 Reactivos: Tienen un papel más amplio y general.

Se
utilizan para la preparación de muestras, como la
fijación y el tratamiento previo, con el objetivo de
preservar la estructura celular y preparar la muestra
para la observación microscópica.

 Colorantes: Se utilizan específicamente para resaltar

estructuras celulares y proporcionar contraste durante
la observación microscópica.

Función: Facilita la observación y la identificación de

estructuras celulares específicas de los hongos,
complementando el proceso de tinción.

Tinción de Gomori-Grocott:

1. Definición:

 Técnica de tinción utilizada en microbiología y

anatomía patológica.

2. Propósito:
  Sirve para identificar y visualizar hongos en
muestras biológicas bajo el microscopio.

3. Componentes Clave:

 Utiliza reactivos como la fucsina fenicada, nitrato

de plata al 5%, y metenamina al 3%.

Hongos en los que se Aplica:

 Se utiliza para identificar una amplia variedad de

hongos, incluyendo Aspergillus, Candida, y otros
patógenos micóticos.

4. Aplicaciones Clínicas:

 Fundamental en el diagnóstico de infecciones

fúngicas en tejidos y fluidos corporales.

ETANOL-FORMOL

La solución de Etanol-Formol una mezcla de

formaldehído al 40% y etanol absoluto. Esta solución se
utiliza específicamente en la técnica de tinción de PAS
(ácido periódico de Schiff).
Tinción de PAS:

 La técnica de PAS se emplea para resaltar

carbohidratos y glicoproteínas en muestras
biológicas.

 Permite visualizar estructuras ricas en glucógeno,

mucopolisacáridos y otras sustancias polisacarídicas.

Aplicaciones Clínicas:

 Utilizado en histopatología para estudiar tejidos y

células en patologías específicas.

La Solución de Giemsa

es una preparación que contiene Giemsa, glicerol y

alcohol metílico absoluto, y se utiliza para diversas
técnicas de tinción en microbiología y hematología. Aquí
tienes un resumen de la información proporcionada:

Composición:

 Giemsa: 1 g.

 Glicerol: 66 ml.
  Alcohol metílico absoluto: 66 ml.

Preparación:

1. Disolver el colorante Giemsa en glicerol.

2. Calentar la solución durante 1 hora a 60°C.

3. Después, agregar el alcohol metílico absoluto.

4. Filtrar la solución para obtener la Solución de

Giemsa.

Uso:

 Aplicada en diversas técnicas de tinción, siendo

especialmente conocida por su utilización en la
tinción de Giemsa, que se utiliza comúnmente en la
observación de células sanguíneas y en la
identificación de microorganismos en microbiología.

Aplicaciones Clínicas:

 Utilizada en hematología para teñir extensiones de

sangre periférica y en microbiología para la
identificación de patógenos.
Eritrosina

es una preparación que contiene eritrosina, alcohol etílico

y agua destilada. Se utiliza como colorante en
microcultivos. Aquí hay un resumen de la información
proporcionada:

Composición:

 Eritrosina: 1 g.

 Alcohol etílico: 1 ml.

 Agua destilada: 98 ml.

Preparación:

1. Disolver el colorante eritrosina en alcohol etílico.

2. Después, agregar el agua destilada.

Uso:

 Como colorante en microcultivos, indicando que se

utiliza para teñir y visualizar microorganismos en
medios de cultivo.
Solución de Cristal Violeta:

 Composición:

 Solución A: Cristal violeta 2 g, Alcohol etílico

(95%) 20 ml.

 Solución B: Oxalato de amonio 0.9 g, Agua

destilada 80 ml.

 Preparación:

1. Mezclar la solución A y B.

2. Dejar reposar por 24 horas.

3. Filtrar la solución.

 Uso:

 Colorante de Gram, empleado en la técnica de

tinción de Gram en microbiología.

Safranina:

 Composición:
  Solución A: Safranina 0.25 g, Alcohol etílico 100
ml.

 Solución B: 10 ml de solución A, Agua destilada

90 ml.

 Preparación:

 Mezclar solución A y solución B.

 Uso:

 Colorante de Gram, utilizado en la técnica de

tinción de Gram para visualizar bacterias y
distinguir entre grampositivas y gramnegativas.

1. Examen directo con cinta adhesiva o scotch:

o Esterilizar a la flama el asa micológica y dejar enfriar.

o Pegar al asa micológica un fragmento de cinta

adhesiva transparente

o Introducir el asa con la cinta en tubos y cajas de Petri,

o hasta tocar la colonia a investigar por la parte
adhesiva de la cinta.

o Desprender el fragmento de cinta adhesiva con la

ayuda de una aguja de disección, sobre un
portaobjetos con una gota de colorante (azul de
lactofenol o Lugol).

o Colocar una gota del mismo colorante sobre la cinta y

posteriormente poner un cubreobjetos.

o Si se quiere sellar la preparación, se coloca barniz de

uñas alrededor del cubreobjetos

1.MICORCULTIVO
2. Material necesario:
 Cajas de Petri estériles con dos portaobjetos

y un triángulo de vidrio.
 Medio de cultivo en caja de Petri

(Sabouraud, PZ o papa dextrosa agar).

3. Preparación del medio de cultivo:
 Fragmentar el medio en cuadros de

aproximadamente 1.5 × 1.5 cm.

 4. Colocación del medio en los portaobjetos:
 Colocar uno o dos fragmentos del medio

sobre uno de los portaobjetos.

5. Siembra del hongo:
 Sembrar el hongo en estudio en los cuatro

lados del medio de cultivo.

6. Cubrimiento con el segundo portaobjetos:
 Colocar el segundo portaobjetos sobre el

medio de cultivo.
7. Adición de agua glicerina estéril:
 Agregar de 10 a 15 ml de agua glicerina

estéril (5%) a la caja de Petri.

8. Sellado de la caja de Petri:
 Sellar la caja de Petri con cinta adhesiva.

9. Incubación:
 Incubar según los requerimientos del hongo

en estudio.
10. Realización de tinción especial:
 Posteriormente, realizar una tinción especial

específica para microcultiv

2. .

Proceso abreviado de la Tinción de Gomori-

Grocott:
1. Fijación:
 Metanol absoluto o calor.

2. Tratamiento con Ácido Crómico:

 Baño de ácido crómico (10 minutos).

3. Bisulfito de Sodio:
 Baño de bisulfito de sodio (1 minuto).

4. Metenamina-Nitrato de Plata:
 Solución hasta marrón claro (5-10 minutos).

5. Observación Microscópica:
 Humedecer y observar al microscopio.

6. Tratamiento Adicional:
 Continuar en la solución si es necesario.

7. Lavados:
 Agua caliente, tibia, fría y destilada.

8. Baños de Cloruro de Oro y Tiosulfato de

Sodio:
 Cloruro de oro (10s) y tiosulfato de sodio

(3min).
9. Aplicación de Verde Brillante:
 Cubrir con verde brillante (30s).

10. Lavados con Etanol y Xilol:

 Etanol (70%, 95%, absoluto) y xilol (2x).

11. Cubrimiento Final:

  Bálsamo de Canadá o resina con
cubreobjetos.
3. Tinción de Gram:

o Fijar el frotis directamente a la fl ama.

o Teñir con cristal violeta durante un minuto.

o Lavar ligeramente con agua destilada.

o Cubrir la preparación con Lugol durante un minuto.

o Lavar ligeramente con agua.

o Decolorar con alcohol-acetona.

o Teñir de contraste con safranina durante un minuto.

o Lavar ligeramente con agua y dejar secar.

CRIOCONSERVACIÓN a -70°C Y -196°C

La conservación de hongos entomopatógenos (HE)

implica métodos como liofilización y crioconservación.
Estos aseguran viabilidad y estabilidad genética. Se
aconseja usar al menos dos métodos de conservación. La
crioconservación, con nitrógeno líquido, es ideal para
cepas aptas. Para las no aptas, se sugiere liofilización o
métodos alternos. El proceso de congelación a
temperaturas criogénicas involucra desbalance osmótico.
La velocidad de congelación y crioprotectores como
glicerol son cruciales. La crioconservación se realiza en
crioviales con glicerol y requiere un proceso gradual de
congelación. Ventajas incluyen preservación a largo plazo
y flexibilidad de almacenamiento, pero hay desafíos en la
complejidad, equipamiento especializado y riesgos de
seguridad. (5).

1. . Propagación:
 Cultivar a 27°C hasta esporulación.

2. Preparación para Crioconservación:

 Preparar crioviales con glicerol al 10%.

3. Esterilización:
 Esterilizar crioviales y herramientas.

4. Corte y Colocación:
 Hacer cortes en el cultivo.
  Colocar bloques en crioviales.
5. Sumersión en Crioprotector:
 Sumergir bloques en crioprotector.

6. Sellado y Conservación:
 Sellar criotubos para -196°C.

7. Curado:
 Reposar el cultivo por 12 h a 4°C.

8. Proceso de Congelación:
 Congelación gradual a -20°C por 12 h.

 Luego, a -70°C para ultracongelación.

 Para nitrógeno líquido, sumergir después de

12 h a -70°C, con precauciones de seguridad.

1. Ventajas del Método de Crioconservación:

1. Preservación a Largo Plazo: Permite la conservación

a largo plazo de cepas de hongos entomopatógenos,
garantizando la estabilidad genética.

2. Estandarización del Procedimiento: La esterilización

y la recomendación de utilizar criotubos sellados
favorecen la estandarización y reproducibilidad (6).

3. Flexibilidad en Temperaturas de Almacenamiento:

Ofrece la opción de almacenamiento a diferentes
 temperaturas (-20°C, -70°C o -196°C) según
necesidades específicas (6).

Desventajas del Método de Crioconservación:

1. Complejidad del Proceso: La ejecución del

procedimiento detallado y las condiciones de asepsia
pueden aumentar la complejidad y duración.

2. Requiere Equipamiento Especializado: La necesidad

de nitrógeno líquido y materiales específicos puede
limitar la aplicabilidad en entornos con recursos
limitados (6).

3. Riesgos de Seguridad: La manipulación de nitrógeno

líquido implica riesgos de seguridad, exigiendo
precauciones y equipo de protección personal (6).

CONSERVACIÓN EN ACEITE MINERAL

Este método de conservación implica cubrir el cultivo de
hongos con aceite mineral para prevenir la evaporación
del agua y evitar cambios osmóticos perjudiciales. Limita
la presencia de oxígeno y permite la viabilidad de los
hongos por más de 25 años a 4°C. Se utiliza para hongos
que no toleran la liofilización, tienen baja esporulación o
cuando la ultracongelación no es viable. Consiste en
sembrar trozos de cultivos en tubos con agar, tapados con
aceite mineral estéril, utilizando agar de extracto de malta
con 0,2% de glucosa.

Método

1.- Utilizar viales de vidrio de 12 mL de 18 x 65 mm con

tapón de baquelita y agregar 3 mL de medio de cultivo,
esterilizar e inclinar en un ángulo aproximado de 45°

2.- Sembrar por estría el hongo. Incubar a 25°C, hasta

alcanzar esporulación.

3.- Esterilizar el aceite mineral (densidad a 25°C, 0.848

g/mL y viscosidad 83.5 SUS) a 120°C por 15 min.
Permitir que transcurran entre 24 a 48 h, y realizar una
segunda esterilización. Llevar el aceite al horno (180°C,
por una h), para eliminar la humedad retenida (9)

4.- En condiciones asépticas, cubrir los cultivos con 8 mL

de aceite mineral, utilizando puntas estériles de 10 mL. Se
debe corroborar que el nivel de aceite quede un centímetro
por encima del cultivo.

5.- Cerrar el vial de vidrio con el tapón de baquelita y

sellar con papel Parafilm (9).

6.- Etiquetar y almacenar en gradillas en posición vertical

a temperatura ambiente.

7.- Después de una semana de almacenamiento, es

necesario realizar una prueba de control de calidad del
material conservado (9).
Figura 1. Ventajas Y desventajas de la conservación en
aceite mineral, Recuperado de: (9)

CONSERVACIÓN EN SOLUCIONES DE SALES

En este método, los hongos se sumergen en soluciones

acuosas con sales para conservación. Las sales reducen la
actividad del agua, ralentizando los procesos biológicos y
manteniendo la viabilidad de los hongos. Se inicia con la
preparación de una solución de sales, utilizando sales
como sulfato de magnesio, fosfato de potasio y cloruro de
calcio. La concentración óptima se determina
experimentalmente, y los hongos se sumergen en esta
solución durante su fase de crecimiento activo.

Tipos de Sales y Consideraciones:

Sulfato de Magnesio:

 Ventajas: Contribuye a la estabilización de

membranas celulares debido a su efecto
osmótico.

 Desventajas: Puede afectar el equilibrio

nutricional debido a la presencia de magnesio
(10).

Fosfato de Potasio:

 Ventajas: Actúa como un tampón eficaz,

manteniendo un pH adecuado para la
preservación.

 Desventajas: Puede tener efectos sobre la

disponibilidad de fósforo (10).

Cloruro de Calcio:
  Ventajas: Ofrece una fuente adicional de calcio,
vital para la integridad celular.

 Desventajas: La concentración precisa debe ser

ajustada para evitar efectos negativos (10).

Ventajas del Método:

 Preservación a largo plazo: Permite mantener la

viabilidad de las cepas fúngicas a lo largo de períodos
extendidos.

 Estabilidad genética: Conserva la integridad

genética de los hongos, crucial para la
reproducibilidad experimental.

 Flexibilidad experimental: Permite ajustar la

composición de la solución de sales según las
necesidades específicas de la cepa fúngica bajo
estudio (11).

Desventajas del Método:

 Requisitos de almacenamiento: Puede necesitar
condiciones específicas de temperatura y humedad.

 Efecto de dilución: La inmersión en soluciones

acuosas puede diluir nutrientes, afectando el
crecimiento fúngico.

 Optimización requerida: La elección y

concentración de sales deben ser optimizadas para
cada especie de hongo, lo que puede ser un proceso
laborioso (11)