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Avances en la investigación biológica 4 (1): 10­13, 2010

ISSN 1992­0067 ©
Publicaciones IDOSI, 2010

Producción y Caracterización de Hongos Chitosan bajo

Condiciones de fermentación en estado sólido

11 2 3
Marikani Kannan, Maliga Nesakumari, K. Rajarathinam y AJA Ranjit Singh

1
PG Departamento de Microbiología, VHNSNCollege, Virudhunagar­626 001, India
2
Departamento de Investigación de Botánica, VHNSNCollege, Virudhunagar­626 001, India
3
Departamento de Zoología Avanzada y Biotecnología, Sri Paramakalyani College,
Alwarkurichi­ 627 412, India

Resumen: El quitosano se extrajo de biomasa de 15 días de Agaricus Sp, Pleurotus Sp y Ganoderma Sp.
Se sometió a diferentes tratamientos alcalinos y ácidos en el protocolo de extracción. Tanto en el tratamiento alcalino como ácido, la
temperatura, el período de incubación y la concentración de ácido o alcalino afectan significativamente la producción y la calidad del
quitosano producido (P<0,05). El tipo de ácido utilizado también fue importante en la producción de quitosano. El uso de ácido
clorhídrico en la extracción de quitosano dio un grado de desacetilación (DD) significativamente mayor en comparación con el ácido
acético. El empleo de ácido fuerte, alta concentración de ácido y alta temperatura produjo quitosano de color más oscuro, mientras
que los tratamientos más suaves dieron quitosano de color más claro.

Palabras clave: Chitosan Agaricus Sp Pleurotus Sp Ganoderma Sp y Grado de desacetilación

INTRODUCCIÓN La variabilidad y los altos costos de procesamiento asociados con la

conversión química de quitina en quitosano parecen tener La quitina
(poli­N­acetil glucosamina) es un ubicuo limitó la posible aceptación industrial
como undecomponente
este biopolímero
principal
de [3].
polímero
Variasque
fuentes
se presenta
alternativas
naturalmente
de
materias primas industriales en las estructuras esqueléticas o exoesqueléticas de animales inferiores. han sugerido quitina, incluidos los insectos,
la quitina antártica también está presente en la gran mayoría de los hongosprincipal
krill y diatomeas
polímeropor razones
fibrilar de lainherentemente
pared celular [1].similares
descritoaanteriormente,
las del
o debido a un cultivo no probado La forma desacetilada de quitina, quitosano
tiene
o técnicas
propiedades
de ingeniería,
únicas quesinhacen
avances
quesignificativos
se haya hecho (poliglucosamina),
en el
establecimiento de nuevas tecnologías útiles para una variedad de aplicaciones
escala
industriales,
de agente decomo
control
un líder
de viscosidad,
a la producción
adhesivo,
controlada
quitosano
a gran
para
fortalecer el papel. Los avances recientes en la tecnología de fermentación,que
agente
el cultivo
y auxiliar
a gran
de escala
floculación,
de unentre
organismo
otros, el
quequitosano
se ha utilizado
sugieren
recientemente en muchas áreas, por ejemplo, que contiene quitosano, podría
aditivos
ser una
alimentarios.
ruta atractiva
y producción
para los cosméticos,
de este polímero.
productos
Losfarmacéuticos,
informes
mostraron que esta agricultura. Su uso como componente de la pasta de dientes,
nutrientes
el organismo
simples [4]dey la
cremas
mano corporales,
se puede cultivar
champú,
fácilmente
suero reductor
en y
que el quitosano de la pared celular se puede extraer fácilmente, colesterol,nos
inmovilizador
han llevadodea células
estudiary la
enzimas,
producción
comoy aislamiento
un portadorde
dematerial
fármacos,
para la producción de lentes de contacto, o quitosano microbiano ocular como
permeabilidad,
alternativa acomo
los vendajes
productodederivado
moluscos,
cromatográfico.
agente de control
soporte,
de
compuestos antimicrobianos, cubiertas de semillas y A escala comercial, el exoesqueleto
quitosano se extrae
de las aguas
de los residuales
agentes floculantes
de los crustáceos
y quelantes
empleando
en el
tratamientos químicos agresivos [2]. La fuente industrial tradicional de los tratamientos de quitina.
con los desechos Sin embargo,
de mariscos este proceso
de camarones, de extracción,
cangrejos junto
y langostas,
con la variabilidad en el material de origen conduce a un procesamiento inconsistente [1]. Sin embargo, se produjeron problemas con las
características estacionales y fisicoquímicas del quitosano. suministro limitado, lugares de producción confinados, producto Estas características
hacen de los hongos un quitosano prometedor

Autor para correspondencia: Marikani Kannan, PG Department of Microbiology, VHNSNCollege, Virudhunagar­626 001, India Correo
electrónico: microkannan@gmail.com 10
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Avanzado Biol. Res., 4 (1): 10­13, 2010
fuente, ya que las propiedades físicas del quitosano extraíble de los
hongos se pueden manipular mediante la regulación de factores
como la composición del medio de crecimiento y los parámetros de
procesamiento en el protocolo de extracción [5].
El presente estudio estaba investigando el aumento de la
producción de quitosano fúngico a través del protocolo modificado
[6]. Además, este estudio se realizó para determinar los efectos del
tratamiento alcalino y ácido utilizado en la
protocolo de extracción hacia la calidad del quitosano en términos de
grado de desacetilación y color del quitosano producido.
MATERIAL Y MÉTODOS
Fuente de los Basidiomicetos Utilizados: Tres especies de hongos
Agaricus Sp, Pleurotus Sp y Ganoderma Sp. fueron utilizados en este
estudio. Los hongos fueron recolectados de diferentes áreas dentro
de los Ghats occidentales de
Gama Tirunelveli, Tamil Nadu, India. Estos basidiomicetos fueron
identificados por sus huellas de esporas y comparando sus
características morfológicas, anatómicas y fisiológicas con las
descripciones estándar [7]. Los basidiomicetos se usaron para
producir la semilla de grano por el método conveniente.
La semilla preparada se almacenó a 5°C hasta su uso para el cultivo.
Medios de cultivo y cultivo: Se utilizó aserrín de madera dura y paja
de arroz (1:1) para preparar los medios de cultivo de la siguiente
manera
Aserrín + 1% CaCo + 1% azúcar
Paja de arroz + 1% CaCo + 1% azúcar
Aserrín + paja de arroz + 1% CaCo + 1% azúcar
El contenido de humedad de los medios antes mencionados.
las fórmulas se ajustaron a aproximadamente 63 ­ 64%. Luego, cada
fórmula se envasó en bolsas de polipropileno (de 1 kg cada una) y se
esterilizaron en autoclave a 121°C durante 1 hora. Después de que
los medios esterilizados se enfriaron, las bolsas se inocularon con el
hongo de grano previamente preparado al 2% (p/p), y luego se
incubaron a 22 ­ 27 °C para el desarrollo del hongo (crecimiento del micelio).
Al final del tiempo de incubación (desovación), las bolsas se abrieron
y se sometieron a las condiciones de fructificación, es decir,
exposición a la luz dispersa, riego por aspersión diaria de agua,
buena ventilación, ajuste de la humedad relativa al 85­90% y
temperatura a 20­25° C. El cultivo se recogió después de 14 a 20
días desde el final del tiempo de incubación en flujos consecutivos a
intervalos de 15 a 20 días.
11
Extracción de quitosano: La biomasa fúngica obtenida se secó en un
liofilizador (Thermo Scientific) y se pesó.
La biomasa fúngica liofilizada se sometió luego al protocolo de
extracción de quitosano empleando el método estándar [3]. Este
protocolo de extracción incluye un tratamiento alcalino seguido de un
tratamiento ácido. En la optimización del protocolo de extracción, la
biomasa fúngica liofilizada se sometió a un tratamiento alcalino
modificado seguido del método de extracción con tratamiento ácido.
Mientras que en el tratamiento ácido, la biomasa fúngica se sometió
al tratamiento alcalino estándar antes del tratamiento ácido modificado
[4].
Tratamiento alcalino: Para el estudio de los efectos de la concentración
alcalina en la extracción de quitosano, se usaron soluciones de
hidróxido de sodio (NaOH) IM, 2M, 3M y 4M para tratar las muestras
a 121°C durante 15 minutos. Para el estudio del efecto de la
temperatura y el periodo de incubación se utilizaron tres temperaturas,
95°C, 110°C y 121°C y cinco periodos de incubación, 10, 15, 20, 25 y
30 minutos con NaOH 1M como solución de tratamiento. .
Tratamiento con ácido: se utilizaron tres ácidos diferentes, ácido
acético (AA) y ácido clorhídrico (HCl) como solución de extracción. El
tratamiento ácido se realizó a concentraciones de ácido del 2%, 6%
y 10%; período de incubación a las 3, 6 y 12 horas; temperatura a
60°C y 95°C. El tratamiento ácido se realizó utilizando un diseño
experimental lineal general.
Determinación del grado de desacetilación: El grado de desacetilación
se determinó mediante el método de espectrofotometría UV de
primera derivada (Simenzd) [5]. El grado de desacetilación de las
muestras de quitosano se determinó basándose en cálculos
porcentuales del contenido de glucosamina en las muestras.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Durante el cultivo de hongos, el aserrín del sustrato tuvo un
tiempo de incubación prolongado y difiere significativamente de la
composición del otro sustrato. Por otro lado, el aserrín + paja de arroz
tuvo el tiempo de ejecución de desove más corto y difiere
significativamente de las otras fórmulas de sustrato. En cuanto a la
segunda y tercera temporadas, el aserrín tiene la misma tendencia y
registró el desove más largo de otras fórmulas. Además, aserrín +
paja de arroz tuvieron la misma tendencia que la primera temporada.
y registró un tiempo de ejecución de desove significativamente corto en
comparación con otras fórmulas.
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Tabla 1: Efecto de la concentración de la solución de NaoH en el rendimiento de extracción de quitosano a una temperatura de 121°C

Tratamiento alcalino molaridad de NaoH agaricus sp Pleurotus sp Ganoderma sp

1M 0.608 0.597 0.628

2m 0.745 0.715 0.742

3M 1.428 1.488 1.448

4M 1.116 1.006 1.106

En el tratamiento alcalino, se observó que se extraían Tabla 2: Efecto de la temperatura y el período de incubación en el rendimiento de extracción

de quitosano con 1M NaoH

cantidades significativamente mayores (P<0,05) de quitosano con
el aumento del período de incubación y la temperatura. El mayor Quitosano (mg)

rendimiento de quitosano se obtuvo a una temperatura de ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­­­­­­­­

incubación de 121 °C y un período de incubación de 30 minutos Período de incubación (Min) 95°C 115°C 121°C

(19,7 % de quitosano/biomasa). La utilización de diferentes 10 0.701 0.635 0.654

concentraciones de NaOH (1M, 2M, 3M y 4M) no arrojó diferencias 15 0.725 0.781 0.817
significativas en el rendimiento de quitosano (Cuadro 1). 20 0.832 0.849 0.928

25 0.944 0.966 0.976

Se observó que el rendimiento de quitosano aumentó
significativamente con el aumento de la temperatura y el período
de incubación, especialmente durante los períodos de incubación
Tabla 3: Extracción de quitosano usando ácido acético a diferentes concentraciones
de 25 y 30 minutos. La producción de quitosano mostró diferencias
y temperatura
significativas incluso con pequeños incrementos de temperatura y
Ácido acético Tiempo de incubación Quitosano
período de incubación (P<0.05).
A 121°C, un aumento del período de incubación de 15 minutos a 3% 12 horas 0,641%

30 minutos produjo un aumento significativo (P<0,05) del rendimiento 5% 12 horas 0,782 %

de quitosano (41,29%). Una disminución de la temperatura a 95 °C 7% 12 horas 0,891 %

en el período de incubación estándar (15 minutos) mostró una

reducción del 35,37 % en el quitosano producido. Tabla 4: Extracción de quitosano usando Hcl a diferentes concentraciones y
Mientras tanto, el tratamiento alcalino a 115 °C y el período de
la temperatura
incubación de 15 minutos no produjeron diferencias significativas
ácido clorhídrico Tiempo de incubación Quitosano
en comparación con el tratamiento alcalino estándar (121 °C, 15
3% 12 horas 0,621 %
minutos). Fueron necesarias temperaturas más altas y períodos de
5% 12 horas 0,660 %
incubación más largos para permitir interacciones efectivas entre
7% 12 horas 0,825 %
el NaOH y los constituyentes.
de la pared celular fúngica, lo que permite extraer niveles más altos
de quitosano [8]. Un período de incubación más prolongado Tabla 5: Efecto de la concentración de solución de NaoH del grado de

también proporcionó un tiempo de reacción más prolongado para desacetilación de quitosano

que el NaOH actuara sobre la estructura de la quitina y el quitosano Tratamiento alcalino Molaridad de NaoH Grado de desacetilación

para separar el quitosano de otros polisacáridos de la pared celular 1M (tratamiento estándar) 0,82%

[7]. Por lo tanto, se puede concluir que aumentando el período de 2m 0,83%

incubación a 30 minutos y manteniendo la temperatura a 121 °C, 3M 0,87%
se produjeron altas cantidades de quitosano cuando se utilizó el 4M 0,89%
tratamiento alcalino (Cuadro 2).
Todos los tratamientos realizados a 121°C durante 15 minutos. El tratamiento con NaoH 1M es
En el tratamiento ácido, se observó que la utilización de ácido
considerado el método estándar
acético como solución de extracción produjo mayores cantidades
de quitosano en comparación con el ácido clorhídrico.
El mayor rendimiento de quitosano se obtuvo con ácido fórmico al Por ejemplo, en la utilización de ácido acético, se encontró

6 % en un período de incubación de 12 horas a 95 °C. Este estudio que solo el período de incubación desempeñó un papel significativo

también observó que el mismo período de incubación, temperatura en afectar la cantidad de quitosano extraíble (P<0.05) (Tabla 3).
y concentración de ácido produjeron diferentes efectos e Mientras que para el ácido clorhídrico, se encontró que la
interacciones cuando se usaron diferentes ácidos como concentración de ácido afecta significativamente la extracción de
la solución extractora. quitosano (P<0.01) (Tabla 4).

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Tabla 6: Grado de desacetilación del quitosano de hongo extraído con diferentes tratamientos ácidos
Concentración de ácido Periodo de incubación La temperatura Ácido acético Ácido clorhídrico
6% 6 horas 60°C 0,76% 0,86%

8% 6 horas 60°C 0,82% 0,88%

6% 12 horas 95°C 0,82% 0,87%

8% 12 horas 95°C 0,88% 0,89%

Grado de Desacetilación: El aumento de la concentración REFERENCIAS

alcalina en el tratamiento alcalino aumentó la
grado de desacetilación (DD) del quitosano extraído (Cuadro 5). 1. Jeuniaux, C., 1978. Distribución e importancia cuantitativa de
Esto está de acuerdo con el estudio anterior [7] que estableció la quitina en animales, pp: 5­10.
que el nivel o el grado de desacetilación está influenciado y En RAA Muzzarelli y ER Pariser (ed.), Actas de la Primera
controlado por la concentración alcalina, la temperatura, el Conferencia Internacional sobre Quitina/Chitosan. Informe
período de incubación, el tamaño de las partículas y la densidad. MIT Sea Grant MITSG 78­7, Índice no. 78­307­Dmb.
Las concentraciones alcalinas más altas pueden causar que la Instituto de Massachusetts de
hidrólisis alcalina ocurra a una velocidad más alta en la muestra, Tecnología, Cambridge.
lo que resulta en un mayor grado de desacetilación [9]. 2. Muzzarelli, RAA, 1977. Quitina. Pergamon Press, Nueva York.
La repetición de los tratamientos alcalinos estándar a las mismas
muestras hasta 3 veces también produjo quitosano con un DD 3. Ashford, NA, D. Hattis y AE Murray, 1977.
más alto en comparación con el quitosano extraído con el Perspectivas industriales de quitina y proteínas a partir de
tratamiento alcalino estándar (Tabla 5) [9]. desechos de mariscos. Programa Sea Grant del MIT. Reporte no.
También se determinó el grado de desacetilación (DD) del MITSG 77­3, Índice no. 77­703­Zle. Instituto de Tecnología
quitosano extraído por los diversos tratamientos ácidos (Tabla de Massachusetts, Cambridge.
6). La tendencia general observada fue 4. Miyoshi, H., K. Shimura, K. Watanabe y O. Kasuki, que la DD aumentó con el aumento de
la incubación 1992. Caracterización de algunos quitosanos fúngicos. temperatura, período de incubación y concentración de ácido.
Biosci. Biotecnología. Biochem., 56: 1901­5.
También se encontró que DD era significativamente mayor (P <0.01) 5. Di, Lena, Annibate cuando se utilizó
GRAMO.,
ANUNCIO ácido clorhídrico y
como extractor G. Giovannozzi­Sermanni, 1994. Influencia de la solución en(89%)
comparación
en condiciones
con el ácido
de edad
acético.
de crecimiento
El mayor DD
sobre la
quitina micelial se obtuvo con ácido clorhídrico al 8% y 12 horas de contenido
incubación
de Lentinus
a 95°C.
edodes.
Mientras
J. Basic
tanto,
Microbiol.,
el más bajo
periodo
DD 34:
de
11­6. (76,16%) se obtuvo con ácido fórmico al 6 % y 6 horas de incubacióncomparación
a 60°C. El ácido
con clorhídrico,
el ácido acético,
al serprovocó
un ácidouna
fuerte
mayor
en
hidrólisis hacia los restos acetilo, además de la hidrólisis dentro de la red demonómeros
7. Roberts,en
GAF,
el polímero
1992. Chitin
de quitosano
Chemistry.
[6].Londres:
Se encontró
que el DD era más alto para todos los ácidos a una concentración de 6. White,
ácido del SA,
8%. PR
En Farina e I. Fulton,
el tratamiento con 1979.
ácido, se observó que la
variación de los factores individuales (concentración de ácido, temperatura Producción y Aislamiento
y período de incubación)deno
Quitosano
parecía adar
partir de
resultados
mucorparticular
consistentes, mientras que la variación/manipulación de un factor de parámetro rouxii. Applied and Environmental
dio resultados mixtos. Sin Microbiol.,
embargo, el 38:
323­328. de la interacción entre los factores y también del
ANOVA de 3 vías realizado mostró que la tendencia de los valores de DD dependía
tipo de ácido utilizado (Tabla 6). La comparación de pares múltiples muestra que el DD de los quitosanos extraídos con ácido
clorhídrico fue significativamente diferente en comparación con el quitosanoMacmillan Press
extraído con Ltd.acético (P <0,05). No hubo diferencia
ácido
8. Win, (P>0.05)
significativa entre los valores de DD del quitosano extraído con ácido acético NN y WF (Cuadro
Stevens,6).
2001. La quitina de camarón como
sustrato para la quitina desacetilasa fúngica. Microbiología
Aplicada y Biotecnología., 57: 334­341.
9. Rinaudo, M. y A. Domard, 1989. Solution Properties of
Chitosan. En Quitina y Chitosan: Fuentes, Química,
Bioquímica, Propiedades Físicas y Aplicaciones.
Editado por
G. Skjak­Braek, T. Anthonsen y P. Sandford.
Londres: Elsevier Science Publisher, pp: 71­86.

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