Determinación del efecto antioxidante sobre el radical ABTS

Inicialmente se debe realizar una curva estándar para determinar la concentración de los extractos

Materiales para curva estándar:

 0.0776 g de ABTS
 Agua destilada
 0.0132 g de persulfato de potasio
 Etanol
 Tubos de ensayo
 Espectrofotómetro
 5 mg de trolox
 Metanol al 80%

Procedimiento
1. Pesar 0.0776 g de ABTS, agregar 20 mL de agua agua destilada para disolver
perfectamente;
2. Pesar 0.0132 g de persulfato de potasio y añadirlos a la solución de ABTS hasta que se
disuelva perfectamente, cubrir la solución con aluminio y dejar reposar 16 h a
temperatura ambiente en la obscuridad.
3. Mezclar 21 mL de la solución ABTS con 19 mL de etanol absoluto, leer la absorbancia a 732
nm.
NOTA: La absorbancia resultante debe ser de 0.700 ± 0.02
Si la absorbancia es mayor a 0.702, agregar etanol, si es menor agregar ABTS
4. Pesar 5 mg de trolox y disolver con metal al 80%, aforar a 50 mL.
5. Etiquetar 11 tubos de ensayos para realizar las siguientes diluciones

Trolox mL Etanol absoluto Solución ABTS Absorbancia

50 0 1450
47.5 2.5 1450
45 5 1450
40 10 1450
37.5 12.5 1450
31.3 18.8 1450
25 25 1450
18.8 31.3 1450
12.5 37.5 1450
6.3 43.8 1450
1.3 48.8 1450

Una vez realizadas las diluciones, leer absorbancia a 732 nm

Procesamiento de muestras

1. Pesar 1 g de la muestra en tubos eppendorf , añadir 2 mL de agua destilada, agitar en

vortex y centrifugar por 10 min a 5000 rpm.
2. Tomar 50 mL de la muestra y colocarlo en un tubo de ensayo
3. Agragar 1450 mL de la solución ABTS (la misma que se usó en la curva), agitar con vortex e
incubar 30 min a temperatura ambiente en la obscuridad.
4. Leer a 732 nm calibrando con etanol.
5. Considerar un blanco con agua destilada.
Determinación de antioxidante por el método de FRAP

Reactivos y materiales

1. 100 mL de metanol 80 %
2. 100 mL Ácido clorhídrico 40 mM
3. 10 mL de Solución TPTZ 10 mM
Pesar 0.0312 g de reactivo 2,4,6, Tris (2 pyridyl) triazina y disolver con 10 mL de HCL 40mM y
aforar a 10 mL con HCL.
4. 5 mL de Solución FeCl3 20 mM
Disolver 0.162 g de FeCl3 en agua destilada y aforar a 50 mL (cubrir de la luz).
5. 200 mL Buffer de acetato 0.3 M pH 3.6
6. Solución estándar de Trolox 10 mL 400 mM
Pesar 5 mg de trolox disolver con 5 mL de metanol 80% y 5 mL de afua destilada.

Solución FRAP (se prepara al momento). Mezclar 2.5 mL de solución TPTZ con 2.5 mL de FeCl 3 y 25
mL de buffer de acetato y mantener a 37 °C.

Curva estándar

Trolox mL Metanol 80% mL Solución FRAP mL

400 -
300 100
240 160
180 220
120 280
100 300 3000
80 320
60 340
40 360
30 370
20 380

Agitar los tubos de ensayo en vortex e incubar a 37 °C por 30 min finalmente leer absorbancia a
593 nm, calibrar con metanol 80 %.

Procedimiento para muestras

Tomar 2 mL de la muestra y centrifucar a 5000 rpm por 10 min.

Tomar 100 mL de la muestra, colocar dentro de un tubo de ensayo, agregar 300 mL de agua
destilada y 3000 mL de solución FRAP.

Agitar con vortex e incubar en baño maría a 37 °C por 30 min cubiertos de la luz.

Calibrar espectrofotómetro a 593 nm con metanol al 80%

Determinación de la capacidad antioxidante por el método de DPPH

Reactivos y materiales

1. 3.943 mg de DPPH
2. Metanol al 80%

Preparar 20 mL de metanol a 80%

Preparar solución stock de DPPH, disolver 3.943 mg con 50 ml de metanol al 80% y aforar a 100 mL

Realizar 4 diluciones de la solución madre de DPPH y leer absorbancia a 517 nm

Solución DPPH mL Metanol 80%

20
15
Aforar a 25 mL
10
5

Procedimiento para muestras

Preparar la solución stock de DPPH (Puede ser la misma de la curva)

Hacer un barrido con diferentes concentraciones del extracto

Romar de cada muestra 50 mL y colocarlas en un tubo de ensayo

Añadir 1950 mL de solución DPPH a cada muestra, dar vortex y leer absorbancia a 517 nm cada 10
min durante 60 min