundo caso, con ayuda de un bisturí estéril retirar solo el micelio evitando la
mayor cantidad de medio.

Adicionalmente se pueden realizar lavados de agua destilada para retirar el exceso de medio de las
muestras a trabajar.

Lisis celular.

Se colocan las muestras en un mortero y se agrega un volumen de nitrógeno líquido suficiente

para cubrir la muestra, posteriormente se macera utilizando un pistilo, este paso se repite por lo
menos 3 veces o hasta notar que la muestra está completamente pulverizada y uniforme para
después ser transferida a tubos eppendorf de 2 ml (se pueden utilizar de 1.5) y ser colocados en
un recipiente con hielo.

Nota: Si se cuenta con más de 1 muestra se recomienda lavar el mortero con agua estéril y una
solución de SDS.

Extracción de ácidos nucleicos.

Las muestras se resuspender en 800 µl (500 µl si se trabaja con tubos de 1.5) de solución de lisis y
se incuban a 60 °C por 20 min.
Transcurrido el tiempo se homogeniza en un vortex a máxima velocidad por unos segundos y se
adiciona un volumen de Fenol:Cloroformo:Alcohol-isoamilico para después volver a homogenizar
con vortex.

Posteriormente los tubos se centrifugan a 14000 rpm por 15 min y a una temperatura de 4°C para
poder recuperar un sobrenadante claro y sin presencia de fase orgánica.

Al sobrenadante obtenido agregar 4 µl de RNasa e incubar a 37°C por 40 min. Trascurrido este
tiempo realizar una extracción con Fenol:Cloroformo:Alcohol-isoamilico y centrifugar nuevamente
para obtener un sobrenadante con las características antes mencionadas.

Precipitación del DNA.

Adicionar al sobrenadante 500 µl de etanol absoluto. Se nota a simple vista la precipitación del
DNA en forma en un precipitado blanquecino, es recomendable incubar 8 hrs a -20°C para
aumentar la cantidad de DNA precipitado.

Pasado el tiempo de incubación es necesario centrifugar a 14000 rpm por 15 min a 4°C para
obtener “la pastilla” y desechar el sobrenadante.

Se tienen que realizar 2 lavados agregando 400 µl de etanol frio al 70% para retirar trazas de sales
en la muestra.

Obtención de DNA

Finalmente se centrifugan las muestras y con ayuda de una micropipeta se retira el exceso de
etanol utilizado para los lavados y se dejan secar a temperatura ambiente por 15 min o hasta notar
la ausencia completa de etanol para posteriormente resuspender con 100 µl de agua libre de
nucleasas.

Las muestras se almacenan a -20°C

Cuantificación de DNA

Para la cuantificación es recomendable utilizar un nanodrop, el cual se ajusta para cuantificación

de ácidos nucleicos y se calibra utilizando agua libre de nucleasas.

Los valores esperados son los siguientes:

Concentración: 150- 300 ng/µl

260/280 1.8-2
230/260 >1.5