Guión Tema 11

ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR: UV-VIS E INFRARROJO

11.1. Espectrometría de absorción molecular (EAM) ultravioleta-visible.

11.1.1. Aspectos analíticos de la EAM UV-VIS. Ley general de absorción (Lambert-Beer)
11.1.2. Mecanismos de absorción en EAM UV-VIS: Sensibilidad en Métodos directos
11.1.3. Mecanismos de absorción en EAM UV-VIS: Sensibilidad en Métodos indirectos
11.1.4. El instrumento de medida: influencia en la calidad de los métodos
11.1.5. Aplicaciones cuantitativas: elección de método
11.1.6. Interferencias aditivas y su eliminación
11.1.7. Otras aplicaciones. Valoraciones fotométricas
11.2. Espectrometría de absorción molecular (EAM) infrarrojo
11.2.4. Aspectos analíticos generales de EAM-IR
11.2.5. Sensibilidad en EAM-IR
11.2.6. Aplicaciones en fase gas. Instrumentación
11.2.7. Aplicaciones en fase líquida y sólida. Instrumentación

11.1. EAM UV-VIS

11.1.1. Aspectos analíticos de la EAM UV-VIS. Ley general de absorción

(Lambert-Beer)
(P 11.2-11.10) La EAM es una técnica que se basa en la capacidad de absorción de
radiación de la zona UV-visible (190-800 nm, aunque se puede llegar a extender hasta los
1100 nm o 2500nm) por parte de los compuestos de la muestra. Los aspectos analíticos más
destacables se pueden resumir de la siguiente forma:

1.- Se suele aplicar en disolución acuosa y a temperatura ambiente. Pueden

emplearse otros disolventes (aunque hay que elegirlos con cuidado) y temperaturas
distintas a la ambiental. También es posible su aplicación en fase gas o en fase
sólida; en este último caso se suelen emplear dispositivos de reflectancia.

2.- Es una técnica esencialmente cuantitativa, utilizándose la técnica como tal,

como sistema de detección en cromatografía líquida (HPLC) o como forma de
seguir un proceso volumétrico. Tiene otras aplicaciones analíticas como la
determinación del color de los materiales y sustancias.

3.- Es una técnica de sensibilidad media. Usando las propiedades intrínsecas de

las sustancias sólo se pueden determinar con suficiente sensibilidad sustancias
orgánicas que presenten un cierto número de dobles enlaces conjugados (límites
de cuantificación en torno a 10-6M). Usando métodos indirectos se puede bajar este
límite 1 o en ocasiones más ordenes de magnitud. Las aplicaciones a compuestos
inorgánicos también son abundantes, pero se basan en someterlos a reacciones
químicas previas.

5.- La selectividad para la determinación de compuestos orgánicos es

intrínsecamente baja, siendo habitual que la técnica se emplee en combinación con
HPLC. Al emplear métodos indirectos la selectividad mejora.

1
 6.- Es una técnica con buena precisión (DSR en muchas ocasiones en torno al 2-
3%), rangos de linealidad cortos (1 orden de magnitud) y selectividad media.

7.- La medida es rápida, de costo instrumental medio-bajo (amplio rango de

instrumentos), bajo costo de mantenimiento, la calibración es bastante estable,
muy adecuada en análisis de rutina, fácil de utilizar (no requiere una alta
capacitación) y de una gran implantación.

La EAM UV-visible es una de las técnicas instrumentales que mayor implantación tiene
en el mercado de la instrumentación ya que, entre otras muchas razones, es una de uso común
en muchas disciplinas científicas y especialmente en las químicas. En química teórica se
utiliza para obtener información sobre constantes termodinámicas de algunas especies como
constantes de formación de complejos, constantes de disociación ácido-base o incluso pesos
moleculares. En síntesis química se puede utilizar para confirmar estructuras ya elucidadas
por otras técnicas instrumentales. A este respecto indicar que, a pesar de que existen tablas
que relacionan bandas con grupos funcionales (de forma similar a lo que ocurre en IR), las
bandas en EAM UV-visible son bastante anchas (entre 50 y 100 nm), lo que unido a las
grandes diferencias entre los valores de , hace que muchas de las bandas más características
queden solapadas por las más grandes, limitando así las posibilidades de identificación a unos
pocos compuestos de espectros muy característicos (aromáticos polinucleares).

Ley general de Absorción

Ver transparencias y repasar tema 5

Consideraciones analíticas de la ley de LB

- La Absorbancia es adimensional (cociente de dos intensidades) y depende de l
(como )
- La  (absortividad molar) se da en unidades de M-1cm-1, c en M y l en cm.
- Alternativamente: Abs=alc; a=absortividad especifíca (sus unidades dependen
de c y l)
- Si hay varias sustancias absorbentes: Abs=Sabsi=e1lc1+e2lc2+
- Deben cumplirse las consideraciones hechas anteriormente.
La absortividad molar es un parámetro característico de cada sustancia, pero cambia
con la LO de la radiación, por lo tanto, una sustancia no tiene un solo valor de absortividad
molar sino muchos. En general esa variación responde a una forma gaussiana sencilla o
múltiple más o menos distorsionada. La absortividad es la capacidad de una especie para
absorber luz de una λ (valor máximo en torno a 100.000)

Un espectro de absorción no es más que la representación de cómo varia el  con la

LO. Al sustituir el  por absorbancia el espectro tiene igual forma pero cambia en tamaño
según la concentración y el paso óptico.

Este parámetro es fundamental desde el punto de vista analítico, ya que (junto con el
paso óptico) nos informa de la pendiente de la recta de calibrado de un método de absorción,
es decir, de la sensibilidad de dicho método. Como se ve en EAM podemos modificar la
sensibilidad de un método cambiando la LO de medida.

Aunque la técnica de UV-visible es muy utilizada en diferentes campos de la ciencia y

de la química, el estudio que vamos a hacer aquí está dedicado básicamente a su aplicación
cuantitativa y esto es lo que justifica la estructura del tema.

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 Supongamos que queremos determinar una sustancia por EAM UV-visible en una
muestra. ¿Por donde empezamos? ´

1.- Lo primero que tenemos que plantearnos es cual es el rango de concentración del
analito en la muestra y que otras sustancias (y su rango de concentración) puede haber.
Supongamos, por ejemplo, que queremos llevar a cabo la determinación de Tirosina (un
aminoácido) en una muestra (líquida) que se encuentra en una concentración de 10-5M que
contiene también otros aminoácidos (cisteina, prolina y glicina) en concentraciones
similares, y contiene también monosacaridos (glucosa y ribosa) y lipidos (colesterol y
ceramida) en concentraciones del orden de 10-3M. Para completar el asunto supongamos que
contiene también algo inorgánico como Na(I), K(I), Cu(II), CO32-, NO3- y Cl-.

2A.- Una vez que sabemos esto lo siguiente es saber si podemos determinar el analito
de forma directa. Hay que tener en cuenta que la EAM UV-visible se rige por la ley de L-B y
que por tanto Abs=lc. Para saber si el analito lo podemos medir debemos saber el  (¿a que
LO?) o mejor conocer el espectro. Igualmente es importante conocer el espectro de absorción
de las especies que acompañan al analito en la muestra (incluido el disolvente). Esto es lo
primero que veremos, como saber esas propiedades.

2B.- En el caso de que no se pueda aplicar un método directo, entonces habrá buscar
otra solución. La solución depende del tipo de problema que tengamos, es decir, de si lo que
falla es la sensibilidad o la selectividad. En ambos casos se pueden aplicar métodos indirectos
(alternativamente se puede aplicar cromatografía)

3.- Sin embargo todo lo que veamos aquí va a estar a expensas de la instrumentación
utilizada. Cada instrumento tendrá un rango de longitudes de onda de trabajo y un rango de
valores de absorbancia en el que se pueden hacer las determinaciones con fiabilidad.

La forma más sencilla de determinar los valores de  y las  de absorción de una

sustancia es disponiendo de su espectro UV-Vis, acudiendo a bases de datos específicas1.
Una de ellas pertenece a la NIST (National Institute of Standards and Technology) y es
accesible a través de la web en http://webbook.nist.gov/chemistry/. En esta base de datos los
espectros suelen estar representados como log  en función de , por lo tanto directamente del
eje y del espectro se puede obtener la absortividad molar.

1 Otras bases de datos que se pueden consultar son:

* http://chrom.tutms.tut.ac.jp/JINNO/DRUGDATA/00alphabet.html  Se trata de una base de datos de espectros de
drogas para ser usados en cromatografía (Comprobada Oct. 2012).

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 11.1.2. Mecanismos de absorción en EAM UV-VIS: Sensibilidad en Métodos
directos
(P 11.11-11.21)
Transiciones entre niveles electrónicos I: Grupos biatómicos

Independientemente de que se disponga o no del espectro (pero especialmente cuando

no se dispone de él) resulta fundamental tener una idea aproximada de cómo deducir las
propiedades de absorción de un compuesto; esto requiere revisar algunos conceptos teóricos.

Las moléculas absorben, por sí mismas, radiación de esta zona del espectro, para sufrir
transiciones entre niveles electrónicos pero cuando las moléculas están en disolución
también puede absorber mediante la participación del disolvente en el que se encuentran
(absorción asistida por el disolvente), bien porque los niveles energéticos del disolvente
participen en el proceso (absorción por transferencia de carga) o bien porque el disolvente
facilita la aparición de nuevos niveles energéticos (absorción por transiciones de campo
ligando).

Para simplificar algo esta presentación vamos a considerar, en primer lugar, que la
molécula está formada por dos átomos. Esta situación no es muy frecuente pero ayuda
bastante a situar el problema ya que posteriormente se considerará a una molécula como una
agrupación de “entidades” biatómicas.

Como sabes cuando dos átomos cualesquiera (A y B) se unen para dar una especie
molecular AB lo que hacen es combinar sus orbitales atómicos para formar orbitales
moleculares, que pueden ser enlazantes () o antienlazantes (), aunque también, y,
dependiendo de la naturaleza de ambos, pueden aparecer orbitales no enlazantes (n). Para
cada par biatómico la aparición de uno u otro tipo va ligado al tipo de enlace que une los
átomos:

a) Si el enlace es sencillo solo hay orbitales * y n. Las transiciones posibles son:

* y n  

ésta última si existen orbitales n, situación que ocurre en enlaces entre heteroátomos, como
los que forman el C ó el H con elementos de carácter no-metálico (O, N, S, halógenos,..) o
estos entre sí, es decir, básicamente en cualquier tipo de enlace simple que no sea C-H ó C-C.

b) Si el enlace es múltiple, aparecen también orbitales  y por lo tanto se podrían

observar también transiciones:

* y n  

dado que, en general, las transiciones y no están permitidas.

Para entender un poco mejor como serían los espectros de EAM en las moléculas y las
posibilidades analíticas de las bandas de absorción es necesario tener en cuenta dos cosas: los
valores de absortividad molar que presentan los diferentes tipos de transiciones y las
longitudes de onda a las que aparecen.

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 Los valores de  van asociados a la probabilidad del proceso (constante de velocidad)
y dependerán del carácter de las transiciones. Se pueden hacer las siguientes
generalizaciones:

* Las transiciones desde niveles no enlazantes, sobre todo las n  , tienen una baja
probabilidad lo que se traduce en valores de  bajos (< de 1000 M-1cm-1 para n  * y (< de
100 M-1cm-1 para n   ).

* Las transiciones y suelen ser transiciones permitidas y se producen

con valores de  altos (> 1000 M-1cm-1).

Si se tiene en cuenta que los instrumentos de EAM tienen un rango de utilización que
suele empezar en 190 nm, es claro que las transiciones del tipo * quedarán fuera del
rango de utilización de los equipos y por lo tanto no tendrán aplicación analítica. También las
quedarán mayoritariamente fuera del rango del uso, pero en algunos casos se puede
ver el final de la banda en forma de cola espectral.

Descartadas las transiciones más energéticas, los enlaces sencillos entre átomos sólo
dan lugar a bandas n  observables. Como las diferencias de energías entre el orbital n y
el * de cada pareja biatómica es diferente, cada grupo biatómico presenta su banda de
absorción a una longitud de onda diferente; sin embargo, hay una relación entre la diferencia
de electronegatividades () de los átomos y la longitud de onda de la banda: según disminuye
la diferencia de , la  aumenta. Los valores de  suelen ser bajos al ser transiciones de baja
probabilidad. En la tabla de la transparencia 11.13 se indican las longitudes de onda de
absorción de algunos grupos moleculares.

Los enlaces múltiples (dobles o triples) entre átomos darán lugar también a bandas
*; si uno de los átomos presenta orbitales n, también a bandas n  . En algunos
casos no sólo la transición * sino también la * pueden ser lo suficientemente
energéticas como para no ser observables. En la Tabla de la transparencia 11.13 se indican los
enlaces múltiples más representativos, sus longitudes de onda de absorción y los valores de 
promedio. Es importante indicar que estos valores no son universales; las variaciones en  en
función de la fuente de información pueden oscilar en torno a 10 nm. Las diferencias de 
son del 100% e incluso mayores.

Transiciones entre niveles electrónicos II: Moléculas poliatómicas

En una molécula orgánica hay más de un enlace y por lo tanto hay más de un grupo con
posibilidad de presentar una banda observable. Los resultados experimentales y teóricos
obtenidos hasta la fecha permiten concluir que se pueden producir interacciones entre grupos
absorbentes próximos, dando lugar a bandas distintas de las esperadas. En términos globales
se puede establecer que:

1) Cuando los grupos absorbentes (grupos cromóforos) están separados entre sí por
más de un enlace sencillo C-C, cada uno se comporta manteniendo sus propias
características de absorción. Sin embargo dado que las bandas de los distintos grupos son
muy próximas entre sí, es frecuente que se solapen (por ejemplo, la presencia de hombros en
los espectros indica esto) o que unas oculten a otras.

2) Si los grupos están consecutivos, ambos se comportan como un único grupo, con
sus propias características.

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 Un caso interesante se presenta cuando un grupo con un enlace múltiple se encuentra
directamente unido por un enlace sencillo a un átomo que presenta orbitales n, por ejemplo:

-C=N-O- -C=O-O- -C=O-(halógeno)

En teoría esta situación sería similar a la anterior, sin embargo, se puede explicar de una
forma más sistemática si se considera que el átomo del enlace sencillo pierde sus propiedades
de absorción pero altera las del cromóforo; tal tipo de grupo se denomina auxocromo. En
general las modificaciones espectrales afectan a la longitud de onda y poco a la . Los
desplazamientos espectrales dependen de dos cosas, de la naturaleza de la transición del
cromóforo y de la electronegatividad del auxocromo.

* Si la transición del cromóforo es n  * el auxocromo desplaza el espectro

hacia menores (desplazamiento hipsocrómico)

* Si la transición es del tipo * el auxocromo desplaza el espectro hacia

mayores (desplazamiento batocrómico).

* El desplazamiento es tanto mayor cuanto mayor es la electronegatividad del

auxocromo, aunque esto no siempre se cumple y en general las diferencias son
mínimas.

También se puede incluir dentro de este apartado la absorción por compuestos

inorgánicos. Tal como cabría esperar, los iones inorgánicos monoatómicos no absorben
radiación por transiciones entre orbitales moleculares, sin embargo las especies oxoaniónicas
si que presentan, en ocasiones bandas de absorción observables en el espectro. Este es el caso
de especies como nitrato, nitrito, carbonato, arseniato, cromato o permanganato, entre otras.
Los primeros presentan bandas en la zona UV relativamente sensibles, los dos últimos
presentan bandas en la zona UV de alto valor de  y bandas en la zona visible de valor bajo.
Por ejemplo, la banda del cromato (amarillo) aparece en torno a 350 nm (= 750); en medio
ácido el compuesto dimeriza a dicromato (naranja) observándose el desplazamiento de la
banda hacia 370 nm (= 1500 y una segunda, en torno a 450 nm (= 100). El permanganato
presenta también una banda en la zona UV, junto con la banda en la zona visible (violeta) en
torno a 528 nm (=2400).

Cuando en la molécula hay alternados dos o más dobles enlaces múltiples separados
entre sí por enlaces sencillos, todo el conjunto se comporta como un único grupo cuyo
espectro de absorción esta desplazado a longitudes de onda mayores, convirtiéndose en
muchos casos en un grupo cromóforo. La teoría de orbitales moleculares explica que la
combinación de estos cromóforos hace disminuir la diferencia de energía entre el enlazante
ocupado de mayor energía (HOMO) y el anti-enlazante libre de menor energía (LUMO) (ver
diapositiva 11.15).

En el caso de conjugaciones por dobles enlaces, se puede considerar que a efectos

prácticos el incremento en la  es de unos 30-40 nm por cada doble enlace que se
incorpore a la conjugación, si bien este incremento no es generalizable para cualquier número
de dobles enlaces ni para cualquier sistema conjugado. El cambio en  depende del tipo de
enlaces múltiples que se conjuguen; en general el  del cromóforo se incrementa en un
factor igual al número de enlaces conjugados.

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 No cabe duda de que el caso más corriente de dienos conjugados es el de los
aromáticos. La teoría de orbitales moleculares establece que la conjugación de los tres
dobles enlaces de un anillo aromático, genera nuevos orbitales moleculares, complicando los
espectros de absorción. En general los aromáticos presentan tres bandas de absorción p
aunque a veces se habla también de una cuarta banda ) que no siempre son observables en
todos; además algunas de estas cuatro bandas se pueden subdividir e incluso presentar una
cierta estructuración.

El benceno presenta tres bandas observables situadas a 180(), 210 (p) y 270 () nm
con valores de  de 50000, 7000 y 200 respectivamente. De esas tres bandas, la primera no es
útil analíticamente, y de las otras dos, la de 210 nm es la que presenta mayor  y, por lo tanto,
la que tiene mayor interés. La posición e intensidad de estas bandas se ve afectada por la
naturaleza (dador o aceptor de electrones), número (mono o bi sustituidos) y posición (orto,
meta y para en los bisustituidos) de los sustituyentes. Aunque el efecto es complejo, se
pueden hacer las siguientes consideraciones generales:

La presencia de sustituciones modifica los espectros. El efecto es muy similar a lo que

ocurre con otros cromóforos. Así los dadores de electrones, como -Cl, -Br, -OH, -NH2, OR,
provocan desplazamientos espectrales, proporcionales a su electronegatividad, mientras que
los sustituyentes aceptores de electrones, como –COO-, -CN, -COR, -NO2, incrementan por
término medio unos 30-40 nm la longitud de onda. En ambos casos los incrementos son
menores sobre la banda de 265 nm. Los valores de absortividad molar siguen una tendencia
más o menos generalizable: los auxocromos prácticamente no la alteran y los aceptores
duplican aproximadamente el valor de absortividad.

La condensación de anillos aromáticos da lugar a una familia muy interesante de

compuestos que son los Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (HAP). Estos compuestos
se producen como consecuencia de la combustión incompleta de combustibles fósiles
(gasolinas, gasóleos, carbón) siendo fuertes contaminantes y, algunos de los de la serie fénica
son poderosos carcinógenos, por lo que su análisis en muestras medioambientales o de
alimentos es esencial. La condensación puede producirse en línea (serie arénica) o sin seguir
ejes bien definidos (serie fénica). Los espectros de estos compuestos son más complejos,
dado que la banda de 180 nm del benceno aparece desplazada hacia una zona donde es
observable, además la banda  se divide en un multiplete y se producen solapamientos entre
otras.

En general, los desplazamientos de las bandas son prácticamente lineales con el número
de anillos aromáticos que conforman el compuesto. En la serie fénica, los desplazamientos de
las tres bandas de absorción son de unos 20-30 nm por cada anillo, con incrementos de la
absortividad molar del orden del 30% por anillo, mientras que en la serie arénica, las bandas
 y  se desplazan unos 20-30 nm por anillo, mientras que la p lo hace entre 90-100 por
anillo; los valores de absortividad molar cambian poco, especialmente los de las bandas  y
.

7
 Bandas asistidas por el disolvente

A) Campo Ligando

Este fenómeno aparece por transiciones entre niveles d o f de los iones de elementos de
transición y es el responsable de la absorción (e incluso del color) que presentan muchos
iones de transición de la primera y segunda serie en disolución.

El mecanismo que mejor se comprende hasta la fecha es el que da lugar a este tipo de
transiciones en iones con orbitales d semi-ocupados. Como es sabido, en ausencia de
cualquier perturbación externa (en el vacío), los 5 tipos de orbitales d de un ion están
degenerados, es decir, presentan la misma energía. Cuando el ión esta en disolución acuosa, y
por lo tanto solvatado con el disolvente, los orbitales d del ión sufren la repulsión de los
orbitales del disolvente. Sin embargo, en función de la orientación que adquieren las
moléculas del disolvente, los distintos orbitales d sufren la repulsión de forma distinta,
adquiriendo distinta energía en función de dicha orientación.

Este fenómeno no solamente ocurre por efecto del agua, sino por cualquier otro ligando
monodentado e incluso polidentado que pueda formar complejos con el catión central, dado
que la interacción entre los orbitales d y las moléculas de ligando se seguirá produciendo. La
magnitud del ΔE, y por lo tanto la longitud de onda del máximo de absorción, depende del
ión central, su estado de oxidación y el ligando; respecto a este último la magnitud del
desplazamiento aumenta con la siguiente secuencia: CN- >NO2- >NH3 >SCN- > H2O > C2O42-
> OH- > F- > Cl- > Br- > I-

Desde el punto de vista cuantitativo la aplicación de estas bandas es bastante limitada

ya que al tratarse de transiciones prohibidas los valores de ε son bajos (en torno a 50 o
menos). Estas bandas de absorción se sumarían a otras bandas posibles del sistema, como por
ejemplo, bandas de transferencia de carga, que se diferenciarían de las primeras en que daría
lugar a valores de ε muy superiores.

En los elementos lantánidos y actínidos se observan también múltiples bandas de

absorción, estrechas, y que en principio pueden asignarse a transiciones entre orbitales f.
Estas bandas (en realidad, picos), pueden interpretarse sólo parcialmente por la teoría del
campo ligando dado que no cumplen algunas de sus propiedades (la longitud de onda
prácticamente no cambia al cambiar el sustituyente). Los valores de ε son pequeños y su
aplicación es limitada.

B) Transferencia de carga

Una transición por transferencia de carga es la combinación de un proceso de absorción

y un proceso de oxidación-reducción. Para ello es necesario la existencia de dos
componentes: un dador (reductor) que absorba la radiación electromagnética, pasando el
electrón a un estado excitado del otro componente (aceptor; oxidante). Las bandas de
transferencia de carga se suman a las ya existentes en el sistema.

La teoría actual de los procesos de transferencia de carga permite explicar estas bandas
en términos energéticos. Para que el proceso se produzca el dador debe perder el electrón, por
lo que es necesario aportar una energía equivalente a su potencial de ionización (ID), y que el
aceptor lo capte, liberando una energía equivalente a su afinidad electrónica (EA); además, si
ambos quedan ionizados, habrá una cierta disminución de la energía por la interacción
electrostatica entre ellos (), por lo tanto:

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 E = h = ID - EA - 

De esta expresión se puede predecir el valor de la longitud de onda del máximo de

absorción. Estas bandas de transferencia presentan, en ocasiones, valores de absortividad
molar elevados (del orden de 10000 o superiores) y muchas de ellas suelen aparecer en la
zona visible del espectro, por lo que son bandas muy interesantes desde el punto de vista
analítico.

Hay diferentes posibilidades de procesos de transferencia de carga en función de la

naturaleza del dador y aceptor, pero desde el punto de vista que ocupa aquí, son interesantes
las que se producen entre algunos halogenuros y seudo-halogenuros con el agua. Otros
ejemplos interesantes son las bandas de transferencia de carga que aparecen en: A) I2 con un
gran número de disolventes o compuestos orgánicos (por ejemplo el almidón); B) complejo
Fe(III)/SCN- y otros análogos en los que el catión pueda actuar como aceptor de electrones;

11.1.2. Mecanismos de absorción en EAM UV-VIS: Sensibilidad en Métodos

indirectos

(P 11.22-11.36) En muchas ocasiones el analito a determinar no tiene propiedades de

absorción UV-visible o son inadecuadas para basarse en ellas. En estos casos se pueden
aplicar métodos indirectos que consisten en relacionar el analito a determinar con otra especie
que tenga mejores posibilidades de absorción (teniendo en cuenta las necesidades del
análisis) y cuya concentración esté relacionada inequívocamente con la del analito; por
simplicidad a esta sustancia se le denominará Sustancia Cromogénica (SC). Desde el punto
de vista del tipo de señal obtenido, hay dos formas de llevar a cabo los métodos indirectos:

* En el equilibrio  Se involucra al analito en una reacción (también puede ser una

secuencia de reacciones), en las que uno de los reactantes o productos (generalmente el
producto final) es el SC. Las reacciones se llevan a cabo hasta el equilibrio. Si el SC es un
reactante, la pérdida de absorbancia es proporcional a la concentración del reactante
consumido, que a su vez lo es a la concentración del analito; si el SC es un producto, la
aparición de absorbancia es proporcional a la concentración del analito.

* Cinética  Cuando la reacción anterior es lenta, el valor de absorbancia cambiará

con el tiempo hasta llegar al equilibrio. En muchos casos la velocidad a la cual la absorbancia
cambia (dAbs/dt en la figura), es proporcional a la concentración de reactivo consumido o de
producto formado, que a su vez se relacionan con la de analito.

En ambos tipos de métodos es habitual que la señal medida (variación de absorbancia)

se relacione directamente con la concentración del analito a través de un constante de
proporcionalidad (K ó K´ en la figura). Es claro que esta constante, que es la que da la
sensibilidad de la determinación, dependerá de una serie de parámetros que tienen que ver
con SC y con la reacción. Para ver que parámetros son vamos a considerar una reacción
sencilla:

k1
A+R <====>P K´AR = k1/k-1 (1)
k-1
En la que el SC es el producto y por lo tanto la absorbancia medida dependerá de la
concentración que exista de P en cada momento, esta será la situación que se considerará
aquí:

9
 Abst = P[P]t= SC[SC]t

A) En Equilibrio
El método está basado en que la reacción llegue al equilibrio y entonces medir la absorbancia.
Consideremos [R]0 la concentración de R añadida y [A]0 la concentración de analito en la muestra.
Cuando se llegue al equilibrio se cumplirá que (por simplicidad l=1 cm):
Abs = P[P]eq (2)
Considerando la K´AR y que el reactivo está en exceso
K´AR [R]0
[P]eq  [A]0
1  K´AR [R]0
sustituyendo en la ecuación (2) queda:
K´ [R]
Abseq = P [A]0 AR´ 0
1  K AR [R]0
que admite dos simplificaciones, en función de cuál de los dos sumandos del denominador
sea mayor:
Si 1  K´AR [R]0 Abseq = P [A]0 (3)
Si 1  K´AR [R]0 Abseq = PK´AR [R]0 [A]0 ( 4)
En el primer caso (ecuación 3), la sensibilidad con la que se determina el analito solo
depende de la absortividad molar del producto de la reacción ( P). En el segundo caso
depende también de la constante de formación y de la concentración de reactivo.

B) Método cinético
En este caso lo que se mide es la velocidad a la cual cambia la absorbancia con el
tiempo o, lo que es lo mismo, el cambio de absorbancia en un tiempo dado. Supongamos que
se mide de nuevo la aparición de producto P:
Abst = P [P]t (5)
De acuerdo con la cinética (1):
d[P]
= k1[A][R]0  k-1[P]
dt
Si se trabaja a tiempos cortos se puede despreciar el proceso inverso, por tanto:
d[P]
dt

= k1[A][R]0  [P]t =[A]0 1  e k[R ]0 t(6)

y por lo tanto, sustituyendo de (6) en (5):

 
Abst = P [P]t =P 1  e k[R ]0 t [A]0 (7)
En los primeros instantes de la reacción (o mejor, cuando el valor del exponente es bajo):
1  e k[R ]0 t  k[R]0 t
con lo que finalmente la ecuación (7) queda:
Abst = Pk[R]0 t [A]0 (8)
Para hacer que la señal se haga independiente del tiempo se suele medir, o bien la
absorbancia a un tiempo dado, o bien la variación de absorbancia en un intervalo de tiempo
dado.

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 Los métodos cinéticos son, respecto de los métodos en el equilibrio: a) Más rápidos,
dado que si la reacción es lenta no hace falta esperar hasta el final; b) Más selectivos, ya que
se puede utilizar la diferencia de velocidad de reacción para evitar interferencias; c) Más
imprecisos, ya que la señal depende de un mayor número de variables y además la medida en
función del tiempo induce un cierto grado de incertidumbre; y d) Más complejos, por
idénticos motivos.

Métodos indirectos para compuestos inorgánicos

De las dos alternativas citadas de formación de compuestos y métodos cinéticos, no

cabe duda de que la formación de compuestos es el método más aplicado. Para especies
catiónicas, estos métodos se basan en la formación de complejos coloreados entre el analito y
un reactivo monodentado (inorgánico) o polidentado (reactivos metalcrómicos orgánicos); las
determinaciones de aniones sencillos requieren una metodología algo más compleja.

En general las determinaciones indirectas basadas en la formación de complejos

presentan las siguientes características.

1- Los reactivos, en muchos casos, carecen de selectividad, por lo que es necesario

aplicar sobre ellos procedimientos que mejoren la selectividad, siendo los más
habituales:
- Proceso previo de extracción. Para algunos complejos la etapa de extracción es
necesaria, puesto que el complejo solo es estable en medio orgánico.
- modificaciones del pH o procesos de pre-reducción.
- adición de agentes enmascarantes (halogenuros, CN-,EDTA, orgánicos). Mezclas.
2- Los complejos suelen presentar valores de  elevados y suelen absorber en la zona
visible.

3.- Muchos complejos son poco solubles en agua y el método requiere una etapa
adicional de extracción.

4.- En muchos casos el reactivo libre puede absorber y su absorción puede ser molesta.

La lista de reactivos que se han propuesto para la determinación de especies catiónicas es

prácticamente interminable, pero sólo unos cuantos han demostrado ser lo suficientemente
eficaces como para que se sigan utilizando en la actualidad.

Una alternativa interesante dentro de los métodos indirectos está basada en las reacciones
de precipitación.

A) Reactivos inorgánicos

Este tipo de reactivos suele ser más selectivo y además el reactivo libre no suele
absorber, por lo que son bastante útiles. Solo se van a citar un par de ejemplos representativos
de estas determinaciones.

Tiocianato. Se ha comentado que el Fe(III) sufre un proceso de transferencia de carga

con el SCN- que da lugar a la aparición de una banda de absorción de cierta intensidad (480
nm, =8500); el complejo es establece en medio fuertemente ácido. La adición de acetona al
50% mejora la sensibilidad (=16000), pero todavía mejora más si se extrae en un disolvente
como la metilisobutil cetona (MIBK) (495 nm, =24000). Otras especies inorgánicas que

11
también presentan este tipo de complejos con SCN-, pero solamente el de Ti permite su
determinación sensible (430 nm, =78000 en agua acetona y =85000 extraído en MIBK);
por ejemplo el complejo de Co(II) presenta un valor de =1800 (620 nm), y otros cationes
como Ni(II), Cu(II) o Bi(III) dan resultados parecidos.

Heteropoliácidos. Los ácidos de algunos elementos de la tabla periódica (Va y VIa,

como P, As, Si, W, V, Mo) pueden condensar para formar moléculas complejas denominadas
heteropoliácidos. Muchos de estos heteropoliácidos son solubles en medio fuertemente ácido
y presentan color amarillo (absorción en torno a 400 nm), por lo que se pueden determinar
por EAM. Cuando el heteropoliácido contiene Mo(VI) la adición de un reductor débil , como
hidracina, provoca la reducción de este a Mo(V), de color azul, que dota de este color al
heteropoliácido (absorción sobre 700-800 nm). Este método es de enorme utilidad y
aplicación para la determinación de especies tan complejas de analizar cómo:
* Fosfato: mediante el heteropoliácido con molibdato y reducción al azul (780 nm,
=25000) o heteropoliácido con moliddato y vanadato (400 nm, =2500)
* Silicio: mediante el heteropoliácido con molibdato y reducción al azul (600 nm,
=20000) o sólo con molibdato (400 nm, =2500).

B) Reactivos orgánicos

Es donde el abanico de posibilidades es mayor, ya que incluyen un gran número de

familias de reactivos denominados genéricamente metalcrómicos, que ya habrás visto en
complexometría complexometría (ver las tablas de complexometría para obtener información
sobre estructura, valores de pK ácido-base , constantes de formación de complejos, colores
del reactivo libre y color de los complejos), y que como sabrás presentan diferente color
cuando se encuentran libres en disolución o formando complejos quelatos con las especies
catiónicas. En EAM UV-visible se emplean porque la diferencia de color es indicativa de
diferencia en espectro de absorción y absorbancia. Por citar solo las características más
importantes:

* Suelen tener propiedades ácido/base, presentando diferente color en función del pH,
por lo que debe elegirse aquella zona de pH donde el color del reactivo libre y del complejo
sean distintos. En muchas ocasiones los espectros de absorción del reactivo y los complejos
se solapan, obligando a elegir cuidadosamente la longitud de onda de medida.

* Muchos son insolubles en agua, por lo que los métodos suelen requerir la adición de
disolventes orgánicos o su extracción. Sin embargo, la incorporación en su molécula de
grupos sulfónico o arsónico los hace solubles en agua.

* Son en general poco selectivos, requiriéndose la adición de complejantes (CN-

-
,NH3,F o EDTA) y regular el pH para evitar interferencias.

Como se ha dicho, hay muchas familias de reactivos metalcrómicos. Dentro de ellas

tiene especial importancia la de los azo-derivados. Genéricamente los azo-derivados son
reactivos que responden a una estructura del tipo:

R1– N=N–R2

12
 donde R1 y R2 son derivados generalmente aromáticos que provocan una fuerte
conjugación en la estructura.

El 5-Br-PADAP (2-(5-bromo-2-piridilazo)-5-dietilamiofenol). Forma complejos con

cationes divalentes de transición como Cd(II), Co(II), Cu(II), Fe(II), Pb(II), Hg(II) , Ni(II) y
Zn(II). Entre pH=3-11 (rango habitual de utilización), el reactivo absorbe a 445 nm,
mientras que los complejos lo hacen en torno a 570 nm, con valores de  en torno a 100.000,
por lo que dan lugar a determinaciones muy sensibles.

El Arsenazo III, reactivo muy útil por su buena solubilidad en agua. Complementa
bien la acción del anterior, puesto que es la base de métodos muy sensibles para cationes
como Th, U (IV) y Zr (=120.000), dado que forma complejos con ellos en medios muy
ácidos (1-10M en HCl), y menos sensibles pero muy útiles para Ca, Sr y Ba (=40.000)
(pH=1-4). También forma complejos con otros cationes como Fe(III), Pb(II), Bi(III) y
Ce(III) (=30.000, en todos los casos). El reactivo libre absorbe en torno a 515 nm y los
complejos a 650 nm. Otros reactivos de la familia de los azo-derivados usados en EAM UV-
vis son: neT, Negro de Eriocromo A, Calcón, Negro-azul de Eriocromo B, Calmagita o
Violeta de Solocromo R.

Es frecuente encontrar que estos reactivos se inmovilizan sobre soportes sólidos. La

determinación no es por medida de la absorbancia del complejo sino que se suele detectar
visualmente; para la determinación cuantitativa el color observado en la tira se compara con
una escala de color previamente estandarizada. También es frecuente que los reactivos se
ofrezcan comercialmente en pequeños recipientes listos para añadir la muestra, desarrollar el
complejo y comparar el color obtenido con una escala prefijada.

Métodos indirectos para compuestos orgánicos

A) Métodos en el equilibrio

Los métodos en el equilibrio no son más que una consecuencia de la reactividad de los
compuestos orgánicos. La idea es incorporar en la molécula grupos cromóforos que mejoren
la absortividad molar o desplacen la longitud de onda de absorción hacia zonas más libres del
espectro.

Para compuestos de naturaleza orgánica las reacciones a utilizar pueden ser de muy
variada índole y puede ir desde simples procesos de hidrólisis o reacciones de oxidación o
fotoquímicas, hasta síntesis auténticas de compuestos en las que el analito se hace participar
de una estructura aromática o bien de un sistema con alta conjugación. En general la
complejidad de las reacciones de derivatización suele depender de los objetivos buscados. Si
solo se busca un incremento en la sensibilidad la metodología es más sencilla que si se busca
producir cambios importantes en la longitud de onda de absorción. Un ejemplo es la
derivatización del formaldehído.

Las reacciones de Etiquetado, el analito se hace reaccionar con un reactivo cromóforo

que se une a él, sin que el analito pierda del todo su entidad química. Las reacciones de
etiquetado son reacciones de derivatización sencillas, que se producen indiscriminadamente
sobre aquellas moléculas que contengan el grupo funcional sobre la que va dirigida. Las
reacciones de etiquetado dan lugar a productos poco solubles en agua, lo que unido a su
escasa selectividad, los hacen sólo útiles cuando se combinan con métodos cromatográficos.

B) Métodos cinéticos

13
 En el campo de los métodos cinéticos los más importantes para sustancias orgánicas
son los enzimáticos. Como se sabe, una reacción enzimática se puede entender como aquella
en la que el catalizador es una enzima. Normalmente los métodos enzimáticos permiten
determinar de forma muy selectiva la sustancia que interesa y pueden ser aplicables a una
gran cantidad de compuestos de naturaleza biológica. Hay muchos tipos de reacciones
enzimáticas, pero las que presentan un mayor interés son las reacciones redox. En estas
reacciones participa un sustrato que es oxidado o reducido por un co-enzima, reacción
catalizada por la enzima selectiva al sustrato:

Sustrato + Co-enzima enzima Producto + forma conjugada del Co-

enzima

Dentro de estas reacciones hay dos tipos que se deben destacar.

1.- Reacciones en las que interviene el NADH (forma reducida del NAD, Nicotinamida
Adenin Dinucleótido), como co-enzima. El esquema genérico es:

sustrato + NAD sustrato-deshidrogenasa sustrato-oxidado + NADH

El NADH presenta absorción a 340 nm (=8500) mientras que le NAD no absorbe

apenas a esta . La reacción puede ser a la inversa, con lo que la pérdida de absorción de
NADH sería la medida a utilizar. En función de la enzima que se utilice así será el sustrato
que se determine.

2.- Las reacciones de oxidación que utilizan enzimas del tipo oxidasa, requieren como
sustrato el O2. El producto de la reacción es la forma oxidada del sustrato y H2O2 .

sustrato + O2 sustrato-oxidasa sustrato-oxidado + H2O2

En este caso ni el H2O2 ni el O2 presentan propiedades de absorción, sin embargo el

H2O2 se puede someter a una segunda reacción enzimática en la que intervenga una sustancia
con propiedades de absorción. La enzima utilizada suele ser la peroxidasa (enzima que
cataliza las reacciones de oxidación del H2O2) y un sustrato habitual es la o-dianisidina que
absorbe a 450 nm, si bien hay otros esquemas de reacciones de detección:

o-dianisidina + H2O2 peroxidasa producto oxidado

Aunque el proceso pueda parecer complejo, experimentalmente es simple ya que el O2

es aportado por la propia disolución. Por lo tanto, basta con añadir sobre la muestra la mezcla
de enzimas (sustrato-oxidasa y peroxidasa) y la o-dianisidina, y ver como disminuye la
absorbancia a 450 nm.

Cuando el analito de interés no tiene una reacción enzimática en la que intervenga el

NADH o el H2O2, se puede combinar con otras reacciones, enzimáticas o no, hasta que en
una de ellas intervenga alguna de las dos especies.

En la actualidad muchos de estos métodos se están implementando en lo que se ha

venido a llamar “química seca” o “reactivos inmobilizados”. Se trata de unir los reactivos
necesarios para una determinación sobre un soporte sólido (una tira de polímero o de
celulosa);se añade una gota de muestra sobre esa tira, produciéndose la secuencia de
reacciones. La tira se introduce en un instrumento que contiene una esfera integradora como
compartimento de muestras (véase más adelante) y se mide la absorción reflejada por la tira.

14
 También se pueden implementar en dispositivos similares a los comentados en el caso
de compuestos inorgánicos, pero una aplicación muy interesante es cuando quieren emplearse
para la medida de sustancias volátiles o que tienen una presión de vapor suficientemente alta.
En este caso los reactivos se incorporan en tubos, u otros dispositivos, por los que se hace
pasar la muestra bien de forma pasiva o mediante una bomba manual. El analito reacciona
con los reactivos dando lugar a la formación de un compuesto coloreado; la longitud del tubo
ocupada por el producto coloreado permite determinar la concentración del analito.

11.1.4. El instrumento de medida. Influencia en la calidad de los métodos

(P 11.37-11.42) Diferentes tipos de instrumentos

A) Colorímetros

Estrictamente hablando, un colorímetro es un instrumento que utiliza como detector el

ojo humano. Los antiguos modelos de colorímetros (del que puedes ver un ejemplo en la
exposición INSTRUMENTA de la Facultad), actualmente han derivado en dos direcciones:

Colorímetros de comparación.

No hay selector de longitud de onda. Se trata de un dispositivo que permite comparar, a

través de un visor, el color de la disolución del analito con una rueda de colores que indica el
color que debería presentar en función de la concentración de ese analito. Los analitos se
determinan previa reacción con un reactivo colorimétrico adecuado que suele ir incorporado
en la propia cubeta de medida. En la cubeta de referencia se introduce la disolución del
analito sin reactivos.

Tiras de reactivos.

Las tiras de reactivos se emplean sobre todo para la determinación de especies

inorgánicas en aguas y están basados en la misma idea que las tiras de medida de pH:
contienen los reactivos adsorbidos (aunque en algunos casos requieren de la adición de
reactivos suplementarios) y toman diferentes colores en función de la concentración. En la
actualidad existen tiras de reactivos para la determinación de un limitado número de
parámetros y aplicables a muestras sencillas (aguas), aunque continuamente van apareciendo
nuevas posibilidades.

Como ya se ha visto, los colorímetros son usados también para la determinación de

compuestos inorgánicos mediante métodos basados en la formación de complejos (ver
apartado anterior).

B) Fotómetros

En estos instrumentos la fuente de radiación suele ser una lámpara de W (o un LED), el

selector de LO suele ser un filtro (generalmente llevan una rueda de filtros) y el detector suele
ser o una fotocélula o un foto-diodo. Suelen utilizarse cubetas de 11 cm de paso de luz o
tubos cilíndricos. En muchos casos reciben el nombre de fotocolorímetros. Como se puede
ver, al utilizar un fotómetro se está buscando un instrumento con posibilidades limitadas, pero
a cambio son instrumentos robustos, económicos y, en muchos casos, portátiles. Ópticamente
suelen ser instrumentos de haz simple y se utilizan básicamente para tres aplicaciones

1.- Medidas Rutinarias, es decir, cuando se quiere realizar un control rutinario de los
mismos parámetros. En muchos las medidas se basan en el desarrollo de una reacción

15
 colorimétrica, por lo que los fabricantes los distribuyen con los reactivos necesarios para
las determinaciones.

2.- Detectores en sistemas de cromatografía líquida. En este caso los equipos son
algo más sofisticados, ya que suelen abarcar una zona del espectro algo mayor (zona UV)
y las características técnicas son mejores.

3.- Instrumentos portátiles. Se trata de instrumentos robustos y autónomos. Tanto la

calibración como el uso es muy sencillo, pero su fiabilidad es limitada. Se pueden
encontrar instrumentos para una aplicación específica o para varios diferentes tipos de
determinaciones.

C) Espectrofotómetros

Se trata de instrumentos de mayor calidad y prestaciones, ya que:

A) Generalmente son de doble haz, o al menos de haz simple compensado.

B) Abarcan toda la zona UV-visible, para lo que suelen disponer de dos lámparas una
de W (para la zona visible) y otra de Deuterio (para la zona UV), que el instrumento
selecciona en función de la longitud de onda que se le requiera utilizar. Algunos
instrumentos sólo llevan una lámpara de deuterio para toda la zona espectral.

C) El selector de longitud de onda es un monocromador de red de difracción

D) El detector es un tubo fotomultiplicador o de calidad equivalente.

En el mercado se pueden encontrar muchos instrumentos que se adaptan a la

descripción de un espectrofotómetro, difiriendo en las características ópticas que presentan,
fundamentalmente en la luz parásita y el error fotométrico. Bajo este punto de vista se puede
hablar de instrumentos de gama baja, media o alta, en función de las prestaciones (ver
transparencias de clase).

En los últimos años ha habido un cierto interés en la utilización de la zona de infrarrojo

cercano del espectro (hasta 3000 nm). Esta zona no se cubre habitualmente con los
instrumentos de IR, de aquí que algunos espectrofotómetros UV-VIS la incorporen en sus
equipos. Resulta muy útil para el análisis de muestras sólidas en forma de finas láminas,
fundamentalmente polímeros.

También se utilizan los espectrofotómetros de tipo multicanal (de diodos en fila). Como
ya se indicó, estos instrumentos disponen de una serie de diodos en fila (en general unos
300), cada uno de los cuales mide la luz transmitida a una longitud de onda; el número de
diodos define el rango de longitudes de onda y el ancho de banda de los mismos. Por
ejemplo, para un instrumento de 300 diodos, si el rango de longitudes de onda que pueden
medir es de 300 nm (por ejemplo de 190 a 490 nm), el ancho banda es de 1 nm, mientras que
si están diseñados para toda la zona UV-visible (desde 190 hasta 820 nm), el ancho de banda
es de 2 nm. La ventaja de estos instrumentos es la velocidad de realización del espectro (0.1 s
aproximadamente), lo que los hace muy útiles para estudios cinéticos o como detectores en
cromatografía líquida.

(P 11.43-11.44) De las distintas configuraciones de instrumentos la más frecuente en

EAM UV-visible es el espectrofotómetro dispersivo de doble haz (por ej. el que se usa en
prácticas).

16
 Considerando despreciable el efecto de la luz parásita (ver posteriormente), todos los
instrumentos miden la absorbancia de la disolución a cualquier longitud de onda como el
cociente entre dos intensidades: la intensidad transmitida una vez que se ha producido el
proceso de absorción (Imuestra), y un valor de intensidad de referencia (Ireferencia). En la
disolución de referencia se pone todos aquellos compuestos que acompañan al analito y que
puedan absorber a la longitud de onda de trabajo (lo denominaremos “blanco”). En estas
condiciones y en aplicación de la ley de aditividad de absorbancia:

It ,m  I0 10( Absanalito  Absresto )

It ,ref  I0 10( Absresto )
Al medir la absorbancia, queda:

It,m I0 10 ( Absanalito  Absresto )

Abs   log    log  Absanalito (11)
It,ref I0 10( Absresto )

¿Por qué se hace el “cero” antes de medir?

La razón de ello es que en la realidad sólo una parte (q) de la luz que llega a la cubeta
incide realmente sobre el analito, perdiéndose el resto en reflexiones y dispersiones antes de
entrar en la cubeta. Como los pares de cubetas nunca son exactamente iguales y tampoco los
haces de muestra y referencia, en realidad esta fracción (qm y qref) es diferente en ambas, y
por lo tanto el valor de absorbancia realmente medido (1) vendrá dado por:

It,m q I 10( Absanalito  Absresto ) q

Abs   log    log m 0  ( Absresto )   log m  Absanalito (12)
It,ref qref I0 10 qref
y el valor de absorbancia vendrá afectado por esta diferencia.

Cuando se hace el “cero” en el instrumento colocando en las dos cubetas la misma

disolución, lo que se está haciendo en realidad es decir al instrumento que:
qm
 log 0
qref

con lo que el error desaparece.

Luz Parásita

(P 11.45-11.47) La luz parásita se puede entender como una radiación que circula por el
instrumento al margen de los procesos de interacción con la muestra, pero que también
alcanza el detector. En un instrumento la luz parásita tiene fundamentalmente dos orígenes:

1) Selector de longitud de onda. Cuando sobre un selector de longitud de onda entra

luz policromática, se espera que salga de él luz más o menos monocromática (en función del
AB). Sin embargo a esta radiación monocromática le acompaña siempre una cierta cantidad
de luz policromática que prácticamente no será absorbida en el compartimento de muestras y
llegará al detector. Esta radiación es la componente más importante de la luz parásita.

17
 2) Componentes ópticos. Siempre que la radiación llega o atraviesa un componente
óptico (espejos, lentes, e incluso las propias cubetas), parte de la radiación (la refractada o la
reflejada, dependiendo del elemento) sigue una trayectoria diferente a la del haz principal.
Esta luz constituye otra parte de la luz parásita.

La luz parásita de la que se ve afectada un instrumento se suele expresar como una

fracción (p) de la intensidad incidente a la longitud de onda de trabajo según:

Ip
p  (13)
I0

siendo Ip la cantidad de luz parásita. Esta luz parásita provocará que la absorbancia que el
equipo lea tenga un cierto error. Vamos a ver la magnitud y tipo de ese error.

A la hora de evaluar el error que produce la luz parásita, la situación más sencilla que
se puede presentar es aquella en la cual la disolución de referencia no absorbe a la longitud de
onda a la que lo hace el analito. Este sería el caso, por ejemplo, de la determinación del
Fe(III) por formación de complejo con el SCN-, o el caso frecuente de que se mida la
absorción directa de un analito disuelto en agua (ya que el agua no absorbe en la zona UV-
visible).

Vamos a denominar Absreal, al valor de absorbancia que realmente presenta la

disolución muestra. Si el equipo no estuviera afectado de luz parásita, el valor de absorbancia
que se leería coincidiría con este valor ya que:

It,muestra I0 10 Absreal

Abs   log    log  Absreal
It,referencia I0

Dado que la luz parásita llega al detector tanto cuando se lee la intensidad que
proviene de la cubeta de referencia (Ireferencia) como cuando se lee la radiación que proviene
de la cubeta de muestra (Imuestra) el valor de absorbancia que el equipo leerá para esta
disolución será (Absleida):

It,muestra  Ip I0 10 Absreal  Ip

Absleida   log   log
It,referencia  Ip I0  Ip

y considerando (13):

I0 10 Absreal  pI0 10 Absreal  p

Absleida   log   log (14)
I0  pI0 1 p
Con lo que el valor de absorbancia que el equipo da (Absleida) será diferente del que esta
presenta en realidad (Absreal). El error relativo en % que va asociado a cada valor de Absleido
es:

Absreal  Absleida
%error  100
Absreal

18
que combinada con (14) da:

Absreal  Absleida  Absleida 

%error  100 
 100 1  
Absreal  log 1  p 10 Absleida  p  
  
En la figura de la transparencia se muestra como varía el error que va asociado a cada
valor de absorbancia leído en dos equipos con distintos valores de p. Se indican también las
líneas que corresponden a los errores del 1% y 2% para que se usen de referencia. Esta figura
ayuda a establecer criterios de uso de valores de absorbancia. Por ejemplo, supongamos que
no se quiere cometer un error superior al 2% en la lectura de la absorbancia. Si el instrumento
del que se dispone tiene un valor de p=0,001 no se deberían leer valores de absorbancia
superiores a aproximadamente 2; si el equipo tiene un valor de p=0,0001, se podrían medir
valores de absorbancia hasta de 3.
Para valores de Absreal pequeños el error cometido es muy bajo, ya que para estos
valores
10 Absreal  p  10 Absreal  p  10 Absreal
y dado que p es mucho más pequeño que 1, la ecuación (14) se puede simplificar a:

10 Absreal  p 10 Absreal

Absleida   log   log  Absreal
1 p 1
pero cuando los valores de Absreal son muy altos entonces la simplificación que se
puede hacer es la contraria.

10 Absreal  p  10 Absreal  p  p (15)

y la ecuación (14) queda:
10 Absreal  p
Absleida   log   log  p 
1 p

Es decir, la absorbancia leida se hace independiente del valor de absorbancia real que
tenga la disolución de la cubeta el equipo. Dicho de otra forma para cualquier disolución que
cumpla la condición (15) el instrumento dara como valor de absorbancia –log(p).

Los fabricantes determinan, de la manera indicada, la luz parásita de los equipos que
comercializan; en general, suelen especificar cual de las dos disoluciones usan o, si emplean
ambas, cual es el valor de luz parásita obtenido con cada una. La luz parásita (“stray light”)
se suele dar como %T y por lo tanto:

p= 0,01*(%T)

Por ejemplo si un instrumento presenta una “stray light” de 0.1%, entonces p=0,001.

Ruido fotométrico

(P 11.48-11.51) Como ya se ha comentado el ruido es la principal causa de

incertidumbre (imprecisión) en las medidas de absorbancia. Esta incertidumbre en la
absorbancia se traslada después al resultado en concentración obtenido a partir de ella.

19
Aunque en todas las operaciones que se realizan en un instrumento aparece incertidumbre, las
principales fuentes de ruido son la lámpara (fluctuación temporal y espacial de su emisión) y
el detector (transformación de los fotones en señal eléctrica). Teniendo en cuenta la ley de
propagación de la incertidumbre:

s 2Abs  s 2Abs,lampara  s 2Abs,det ector (17)

Se ha estudiado en detalle el origen de estos ruidos y se han elaborado modelos que
permiten estimar su relación con el valor de señal leído.

En el caso del ruido debido al detector, la formulación matemática del ruido depende
del tipo de detector del instrumento. Si es un tubo fotomultiplicador o un fotodiodo, es decir,
un detector que transforma directamente la luz en señal eléctrica (detector de efecto
cuántico), el ruido recibe el nombre de ruido de disparo y su relación con la absorbancia es:

s Abs  0, 434 k disparo 110

Absleida  Absreferencia 
(18a)

Como se ve, el ruido aumenta con la Absleida y la Absreferencia, y con un factor kdisparo que
depende del instrumento. Si se expresa como DER queda:

1 10 leida
Abs  Absreferencia 
s Abs
DER 100  43, 4 k disparo (18b)
Absleida Absledida

Si el detector es de efecto térmico como en los instrumentos de IR o también en los

multicanales de fotodiodos (la señal de luz se transforma primero en una señal térmica y
luego en una eléctrica), entonces el ruido recibe el nombre de ruido térmico y las expresiones
(18a) y (18b) pasan a ser:

2 Absleida  Absreferencia 
s Abs  0, 434 k term 110 (19a)

2 Absleida  Absreferencia 
110
%DER Abs  43, 4 k term (19b)
Abs

El ruido asociado a la fluctuación de la fuente de radiación se denomina ruido de

parpadeo. El tratamiento teórico permite establecer que para este tipo de ruido:

s Abs  0, 434k parpadeo (20a)

43, 4 k parpadeo
%DER Abs  (20b)
Abs
Este ruido solo es importante en instrumentos que no pueden compensar esta
fluctuación, como ocurre en los instrumentos portátiles o de gama baja.

20
 Para obtener el valor de k, antes se ha visto que la fracción de luz parásita aparece
expresamente como un dato de calidad en las especificaciones del instrumento. Se podría
pensar que lo mismo debería ocurrir con el valor de k, sin embargo, dado que el fabricante no
está obligado a darlo lo que suele ofrecer es la incertidumbre con la que el instrumento lee
determinados valores de absorbancia; a partir de esos datos nosotros podemos estimar el valor
de k.

Para ello podemos usar la información que aparece bajo el epígrafe “photometric noise”
(ruido fotométrico), que indica la sAbs para Abs=0.

También podemos usar la información que aparece bajo el epígrafe “photometric

reproducibility” (reproducibilidad fotométrica); esta información puede darse de varias
maneras, por ejemplo, pueden darse uno o varios valores de incertidumbre para un valor de
absorbancia o un rango de valores de absorbancia, por ejemplo:

Photometric reproducibility: ±0.001 (entre 0 y 0.5 Abs) ±0.002 (entre 0.5 y 1.0
Abs)

Generalmente delante del valor de incertidumbre suele aparecer los indicativos “rms” o
“peak-to-peak”; en el primer caso la incertidumbre es directamente la sAbs; en el segundo caso
es 5sAbs. Si no se indica nada, como en este caso, se asume que es “peak-to-peak. Los datos
indicados en (22) son un tanto indefinidos ya que no están pensados para que se pueda
calcular de ellos el valor de k, pero podemos usarlos para hacer una estimación. Por ejemplo,
podríamos calcular 2 valores de k considerando una absorbancia promedio en cada intervalo,
es decir:

sAbs Abs k calculada (ecuación 18a)

±0.001/5 0.25 0.00028
±0.002/5 0.75 0.00036
y a partir de aquí tomar el mayor (0.00036) o el promedio (0.00032).

21
 Ejemplos de Instrumentos y accesorios

(P 11.52) Además de los instrumentos convencionales también es interesante citar

algunos accesorios. La utilización de la fibra óptica ha supuesto un paso importante en los
usos de la espectrometría UV-vis aplicada. Básicamente lo que permite una fibra óptica es
poder medir fuera del laboratorio y esto es fundamental cuando queremos monitorizar un
proceso (midiendo la absorbancia de uno de los reactantes o productos) o cuando queremos
controlar la concentración de un parámetro determinado (por ejemplo, nitratos en agua).

Una aplicación muy interesante de las fibras ópticas es para la realización de

volumetrías fotométricas. En una volumetría fotométrica, al menos una de las especies que
participa presenta absorción en la zona del espectro, siendo frecuente que esta sustancia sea el
indicador. Las curvas de valoración que se obtienen presentan una forma similar a las de la
volumetría convencional. El uso de fibras ópticas están dando lugar a una nueva familia de
instrumentos modulares miniaturizados, en los que los diferentes componentes (fuente de
radiación, monocromador, detector,..) están unidos por fibras ópticas.

Cuando un haz de luz incide sobre un sólido, junto con la absorción se produce también
dispersión. Este proceso generalmente da lugar a que la radiación se extinga antes de llegar al
otro extremo del sólido, por lo que no es posible la medida de la luz transmitida, pero a
cambio se produce un haz de luz reflejada (IR) que si se puede medir; el término Reflectancia
(equivalente al de Transmitancia) representa el cociente IR /I0 Ese haz de luz contiene
también la información de lo que el sólido absorbe y, por lo tanto, permite obtener
información cuantitativa.

Con el uso de esferas integradoras es posible obtener señales mucho más reproducibles.
Una esfera integradora es un dispositivo esférico, cuyo interior es especular, con un orificio
de entrada de luz y otro de salida. Al hacer incidir luz dentro de ella, se producen múltiples
reflexiones en las paredes especulares, lo que produce una homogeneización de la luz en el
interior, y el resultado es que se consigue un flujo estable de luz en el orificio de salida.
Cuando se coloque la muestra, la radiación acabará incidiendo en todos los puntos de su
superficie, obteniéndose una absorbancia promedio de dicha superficie, haciéndola
independiente de su colocación exacta.

6.1.5. Aplicaciones cuantitativas: elección de método

(P 11.53-11.56) Ver trasparencias

11.1.6. Interferencias y su eliminación

(P 11.57-11.58) En EAM podemos encontrarnos con dos tipos de interferencias por su

efecto: proporcionales y aditivas. Dentro de las proporcionales cabe destacar:

-Sustancias que al alterar las propiedades físicas del medio (fuerza ionica, viscosidad,
densidad), modifican el valor de . Estas serían interferencias físicas

-Sustancias que pueden reaccionar con el analito, alterando su concentración disponible

Estas serían interferencias químicas.

-Las sustancias que dan señal como el analito producen interferencias aditivas
(espectrales).

22
 Para eliminar las interferencias proporcionales se deberá usar calibración por adición
estándar

Para eliminar las interferencias aditivas hay varios procedimientos:

- Algunos son genéricos como los métodos químicos

- Otros son más sencillos como la selección de .

- Métodos indirectos (formación de complejos, métodos cinéticos y valoraciones).

- Se pueden usar métodos quimiométricos:

Tomando como base la ley de aditividad de las absorbancias, es posible llevar a cabo
una determinación simultánea del analito y de la especie o especies interferentes, utilizando
valores de absorbancia a diferentes . Para ello la metodología a seguir se basa en resolver
un sistema constituido por tantas ecuaciones como incógnitas, donde cada ecuación es la
absorbancia a una  y cada incógnita es la concentración de uno de los componentes a
determinar:
   
Abs m1   A1 [A ]   B1 [ B] ......  N1 [ N ]
   
Abs m2   A2 [A ]   B2 [ B] ......  N2 [ N ]
. . . . . . . . . . . . . . .. .....................................
   
Abs mn   An [A ]   Bn [ B] ......  Nn [ N ]
En este sistema de ecuaciones, todos los valores de  son conocidos o se pueden
conocer (a partir de disoluciones patrón de los “n” analitos) y los valores de Absm son los que
presenta la muestra. En la práctica, la aplicación de esta metodología a problemas reales es
limitada. Experimentalmente se comprueba que la ley de aditividad se cumple solo de forma
parcial (efecto de la luz parásita, deriva, incertidumbre en la absorbancia,...), con lo que los
errores cometidos suelen ser graves, si bien el método permite una estimación de los valores
de concentración.

Alternativamente se obtienen resultados más exactos utilizando los métodos

multilongitud de onda, también denominados métodos Multiparamétricos. Muchos métodos
Multiparamétricos requieren del uso de programas específicos de ordenador para la
resolución de los algoritmos en los que se basan, sin embargo hay un método sencillo para la
resolución de mezclas binarias, denominado MLRA (análisis por regresión lineal multi-
longitud de onda) y que no requiere cálculos demasiado complejos.

- En EAM, se pueden usar métodos volumétricos para eliminar interferencias ya que la

volumetría no deja de ser un método indirecto en el que se añade el reactivo poco a
poco, por lo que el analito de mayor constante reaccionará antes. Además de para
quitar interferencias, la volumetría también tiene otras ventajas.

- Espectrofotometría derivada:

Un espectro derivado es la representación de dA/d frente a la longitud de onda, es

decir, la variación de la pendiente del espectro en función de la longitud de onda. Por
extensión, se pueden obtener también espectros derivados de órdenes superiores ( dnA/dn),
aunque no es habitual utilizar ordenes de derivada superior a dos. Este tipo de espectros

23
puede realizarse, de forma rutinaria, con la mayoría de los espectrofotómetros existentes en el
mercado. Cuando se realiza un espectro derivado, se busca magnificar los detalles del
espectro normal y utilizarlos desde el punto de vista analítico. Para ello la espectrofotometría
derivada parte de que un espectro “puro” responde a una gausiana; la primera derivada
transforma la gausiana en dos curvas invertidas entre sí que ocupan el mismo intervalo de
longitudes de onda, y la segunda en tres que también ocupan el mismo intervalo. Cuando en
un espectro aparece cualquier variación sobre la forma gausiana, se producen alteraciones
importantes en los espectros derivados que suelen dar lugar a la aparición de nuevas curvas
atribuibles a dicha alteración. La capacidad que tiene un espectro derivado para resaltar un
detalle espectral depende de la distorsión matemática que este detalle provoque sobre la
gausiana.

11.1.7. Otras aplicaciones. Valoraciones fotométricas

(P 11.59-11.60) La EAM es una técnica ideal para el seguimiento de valoraciones y la

detección del punto final. Su aplicación se basa en observar como varia la absorbancia de una
de las especies que interviene en una valoración y sobre la base de esa variación detectar el
punto final.

La utilización de la EAM presenta algunas ventajas frente a la valoración clásica con

indicador e incluso frente a las valoraciones potenciométricas. Las más importantes son:
1.- Si se trabaja con volúmenes muy pequeños de valorante, las curvas de valoración son
lineales y no logarítmicas, con lo que resulta más precisa la localización del punto final.
2.- Se evita el error de subjetividad.
3.- Se pueden determinar cantidades más bajas de sustancias, en función de la absortividad de
la especie absorbente.
4.- La presencia de coloración en la disolución, por otras sustancias, no molesta.
5.- Se puede ahorrar una gran cantidad de muestra.
6.- Se puede aplicar a un mayor número de analitos, dado que el criterio de precisión por la
constante no es tan exigente.
Lo más habitual es que una o varias de las especies que participan en la reacción
tengan propiedades de absorción. En función de cual de ellas absorbe la forma de la curva de
valoración obtenida es distinta (ver figura 1). En todos los casos se observan dos zonas donde
la absorbancia varia linealmente con el volumen de agente valorante. El punto de corte
observado al prolongar los dos tramos rectos da el punto de equivalencia. Desde un punto de
vista práctico la valoración se realiza de forma sencilla, puesto que basta con poder trazar los
dos tramos rectos. Para ello se toman valores de absorbancia (por ejemplo, 3) antes del punto
de equivalencia y otros tantos una vez pasado el punto de equivalencia.

Figura 1.Diferentes casos de curvas de valoración

Reactivo Analito Producto

Reactivo y Reactivo y Reactivo y

Analito Producto Producto

24
 De la misma forma que en volumetrías con indicador visual, también es posible la
valoración de mezclas de especies, obteniéndose curvas cuya forma depende también de la
especie o especies absorbentes.

También es posible llevar a cabo la valoración empleando reacciones en las que no

intervengan sustancias con propiedades espectrofotométricas. Para ello se requiere la adición
de un indicador que si presente dichas propiedades (similar a los empleados en volumetría
con indicador visual), obteniéndose la variación de absorbancia de ese indicador, a partir de
la cual se puede obtener también el punto final.

Desde un punto de vista práctico la valoración se hace usando una microbureta que
permite añadir volúmenes muy pequeños de agente valorante (de forma automática o no) y/o
midiendo la absorbancia utilizando una fibra óptica.

11.2. EAM Infrarrojo

11.2.1. Aspectos analíticos generales de EAM Infrarrojo

(P 11.2.1-11.2.9) La EAM-IR es una técnica que se basa en la absorción de radiación

de la zona IR del espectro (1 m-1000 m, aproximadamente) por especies moleculares. A
modo de presentación y de comparación con la EAM-UV visible se pueden hacer las
siguientes consideraciones.

1.- Abarca una zona del espectro mucho más amplia que la EAM UV-vis. Mientras que
el UV-visible comprende una zona de unas 0.8 m (desde 0.2 m hasta 1m
aproximadamente), el IR ocupa casi 1000 m. Es por ello que suele dividirse a su vez en otras
tres zonas:
IR-Cercano (NIR)  Hasta los 2.5 m. Zona que esta encontrando cada vez mayor
utilidad desde el punto de vista cuantitativo.
IR-Medio (MIR)  Desde los 2.5 m hasta las 50 m. Esta zona es la más clásica del
IR, se utiliza hasta aproximadamente los 15 m y suele dividirse en otras dos:
* Desde 2.5 hasta 6.5 m  Zona de frecuencias de grupo
* Desde 6.5 hasta 25 m  Zona de la huella dactilar
Estas dos zonas tienen una clara utilidad cualitativa y estructural pero también ciertas
aplicaciones cuantitativas.

IR-Lejano (IRL)  Desde los 50 m. Esta zona es poco útil.

2.- Es una técnica que tiene aplicaciones concretas en fase gas (ámbito
medioambiental y control de calidad), fase sólida (análisis de alimentos, control de
polímeros y fármacos) y fase líquida (muestras de alimentos), pero también para sustancias
que no absorben radiación UV-visible en general.

3.- Comparando sus aspectos cuantitativos y prácticos con los de la EAM-UV visible,
es una técnica de menor sensibilidad intrínseca (los valores de absortividad molar son muy
bajos) y una mejor selectividad; además la medida es también rápida, el costo de
adquisición es mayor, en general, medio y su implantación en laboratorios de rutina es
menor.

25
 4.- Desde un punto de vista cuantitativo, la calibración de los instrumentos es poco
estable, los métodos son, en general, directos y adolecen como problema adicional de la
absorción del agua, lo que limita su uso como disolvente.

5.- Desde un punto de vista instrumental, la problemática es distinta a la EAM UV-

visible ya que: a) Hay muchos instrumentos diseñados para aplicaciones concretas; b) Al ser
una zona espectral grande, es difícil encontrar un material que se ajuste a toda ella de forma
apropiada así que hay compartimentos de muestras de muchos tipos de materiales; c) Hay una
gran variedad de compartimento de muestras, en función de las características de la muestra;
y d) Los instrumentos suele ser de Transformada de Fourier.

El origen de la teoría de infrarrojo está en que las moléculas no son asociaciones de

átomos rígidas; a temperatura normal, los átomos unidos mediante un enlace de constante de
fuerza k están en continuo movimiento vibratorio sobre sus posiciones de equilibrio. Hay
posibilidad de transiciones entre niveles vibracionales y rotacionales por absorción de
radiación IR.

Una molécula puede absorber radiación de la zona IR si:

- El momento dipolar de la molécula cambia durante la vibración
- La frecuencia υ del fotón coincide con la frecuencia de la vibración
Existen moléculas activas e inactivas para IR:
- Los enlaces polares suelen ser activos para IR
- Los enlaces no polares en moléculas simétricas no tienen actividad en IR
- Las moléculas homonucleares diatómicas no son activas en IR

11.2.2. Sensibilidad en EAM Infrarrojo

Moléculas Diátomicas: Predicción de la () y 

(P 11.2.10-11.2.12) Para poder establecer las posibilidades de determinación de una

sustancia por EAM-IR es fundamental conocer las  de absorción y sus valores de . Estos
parámetros se pueden obtener de las bases de datos de espectros (la base NIST citada en el
tema anterior sirve para ello), pero también conviene disponer de unas nociones teóricas
mínimas.

De la misma manera que en EAM UV-visible, también en EAM-IR resulta más sencillo
establecer las características de absorción primero para una molécula diatómica (un enlace
entre dos átomos) y posteriormente extenderlo a moléculas de mayor tamaño o al resto de la
molécula.

Considera un sistema mecánico sencillo constituido por dos bolas que están unidas a
través de un muelle. Si a este sistema se le aplica energía comprimiendo o extendiendo el
muelle y luego se le deja libremente, dicho sistema empieza a moverse de una forma
periódica en torno a un posición de equilibrio, describiendo un movimiento armónico simple,
cuya frecuencia viene dada por:

v k (1)
m 
2 

26
 Donde k es la constante del muelle y  es la masa reducida del sistema (que se obtiene a
partir de los pesos de las dos bolas, m1 y m2).

Este modelo mecánico tan sencillo puede servir adecuadamente para describir los
efectos que la radiación IR provoca sobre las molécula; basta con sustituir las bolas por
átomos y el muelle por el enlace. Esto da lugar a que en la ecuación m1 y m2 pasan a ser las
masas de los átomos (¡ojo!, no los pesos moleculares), k la fuerza del enlace y m es la
denominada frecuencia de vibración fundamental. En esta ecuación K es la fuerza del
enlace (depende de cada par de átomo y del tipo de enlace, pero se puede generalizar que para
enlaces sencillos, dobles y triples presenta valores de 500, 1000 y 1500 aprox.),  es la masa
reducida del par de átomos y d es el cambio de numero vibracional (1; puede ser superior 2,
armónicos)

En la tabla 11.2 se indican los valores calculados para algunas parejas de átomos que
pueden encontrarse frecuentemente en moléculas orgánicas. En la práctica estos grupos
diatómicos absorben radiación a longitudes de onda próximas a los valores obtenidos, con
ciertas variaciones entre moléculas debidas al efecto del resto molecular. En la tabla se
indican también los rangos de valores experimentales a los que suelen absorber en la práctica
estos grupos, obtenidos a partir de Tablas de Correlación.

Tabla 11.2.- Valores de k experimentales para algunos enlaces

Enlace k (N/m) Enlace k (N/m) Enlace k (N/m) Enlace k (N/m)

H-H 514 H-P 311 C-S 330 N=O 1500
H-C 550 H-S 429 C=C 915 N=S 830
H-N 705 C-C 440 C=O 1276 C≡C 1650
H-O 845 C-O 510 C=S 770 C≡N 1810

Como sabes la aplicación fundamental del IR es el análisis cualitativo y la elucidación

estructural, por lo que el objetivo es simplemente detectar si una determinada banda espectral
aparece o no y si es poco o muy intensa. Es por ello que se ha puesto poco cuidado en
calcular y tabular los valores de  de los pares diatómicos, de hecho, los valores de
absortividad molar no suele encontrarse tabulados y a cambio aparecen las denominaciones
vs (very strong), s (strong), m (médium), w (weak) y v (variable) que hacen referencia
cualitativamente a este parámetro.

Moléculas Poliatómicas: Predicción de la () y 

Una molécula biatómica solo tiene una forma (modo) de vibrar, por lo que solo tiene
una frecuencia de vibración fundamental, dada por la ecuación (1). Sin embargo una
molécula poliatómica tiene varias formas distintas de vibrar; por ejemplo, una molécula
triatómica lineal podría vibrar de cuatro formas (modos) fundamentales distintas,

Cuando se pasa de moléculas diatómicas a poliatómicas la principal diferencia es que

el número de modos de vibración fundamental se incrementa. Cada uno de estos modos de
vibración tendrá su nivel fundamental y sus niveles excitados, por lo que el número de bandas

27
y el de sobretonos en el espectro se incrementa considerablemente. Para una molécula de N
átomos se deduce que el número de modos de vibración fundamental es de 3N-6 para
moléculas no lineales y de 3N-5 para moléculas lineales.

Es costumbre asignar a cada uno de los modos de vibración nombres que reflejan el
movimiento molecular que se produce. Por ejemplo, reciben el nombre de vibraciones de
tensión aquellas que solo afectan a las distancias de enlace, permaneciendo constantes los
ángulos de enlace, y de deformación a las que afectan a los ángulos y prácticamente nada a
las distancias. A su vez cada una de ellas recibe diferente nombre en función del efecto que
provoca sobre la molécula (por ejemplo, tensión simétrica si mantiene la simetría durante la
vibración y tensión antisimétrica si cambia, y otros muchos).

Desde el punto de vista de la predicción de las frecuencias, no existen modelos

sencillos que permitan hacer el cálculo como en el caso de las moléculas diatómicas, sin
embargo algunos modos de vibración se pueden considerar similares a los que se observan en
grupos diatómicos concretos.

Desde el punto de vista cuantitativo lo más interesante de los espectros de estas

especies es:

1) En muchos casos las bandas debidas a los modos normales de vibración de grupos
diátomicos con cierta relevancia en la molécula (C=O, C=N, C-O,…) se siguen viendo, si
bien:
- Su frecuencia vienen un poco alterada por el resto molecular
- Pueden verse enmascaradas por otras bandas
- Pueden aparecer bandas de combinación
2) Tienen interés bandas que aparecen asociadas a las vibraciones de moléculas
triatómicas (volátiles pequeñas NO2, CO2, SO2, H2O,…) o grupos triatómicos concretos (-
CH2), o incluso mayores, aunque sus bandas son poco usadas.

11.2.3. Aplicaciones en fase gas. Instrumentación

(P 11.2.13-11.2.16) Una de las aportaciones más importantes de la espectrofotometría

de absorción en el IR es el análisis de gases permanentes (moléculas pequeñas de carácter
inorgánico u orgánico) en el ambiente, tanto los que constituyen las diferentes capas de la
atmósfera (endógenos), en particular la troposfera, como los gases que pueden ser emitidos
como consecuencia de la actividad industrial, de la contaminación o de procesos (ciclos)
biológicos (exógenos). Además de esta aplicación, la IR tuvo un importante papel como
sistema de detección en Cromatografía de Gases, llegando a comercializarse por algunas
casas comerciales; sin embargo, la aparición del detector de masas, con su mayor sensibilidad
y mayor capacidad de identificación desplazó por completo al IR de esta aplicación.

Como se ha indicado antes, las moléculas biatómicas homo-atómicas, como el N2, el O2

o el H2 son transparentes en la zona del IRM, sin embargo el CO2 y el H20 presentan
absorción intensa. Además en la atmósfera hay otros gases en menor concentración (CH4, O3,
óxidos de nitrógeno,…). Del espectro de la atmósfera (ver transparencia) se pueden deducir
varias cosas importantes:

1) Es posible escoger longitudes de onda (números de onda) para la determinación

selectiva de cada uno de esos compuestos sin interferencia apreciable de los demás; en la
figura se marcan las longitudes de onda habitualmente utilizadas.

28
 2) Hay una zona del espectro, que abarca desde 1150 hasta 700 nm, y que esta
sombreada en la figura, en la que los compuestos endógenos de la atmósfera prácticamente no
absorben. Esta zona, que se conoce como Ventana Espectral de la Atmósfera puede ser
utilizada para la determinación de compuestos gaseosos emitidos y cuya determinación por
temas industriales, medioambientales o sanitarios puede ser interesante. Incluso la zona en la
que absorbe mayoritariamente el metano y el N2O se puede considerar también libre cuando
se quieren determinar gases que, por diferentes motivos, pueden estar a elevadas
concentraciones.

Desde el punto de vista analítico, el problema más importante es la determinación de

compuestos exógenos que es en la que se centrará este apartado. Para este tipo de
compuestos hay una serie de aspectos analíticos adicionales que deben ser considerados para
entender mejor la problemática real:

a) El número de compuestos exógenos que se pueden analizar en la atmósfera es

enorme. Por ejemplo, la OSHA (Occupational Safety and Health Administration, EEUU),
que es la agencia encargada de asegurar la salud y la protección de los trabajadores, ha
regulado los niveles de más de 300 compuestos2.

b) A cambio los espectros de absorción en fase gas son mucho más estrechos que los
compuestos en fase líquida (menor aun si se encuentran a baja presión), ya que algunas de las
causas de ensanchamiento desaparecen. Esto simplifica el problema de las interferencias.

c) En general, los compuestos exógenos no se encuentran todos juntos en la misma

muestra sino que, por su propio origen, suelen aparecen de forma aislada o en grupos
restringidos, lo que simplifica aun más el problema de interferencias.

d) Los niveles permitidos para la mayoría de los compuestos son muy bajos, lo que
unido a la baja absortividad molar complica mucho la determinación. Además hay un
problema adicional que afecta a la sensibilidad. La resolución de los selectores de  usados
es, en algunos casos, menor que lo que requeriría la anchura de los picos de absorción, de
forma que el ancho de banda (AB) de la radiación es muy superior a lo que abarca el máximo
por lo que en la práctica no es posible trabajar con radiación que se pueda considerar
monocromática, en el sentido de que el valor de  de la muestra para todo el rango que abarca
el AB sea el mismo, especialmente cuando se trabaja con sustancias en fase gas.

Esto provoca dos problemas importantes. El primero es que los rangos de respuesta
lineal se acortan, al no trabajar con luz monocromática. El segundo es que el valor de
absortividad molar que manifiesta el compuesto es un promedio (  ) de toda la banda, por lo
que este valor será muy dependiente del instrumento en particular que se esté usando; además
resulta difícil encontrar valores de absortividad molar tabulados que se correspondan con los
reales, por lo que el diseño de métodos se complica.

Por lo dicho anteriormente la instrumentación que se utilice para estas

determinaciones debe evitar que se produzcan interferencias (aunque ya se ha indicado que es
un asunto menor), pero sobre todo debe resolver el problema de la sensibilidad.

2
En la página web de esta agencia (http://www.osha.gov/) se puede encontrar información muy detallada sobre estos
niveles

29
 Por este motivo se trabaja con sistemas de paso óptico grande, que es la opción más
utilizada, sobre todo cuando se precisan instrumentos portátiles. Estos instrumentos llevan
filtros como selectores de longitud de onda de filtros (que se eligen en función del analito que
se quiera determinar) y compartimentos de muestra multipaso, en los que, con un diseño
adecuado de la celda, la radiación pasa muchas veces a través de ella por lo que el camino
óptico se multiplica. De esta forma es posible trabajar con pasos ópticos efectivos de varios
metros (30 e incluso mas), con instrumentos relativamente pequeños.

En este mismo campo, una aplicación muy habitual es la utilización de IR como base
de los detectores de gases inflamables. Para esta aplicación el instrumento es un fotómetro
miniaturizado, que dispone de un LED emisor de luz y un detector. El dispositivo mide en
realidad al número de onda correspondiente a la absorción del C-H (en torno a 3400 cm-1),
por lo que no es en absoluto selectivo a ningún compuesto, pero sí ofrece información de la
presencia de hidrocarburos saturados (metanol, etanol, propano, butano…) en concentración
elevada (superior a su nivel de inflamación o LEL). Este tipo de dispositivos es el que
habitualmente se utiliza para controlar la atmósfera en edificios (por ejemplo, en la Facultad)

11.2.4. Aplicaciones en fase líquida y sólida. Instrumentación

(P 11.2.17-11.2.26) En IR también existen espectrofotómetros de aplicación

general. Este tipo de instrumentos permiten hacer espectros y medidas a longitud de onda
fija, y en la mayoría de los casos son de tipo no-dispersivo, basados en la Transformada de
Fourier (TF), que serán los que se traten en este apartado. Es importante indicar que en los
últimos años están proliferando los espectrofotómetros del IR próximo (NIR).

En un instrumento no dispersivo la separación de las distintas del haz policromático

se realiza de forma matemática. Los instrumentos de TF están basados en espectros de
dominio de tiempo. Fourier estableció que cualquier movimiento ondulatorio complejo se
puede considerar constituido por una combinación de movimientos ondulatorios simples, e
invento un procedimiento matemático que permitía hacer esa descomposición que es la
transformada de Fourier

De una forma muy global lo que la TF hace es lo contrario a lo que ocurre en un

fenómeno de interferencia de ondas:

* En la interferencia de ondas la intensidad en cada instante se obtiene por la

combinación de la intensidad de cada onda monocromática; sabemos las componentes y
queremos calcular la resultante.

* En la transformada de Fourier sabemos que la intensidad en cada instante será la

combinación de la intensidad de las diferentes ondas monocromáticas, es decir, sabemos la
resultante y queremos calcular las componentes.

En realidad no es tan complicado como parece ya que las frecuencias de los

movimientos resultantes las conocemos (todas, un intervalo dado), pero queremos conocer la
amplitud.

Hecho esto podemos transformar un espectro de dominio de tiempo en otro de

dominio de frecuencia.

30
 ¿Cómo se aplica la transformada de Fourier en los instrumentos?

¿Qué necesitamos para hacer esto? Obtener con suficiente precisión el espectro de
dominio de tiempo de la onda policromática y disponer del programa matemático que hace la
transformación.

Si esto es así de fácil, los instrumentos de TF serían muy económicos (solo requerirían
el programa). Pero hay un pequeño problema: la velocidad de lectura del detector.

Los detectores, incluso los más rápidos tienen una velocidad de lectura muy inferior a
la necesaria para obtener una buena resolución (del orden de 1010 veces más lenta); es decir si
el espectro de la figura ocupara 1010 s, el detector podría hacer una lectura, con lo cual es
imposible obtener el espectro). Por ello es necesario disponer de un mecanismo que produzca
un retardo controlado en esas variaciones de intensidad, es decir, transformar el movimiento
policromático en otro exactamente igual pero más lento. Esto se consigue con un dispositivo
denominado interferómetro, que todos los dispositivos deben llevar.

Las características de los instrumentos de TF son:

- Barridos instantáneos.
- No hay luz parásita ni órdenes de interferencia
- Io son grandes
- También hay AB (depende del grado en el que se retarde la onda original
- Instrumentos más caros y de mantenimiento más complejo
- No sirven para todas las zonas del espectro ( IR en adelante)
Por tanto, un instrumento de TF consiste en una fuente de radiación, un detector y el
interferómetro (Interferómetro de Michelson). La misión del interferómetro de Michelson, es
“ralentizar” la frecuencia de la radiación para que su frecuencia sea adecuada a la respuesta
del detector. En los instrumentos de FTIR es frecuente que se incorpore un laser de He-Ne
(luz roja) con la finalidad de conocer exactamente la posición del espejo móvil y de
establecer puntos referenciales adicionales para la obtención del espectro.

Dado que la zona de IR es muy amplia, algunas casas comerciales ofrecen la

posibilidad de elegir el detector y la fuente de luz más adecuados al rango habitual en el que
se vaya a trabajar. En general:

1) Fuentes de radiación. Una lámpara de W-halógena (similar a las que se utilizan en

UV-vis), o una lámpara de material cerámico (cuyo funcionamiento es similar a la anterior
pero con un elemento activo distinto), son las más adecuadas para esta zona del espectro.

2) Detectores. Los detectores habituales de IR son de efecto térmico, y por lo tanto

menos sensibles y más lentos que los de la zona UV-vis. Dentro de ellos, el más usado en los
instrumentos de TF es el piroeléctrico de Sulfato de Triglicina Deuterado (DTGS); para
obtener mayores sensibilidades se utilizan detectores de semiconductor enfriados en N2-
líquido (generalmente de HgCdTe también denominados MCT).

Los instrumentos de TF tienen muy poca luz parásita por lo que el error intrínseco que
ésta genera a valores de absorbancias altos no existe. Generalmente en las especificaciones de
los instrumentos no suele venir este parámetro, pero puede considerarse que un 0.0003% es
representativo para la mayoría de los equipos. Para este valor de luz parásita, la absorbancia
más alta que podría dar un equipo sería de 5.5; aplicando el criterio del 1% de error, la
absorbancia que se debería medir esta en torno a 4.5. Sin embargo, la EAM-IR se caracteriza

31
porque hay muchas causas de absorbancia de fondo: el ambiente, las propias celdas de
medida o el disolvente, dan un valor de absorbancia añadido al del analito, y que es necesario
corregir con un blanco o referencia adecuados. Un valor de absorbancia alto del blanco limita
el rango de absorbancias que se puede utilizar.

Los detectores de IR son de tipo térmico y por lo tanto el ruido que provocan sobre la
absorbancia leída responde a la ecuación:

sAbs  0, 434 kterm 1  10 

2 Absleida  Absreferencia 
(5)

que da lugar a representaciones de DER con la Abs por lo que el ruido limita tanto los
valores de absorbancia mínimos como los máximos a utilizar. Sin embargo, dado que los
instrumentos de TF permiten hacer muchos espectros en muy poco tiempo, es posible
disminuir el ruido promediando señales3 , que esta relacionado con lo que se conoce como
ventaja de Fellgett de los instrumentos de TF, y así trabajar con valores de absorbancia más
bajos. Por ello, los instrumentos de TF suelen tener como opción instrumental el “número de
espectros a hacer”.

Al igual que ocurre en los instrumentos de EAM UV-vis, en los instrumentos de FTIR
es posible deducir de una forma aproximada el valor de la constante instrumental k de la
ecuación (5) a partir de los que aparecen en las especificaciones. En estos instrumentos es
tradicional incluir el valor de relación señal/ruido (S/N). El inverso de este parámetro daría la
sAbs para Abs=0, es decir, el ruido de fondo del instrumento. En algunas cosas la S/N se
indica como “signal-to-noise (rms)” y en otras como “signal-to-noise (peak-peak)”; en el
primer caso, el inverso de S/N da sAbs y en el segundo el inverso de S/N es 5sAbs. En un
instrumento de FTIR el valor de k esta en torno a 0.00004 que sería del orden de los
instrumentos de alta gama de UV-visible y que permitiría medir valores de absorbancia de
0.001 con una incertidumbre en torno al 1% (DER).

El valor de k indicado se corresponde con la medida de un solo espectro, por lo que se

puede mejorar sustancialmente este valor a través del promediado, si bien en la práctica esto
se haría a costa de incrementar mucho el tiempo total de medida. Por ejemplo para conseguir
obtener medidas de Abs de 0.0001 con una precisión del 1% se necesitaría que el valor de k
fuera 10 veces menor, y por lo tanto se deberían promediar 100 espectros, lo que supone
incrementar el tiempo de medida del instrumento desde 4 s a 400 s (casi 7 minutos).

Compartimentos de muestra para fase líquida

En IR hay una gran variedad comercial de materiales de los que están hechas las
celdas y otros componentes, sencillamente porque ninguno cumple con todos los requisitos
esperables, fundamentalmente su inercia química y su buena transmisión en todo el espectro.
En la figura de la transparencia se indican algunos de los más utilizados, junto con la zona del
espectro en la que se pueden utilizar. Materiales como los halogenuros alcalinos tienen el
problema de su alta solubilidad en agua y otros disolventes. Los halogenuros de
alcalinoterreos tienen también una cierta solubilidad. Los sulfuros o seleniuros, así como el
Ge son quebradizos y el diamante tiene una zona de transmisión limitada.

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Como recordarás, el ruido disminuye según la raíz cuadrada del número de medidas realizadas. Por ejemplo, cuando se
promedian 4 espectros, el ruido observado es la mitad que si solo se hace uno. No obstante es importante recordar que hay
una componentes del ruido que no se puede eliminar por muchos promediados que se hagan.

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 En cuanto a los disolventes, la mayoría de ellos dan señales de absorción en el IR. No
obstante el uso de los disolventes orgánicos va muy ligado a estudios de identificación y o a
estudios estructurales. Desde un punto de vista cuantitativo, la mayoría de las muestras que se
quieren analizar o van a ser sólidas o van a ser muestras acuosas y, por lo tanto, van a tener
que considerar el agua como disolvente.

Dado que el agua tiene una gran tendencia a formar puentes de hidrógeno y clusters, su
espectro IR cambia en función del estado de agregación; el espectro en fase líquida se
observa en la figura de la transparencia. Como se ve, hay una zona que prácticamente no se
puede emplear (por debajo de 3000), luego hay una zona entre 2000 y 1000 con una cierta
absorción (bandas fuertes); dentro de esta zona, entre 1000 y 1500 cm-1 la absorbancia es
bastante estable, es decir, que más o menos absorbe lo mismo en toda esa zona y finalmente
entre 2000 y 3000 que si se puede utilizar. Por lo tanto el H2O, aun siendo un mal
disolvente, hay zonas en las que se puede utilizar. Generalmente se suele medir de dos
maneras:
- Restar el espectro almacenado del H2O (substraccion espectral)
- Usar una longitud de onda correctora (va especialmente bien, si es posible, la zona
entre 1000 y 1500 cm-1
- Si es posible disminuir el paso óptico para que el aporte del agua sea mínimo
Al contrario de lo que ocurre en EAM UV-visible, en IR lo habitual es trabajar con
cubetas individuales y sistemas de haz simple. Una de las razones es porque el paso óptico de
las cubetas, que generalmente es muy pequeño (del orden de mm, décimas de mm o menor),
se modifica por la solubilidad del material del que esta hecho el compartimento.

Se puede evitar el problema del paso óptico si se trabaja con el método del patrón interno,
siempre y cuando el patrón interno y el analito absorban a diferente longitud de onda, ya que en estas
condiciones:
Absanalito
1 analito
1 lCanalito analito
1 analito
 
AbsP.I.
2 P.I.
2 lCP.I. P.I.
2 CP.I.

Compartimentos de muestra para fase solida

Para las medidas de muestras sólidas o de líquidos viscosos, la EAM-IR presenta una
serie de posibilidades alternativas basadas en compartimentos de muestras que realizan las
medidas por reflexión, cuya diferencia entre ellos es el tipo de reflexión que miden, que a su
vez depende de las características de la muestra (reflexión especular, reflectancia difusa,…)

Sin embargo la alternativa instrumental más utilizada para muestras sólidas e incluso
líquidos viscosos es la “Reflectancia Total Atenuada” (ATR). Este dispositivo esta basado
en el fenómeno de la Reflexión Total. Así, cuando una radiación pasa de un medio de mayor
índice de refracción (n1) a otro de menor índice de refracción (n2), y lo hace incidiendo con
un ángulo superior a uno crítico (), en lugar de producirse un rayo reflejado y otro
refractado, la radiación se refleja por completo (Reflexión Total). Lo interesante es que antes
de reflejarse, la radiación invade ligeramente el segundo medio una distancia (d) que
dependen además de la  de la radiación y que viene dada por:

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  
d  0, 40 ( 6)
 k
n  
2

n1 2 Sin2   2  
  n1  

Es decir, la radiación se absorbe o atenúa por el segundo medio antes de reflejarse; este
efecto es lo que se denomina reflexión total atenuada que es la base de los dispositivos ATR
(Attenuated Total Reflection). Un dispositivo ATR es simplemente un cristal alargado de un
material de alto índice de refracción y con buena transmisión en la zona IR (ver figura
transparencia). La radiación se hace pasar a través de ese cristal (primer medio, n1), en el que
se transmite por reflexión total. La muestra (segundo medio, n2) se dispone en el exterior del
cristal de forma que cuando la radiación invada la muestra se produzca el proceso de
absorción. Durante el paso de la radiación el proceso de reflexión total se produce varias
veces, cuyo número (t) depende del ángulo de incidencia de la radiación. El paso óptico total
será 2td y viene a ser del orden de varias m a menos de 1 mm.

Análisis de alimentos

El número de aplicaciones del IR para el análisis de analitos en muestras concretas se

va ampliando gracias a las mejoras de la instrumentación. En la actualidad se pueden emplear
métodos oficiales de análisis de pesticidas basados en IR, así como determinaciones sobre
polímeros y otros tipos de muestras.

Sin embargo una de las más importantes es la determinación de distintos parámetros en

alimentos, en particular, análisis de lípidos totales, grado de insaturación de los lípidos,
carbohidratos, proteínas o agua, entre otros. El ejemplo más paradigmático del uso de la
EAM-IR en alimentos es la determinación de algunos parámetros en muestras de lácteos,
especialmente leche. Para llevar a cabo estas determinaciones hay diferentes opciones
comerciales, pero la más habitual en análisis de rutina se basa en emplear analizadores
específicamente diseñados para hacer el análisis directo sobre ellas. Las versiones más
sencillas de estos analizadores están basadas en instrumentos de filtros, medida continua y
óptica de SeZn. Estos instrumentos, son de enorme utilidad en este tipo de industria, dado que
permiten hacer medidas muy rápidas (en torno al minuto para cada muestra).

La gran ventaja de estos instrumentos es que puede hacer la determinación

directamente sobre las muestras (en el caso de que sean líquidas), pero a cambio presentan
una gran número de interferencias, tanto de tipo proporcional como aditivas. Las
interferencias de tipo proporcional se suele corregir utilizar como procedimiento de
calibración muestras del mismo tipo de leche que se va a analizar y para las que se tengan
contenidos certificados de los parámetros a cuantificar (lo cual encarece la determinación).
Las interferencias de tipo aditivo se corrigen por medidas a dos longitudes de onda y
corrección de las absorbancias (a la segunda no absorbe el analito).

También se puede llevar a cabo la medida de estos parámetros en otras muestras; por
ejemplo, se pueden determinar grasas y proteínas en carnes previo tratamiento con NaOH.

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