UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

Facultad de Medicina
Departamento de Microbiología

PRÁCTICA DE LABORATORIO

DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSIS Y LEPRA

Martha Murcia Aranguren

Profesora Titular

INTRODUCCIÓN
La Familia Mycobacteriacea comprende en total cinco géneros:

• Género Mycobacterium, que es el género tipo, al cual pertenecen la mayoría de las

especies de crecimiento lento, incluyendo las especies patógenas y oportunistas para
los humanos y los animales.
• Género Mycolicibacter, que corresponde al grupo terrae, micobacterias de crecimiento
lento.
• Género Mycolicibacullus, que corresponde al grupo triviale, micobacterias de crecimiento
lento
• Género Mycobacteroides, que corresponde al grupo de crecedoras rápidas abscessus-
chelonae.
• Género Mycolicibacterium, que corresponde al grupo Fotuitum-vaccae, micobacterias de
crecimiento rápido.

La Familia Mycobacteriacea está constituida por bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR), que
se colorean con la tinción de Ziehl Neelsen (Fig 1.), aerobios estrictos, intracelulares
facultativos, rectos o ligeramente curvos, miden de 1- 10 µm de largo por 0.2 - 0.6 µm ancho,
inmóviles, no producen conidios, son catalasa positivo con pocas excepciones (como es el
caso de algunas cepas de M. tuberculosis con alta resistencia a isoniazida).

En general son bacterias de lento crecimiento (se desarrollan después de 7 días de

incubación). Su tiempo de generación (G) varía para las diferentes especies: en micobacterias
de crecimiento lento es de 12 a 24 horas, por lo cual las colonias en los medios de cultivo
sólidos aparecen varias semanas después de su siembra (3 a 8); el tiempo de generación de
las micobacterias de crecimiento rápido es de 3 horas, visualizándose colonias antes de 7 días;

1
mientras que el tiempo de generación de M. leprae es de 14 días, en modelos in-vivo.

La tuberculosis (TB) constiutuye un problema grave de salud pública a nivel mundial. La

Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que en el año 2019 se presentaron
10.000.000 de casos nuevos de TB en el mundo para una incidencia de 130 casos / 100.000
habitantes, comparado con los casos estimados para el año 2020 9,9 millones de casos
nuevos para una incidencia mundial en este año de 127 casos / 100.000 habitantes. Ambas
cifras muestran descensos al compararlos con las cifras del 2019 (1,9% para la tasa de
incidencia y 0,87% para el número absoluto de casos). De los casos nuevos de TB estimados
en 2020, 8% correspondió a individuos infectados por el VIH. Las regiones del mundo que
presentaron el mayor número de casos de TB en 2 0 2 0 fueron: Asia sur oriental (43%) y
África (25%); las islas del pacifico occidental (18%), mientras que la región mediterránea
oriental aportó el 8,3% de los casos, y las regiones de Europa y Américas representaron cada
una 2,3% y 3% respectivamente. El número estimado de muertes debidas a TB para el
año 2020 fue 1,3 millones en individuos VIH negativos, frente a 1,2 millones en el año 2019 y
214.000 muertes en VIH positivos, frente a 209.000 muertes en 2019.

La pandemia de COVID-19 ha revertido los años de progreso en el manejo de la TB en el mundo,

así como ha reducido la carga de la enfermedad; el mayor impacto se observa en la disminución
de casos notificados de 7,1 millones en 2019 a 5,8 millones en 2020 y una disminución del 18 %
comparado con el año 2012. El acceso reducido al diagnóstico y tratamiento de la TB durante la
pandemia, se traducen en el aumento de las muertes por TB. Las disminuciones en la incidencia
de TB logradas en años anteriores, se han lentificado casi hasta detenerse. Se prevé que estos
impactos sean peores en los años 2021 y 2022 (WHO TB Report 2021
https://www.who.int/publications/i/item/9789240037021).

En 2020, se prevé que la TB se ubique como la segunda causa principal de muerte por un
solo agente infeccioso, después de COVID-19 y se encuentra entre las 13 primeras causas de
muerte en el mundo.

La OMS utiliza cinco categorías para clasificar los casos de tuberculosis resistente a los
medicamentos: (i) TB resistente a isoniazida; (ii) TB resistente a Rifampicina (TB-RR); (iii) TB-
MDR, resistente a Isoniazida y Rifampicina; (iv) TB- pre-XDR, resistente a Rifampicina y a una
fluoroquinolona (moxifloxacina, levofloxacina) y (v) TB extensiva o extremadamente resistente
(TB-XDR), resistente a rifampicina, a una fluoroquinolona, y a bedaquilina o linezolid o a los dos.
Tanto la TB-RR como la TB-MDR, requieren tratamiento de segunda línea.
A nivel mundial en 2020, el 71 % (2,1/3,0 millones) de las personas diagnosticadas con TB
pulmonar confirmada bacteriológicamente, se sometieron a pruebas de resistencia a la
rifampicina, frente al 61 % (2,2/3,6 millones) en 2019 y al 50 % (1,7/3,4 millones) en 2018. Entre
estos, se detectaron 132.222 casos de TB-MDR/RR y 25.681 casos de TB pre-XDR o TB-XDR, para
un total combinado de 157.903, comparado con 201.997 personas detectadas con TB
farmacorresistente en 2019, registrando una disminución del 22 %.

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Las causas principales de la aparición de TB farmacorresistente son: (i) la administración
de tratamientos erróneamente prescritos; (ii) la falta de supervisión terapéutica; (iii) el uso
de fármacos de mala calidad y (iv) la falta de adherencia del paciente al tratamiento. La
farmacorresistencia surge principalmente en zonas donde los programas de lucha
antituberculosa son deficientes.

Según el Instituto Nacional de Salud, en el año 2020 en Colombia se notificaron 11.529 casos
de TB, de los cuales 10.755 eran nuevos para una incidencia nacional de 21,35 casos /100.000
habitantes, comparado con el año 2019 en el que se notificaron 14.902 casos de TB y la
incidencia fue de 27,69 casos /100.000 habitantes. En 2020 El grupo poblacional de los
trabajadores de la salud aportó el 2,0 % de los casos del país, se registraron 235 casos, siendo el
sexo mujer el más afectado con 66,4 % de los casos.

En el mismo año 2020 se notificaron al sistema de vigilancia (Sivigila) 175 casos nuevos
farmacorresistente (todas las formas), que corresponden a una tasa de incidencia de 0,3 casos
por 100 000 habitantes, siendo el Archipiélago de San Andrés, Providencia y Santa Catalina el de
mayor incidencia.

En nuestro país en el año 2021 se notificaron 14.470 casos de TB (todas las formas), de los
cuales 13.542 fueron casos nuevos para una incidencia nacional de 26,53 casos/ 100.000
habitantes. De acuerdo a las comorbilidades para tuberculosis sensible se presentó con mayor
frecuencia: la desnutrición (15,3 %), coinfección TB-VIH (12,1 %) y diabetes (9,7 %). Este año
se notificaron 351 casos farmacorresistentes, con una incidencia de 0.47/100.000 habitantes,
pcon predominio de la monorresistencia con 36.75 % (129), seguido de resistencia a rifampicina
con 35.33% (124) y en tercer lugar MDR con 26.49% (93).

DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSIS

DIAGNÓSTICO FENOTÍPICO

El diagnóstico de tuberculosis depende de la demostración del organismo causante en

secreciones o tejidos de individuos enfermos. Sin embargo, existen limitaciones para su
detección.

M. tuberculosis, está presente en un número relativamente grande en pacientes con

tuberculosis pulmonar avanzada, en quienes los bacilos se detectan fácilmente a partir de
muestras de esputo espontáneo. No obstante, en pacientes infectados por el VIH, así como en
niños y en los casos de tuberculosis extrapulmonar, las muestras son paucibacilares, por lo
que el diagnóstico es difícil.

Dentro de las pruebas fenotípicas tenemos la baciloscopia seriada y el cultivo en medió

líquido (MGIT) y medio sólido (Lowenstein Jensen).

En Colombia la resolución que da los lineamientos para el manejo de la TB es la 227 de

Febrero 20 de 2020 del Ministerio de Salud y Protección Social.

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BACILOSCOPIA

Mediante el examen directo "Baciloscopia" se puede realizar el

diagnóstico de la TB pulmonar, con una especificidad cercana al 100% y con una
sensibilidad que puede oscilar entre el 20% - 80%, dependiendo de la prevalencia de
la tuberculosis en la región en donde se realiza el método.

En la baciloscopia de esputo, la muestra debe recogerse en la mañana al despertarse

el paciente, ya que durante la noche se acumula gran cantidad de secreción bronquial
en el aparato respiratorio la cual sale con facilidad al empezar a toser el enfermo. La
muestra debe provenir del sitio de la lesión, es decir del interior de los pulmones, por
lo que no debe ser ni secreción nasofaríngea, ni saliva. Esta muestra debe ser
recolectada en un recipiente desechable de boca ancha, preferiblemente transparente.
Si es difícil recoger las muestras de esputo diariamente durante los 3 días, se debe
recoger la primera muestra en el momento de la consulta, la segunda muestra al
despertarse el segundo día y la tercera cuando el paciente entrega la segunda muestra.

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COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN (ZN)

La coloración de Ziehl Neelsen, se basa en la utilización de un colorante básico

(fucsina), el cual se mezcla con el mordiente (fenol), dando lugar a la fucsina fenicada,
con la cual se cubre la preparación, siendo sometida a calentamiento, hasta la emisión
de vapores durante 5 minutos y, a la decoloración por el alcohol ácido. Como colorante
de contraste se utiliza el azul de metileno.

La ácido-alcohol resistencia (AAR) de los microorganismos está dada por su

capacidad para formar complejos ácido-estables con los colorantes aril-metánicos
como la fucsina.

Una vez formados estos complejos, no pueden ser decolorados con el alcohol ácido o
con ácidos minerales. Los colorantes usados son compuestos aniónicos en soluciones
fenoladas, los BAAR se verán rojos si se utiliza fucsina, violeta púrpura si se utiliza
cristal violeta y amarillo verdoso cuando se utiliza la coloración fluorescente de
auramina O.

En el proceso de tinción, la fucsina penetra hasta el citoplasma formando complejos

rRNA-colorante, e interactúa químicamente con los ácidos micólicos presentes en la
pared de las micobacterias formando complejos ácido micólico-colorante, los cuales
impermeabilizan la pared e impiden la salida de la fucsina atrapada en dichos
complejos en el citoplasma micobacteriano. Cuando se remueve la pared externa de
las micobacterias con alcohol alcalino se perderá su ácido alcohol resistencia.

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La lectura de los cultivos en medios sólidos se hace de la siguiente manera:

Lectura de los cultivos en medios sólidos Cultivo de Mycobacterium tuberculosis

en medio OK

Lectura Interpretación
(-) No se observan colonias
No. de colonias 1 a 20 colonias
(+) 20 – 100 colonias
(++) Más de 100 colonias separadas
(+++) Colonias confluentes
Contaminado Desarrollo de microorganismos no AAR

Cultivo en Medio líquido MGIT

El medio líquido más utilizado en la actualidad es el MGIT, que se incuba y lee en el medio
semiautomatizado BACTEC MGIT 960 o 320.

La siguiente es la composición del medio MGIT: Middlebrook 7H9 modificado; OADC (ácido
oleico, albúmina, dextrosa y catalasa); PANTA (polimixina B, anfotericina B, ácido nalidíxico,
Trimetoprim, azlocilina); Indicador de crecimiento (compuesto fluorescente embebido en
silicona.

La sensibilidad y especificidad del cultivo en medio MGIT es de 90 -96% y 90%, respectivamente.

Si no se dispone de los equipos Bactec MGIT 960 o 320, los tubos se pueden incubar a 37°C, y
se pueden observar manualmente bajo luz ultravioleta.

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Diagnóstico Molecular de Tuberculosis

La OMS recomienda utilizar una prueba molecular como prueba diagnóstica inicial para
detección de CMTB y resistencia por lo menos a R, con el fin de evitar retrasos en el inicio del
tratamiento. Estas pruebas deben reemplazar o complementar las pruebas convencionales por
ser más sensibles.

Las pruebas rápidas aprobadas por la OMS para el diagnóstico de TB y TB-DR son las
siguientes.

Hay diferentes plataformas comerciales que realizan el diagnóstico de Complejo

Mycobacterium tuberculosis (CMT) y simultáneamente detectan resistencia a
Rifampicina, Isoniazida, etc.

El límite de detección de las pruebas moleculares es el siguiente:

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Prueba in-house
PCR-IS6110

Esta prueba se basa en la amplificación de ADN mediante PCR.

El ADN micobacteriano es amplificado utilizando iniciadores
específicos de la secuencia de inserción IS6110, que pertenece a
la familia IS3 de secuencias de inserción. Tiene un tamaño de
1355 pb, está presente exclusivamente en miembros del
complejo M. tuberculosis. Suele estar repetida de 4 a 20 veces
por genoma.

MP: marcador de peso molecular;

1: control positive; 2: control
inhibidores; 3: muestra; 4: control
negativo

Prueba in-house
PRA (PCR restriction analysis)
Es un método sencillo y rápido, descrito por Telenti y col, que permite diferenciar micobacterias
a nivel de especie. Se basa en la evaluación por PCR del gen hsp65 que codifica para una proteína
de shock térmico de 65 KD. El método involucra el análisis con enzimas de restricción, de los

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productos de PCR obtenidos empleando iniciadores comunes para todas las micobacterias. Se
utilizan dos enzimas de restricción BstEII (diana G↓GTCACC) y HaeIII (diana GG↓CC). La proteína
de 65 kD, contiene epítopos que son únicos, así como epítopos que son comunes a varias
especies de micobacterias. El gen hsp65, es un gen conservado en bacterias y se encuentra una
copia por genoma. Este método es uno de los más ampliamente utilizados en la identificación
de especies de micobacterias.

En esta PCR se va a amplificar un fragmento de DNA de más o menos 441 pb, perteneciente
al gen hsp65 que codifica para una proteína de shock térmico, el cual está presente en todas
las micobacterias y para el cual se utilizan los primers Tb 11 y Tb 12

PCR gen hsp65

PRA Complejo M. tuberculosis

qPCR – IS6110

El kit MTB REAL-TM permite la detección del complejo Mycobacterium tuberculosis a partir de
cualquier muestra, mediante la determinación de la secuencia de inserción IS6110, utiliza sondas

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Tagman marcadas con dos fluorocromos (FAM/JOE) que aumentan la especificidad de esta
determinación, además maneja un control interno para todas las muestras.

PCR en tiempo real. Muestra negativa

Ciclo
Sonda marcada con FAM
(verde): Detecta la
intensidad de la
fluorescencia producida por
una muestra positiva para M.
tuberculosis.

Sonda marcada con JOE

(Amarillo): Control interno,
(IS6110 modificada y clona-
do en el bacteriófago λ).

Muestra 36. Cuando FAM

es negativo (-), y JOE es≤ a
38 Ct, es un resultado válido,
negativo para complejo M.
tuberculosis.

PCR en tiempo real. Control positivo

Sonda FAM (verde): Detecta
la intensidad de la
fluorescencia producida por
una muestra positiva para
M. tuberculosis.

Sonda JOE (Amarillo):

Control interno (fragmento
de inserción IS6110
modificado y clonado en el
bacteriófago λ).

MUESTRA 15. Cuando FAM

es ≤ 38 Ct y JOE≤ / > 38 Ct es
un resultado positivo para
complejo M. tuberculosis.

DIAGNOSTICO DE LA TUBERCULOSIS EN NIÑOS

Como los niños menores de 5 años no tienen capacidad de expectorar y además son
paucibacilares, el diagnóstico de la tuberculosis pediátrica es difícil. La muestra de elección
es el aspirado gástrico en número de 3, muestra que reemplaza al esputo. La confirmación
bacteriológica en los mejores casos llega a un 60% o 70%, quedando un 30% o un 40% sin
confirmar. Cuando la bacteriología es negativa se deben tener en cuenta para el diagnóstico
4 criterios:

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1. Criterio epidemiológico: antecedentes de contacto con pacientes tuberculosos
2. Criterio clínico: presencia de un cuadro compatible con la enfermedad
3. Criterio tuberculínico: hallazgo de una prueba de tuberculina positiva PPD>10mm
4. Criterio radiológico: anormalidades en la radiografía de tórax, descartadas otras causas
de dichas anormalidades.

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSIS FARMACORRESISTENTE

La resistencia es un fenómeno biológico dado por la presencia de mutaciones o por
selección, lo que le permite al microorganismo escapar de la acción de los medicamentos,
sobrevivir y multiplicarse. La resistencia puede ser de 3 tipos:
• Resistencia Natural: Se presenta en cepas wild type (silvestres) que son
naturalmente resistentes a una droga, sin haber estado nunca en contacto con ella.
• Resistencia Primaria: se presenta en pacientes que no han recibido nunca terapia
antituberculosa, pero que se han infectado con una cepa proveniente de un
paciente que ha adquirido resistencia.
• Resistencia Adquirida: este tipo de resistencia es el producto de la selección de
mutantes resistentes producidas por el medicamento como consecuencia de la
aplicación de una terapia inadecuada, ocasionada por tratamientos erróneos o por falta
de adherencia del paciente al tratamiento.

MÉTODO FENOTÍPICO

Método Bactec MGIT 960 ® SIRE

El método permite evaluar los fármacos de primera línea (estreptomicina, isoniazida,

rifampicina y etambutol) mediante el kit SIRE y de segunda línea (kanamicina, amikacina,
capreomicina y ofloxacina). No existe aún un kit comercial que tenga estos fármacos, lo que
hace que sea necesaria la preparación de soluciones madre y de trabajo; los otros fármacos
no deben ser evaluados por esta prueba debido que los valores de sensibilidad y
especificidad son bajos, razón por la cual solo se evalúan en medio sólido.

Se siembran dos tubos MGIT con el cultivo a estudiar y a uno de ellos se le adiciona una
concentración conocida del fármaco a probar y el crecimiento en este tubo es comparado
con el crecimiento del tubo sin fármaco (control de crecimiento). Si el cultivo es sensible al
fármaco la bacteria no crece y no hay detección de fluorescencia por el equipo, mientras que
en el tubo sin fármaco si debe haber crecimiento reflejado en la fluorescencia detectada. Si
la bacteria es resistente al fármaco los dos tubos deben presentar crecimiento y producir
fluorescencia, que será detectada por el equipo automáticamente.

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 Concentraciones de Fármacos
Concentració Alta Concentración Alta
Farmaco n Crítica concentració Farmaco Crítica concentració
n n
Estreptomicina 1µg/ml 4µg/ml Kanamicina 2.5µg/ml No Aplica
Isoniazida 0.1µg/ml 0.4µg/ml Amikacina 1µg/ml No Aplica
Rifampicina 1µg/ml No Aplica Capreomicin 2.5µg/ml No Aplica
a
Etambutol 5µg/ml 7.5µg/ml Ofloxacina 2µg/ml No Aplica
Pirazinamida 100µg/ml No Aplica

El tiempo de obtención de resultados varía dependiendo de si el aislado es sensible o

resistente, si es sensible oscila entre 7 - 14 días. Cuando es resistente se debe realizar la
confirmación de este hallazgo empleando las concentraciones altas sugeridas por la casa
comercial, lo que hace que la prueba tarde más de 28 días.

La interpretación de los resultados para fármacos de primera línea se hace utilizando el

software Epicenter® que está alineado al sistema, o con el software Tb Exist® que permite
interpretar los resultados a fármacos de primera y segunda línea.

MÉTODOS GENOTÍPICOS

Estos métodos permiten disminuir el tiempo de diagnóstico, en especial para

farmacorresitencia, pasando de semanas en los métodos convencionales, a prácticamente
horas. Requieren 100 bacilos para lograr un resultado y su importancia actualmente radica
en lograr un acceso a métodos de forma oportuna, de manera que cortan la cadena de
transmisión, en especial cuando hay resistencia. Sus limitaciones hacen que los resultados
obtenidos requieran siempre una confirmación empleando métodos de referencia.

Se basan en la extracción de ADN y amplificación por PCR de blancos conocidos (genes),

con el propósito de detectar en ellos mutaciones específicas que confieren resistencia a
diferentes fármacos.

GeneXpert MTB/RIF Sistema GenXpert Cepheid

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 Flujo de trabajo en el GeneXpert

Es un sistema comercial cerrado de la casa Cepheid, basado en PCR en tiempo real, que
permite determinar la presencia de miembros del Complejo M. tuberculosis, así como la
resistencia a Rifampicina a partir de muestras directas de esputo o cultivos positivos.

Esta técnica identifica las mutaciones más frecuentes presentes en el gen rpoB que confieren
resistencia a Rifampicina, hallazgo considerado como importante marcador de TB-MDR.

La ventaja de esta prueba es el corto tiempo en el que se obtiene el resultado: 2 - 3 horas.

Ya se encuentra disponible en el mercado la versión GeneXpert MTB/RIF ultra, que es más
sensible tanto para la detección de Complejo tuberculosis como para el diagnóstico de
Resistencia a rifampicina.

El GeneXpert MTB/RIF ultra:

• Utiliza Dos blancos para Dx TB (IS6110 y IS1081).
• Aumento del tamaño de la cámara de reacción (50 ul).
• Nested PCR (enzimas mejoradas), rapidez.
• Límite de detección CMTB 11,8 ufc/ml, RR: 105,4 UFC.
• Para mejorar la detección de resistencia a R, incorpora To de melting (4 sondas
identifican las mutaciones que confieren resistencia a R).
• Resultados escala semicuantitativa (alto, medio, bajo, muy bajo y “trazas”, para
mejorar Sensibilidad).
• Detección resistencia a R: S: 94%; E: 99% comparado con Prueba de susceptibilidad
fenotípica.
• La resistencia NO se debe interpretar si el resultado es trazas.

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Método GenoType® MTBDRplus (Ensayo de Prueba en Línea)

GenoType® MTBDRplus es un método comercial basado en la hibridación reversa de productos

de PCR biotinilados complementarios de sondas de oligonucleotidos específicos inmovilizadas
en una membrana en forma de tira, correspondientes a las mutaciones más frecuentes que
confieren resistencia a rifampicina e isoniazida. Esta prueba permite además confirmar la
presencia del complejo Mycobacterium tuberculosis (CMT) en la muestra examinada o a partir
de cultivos. El resultado de esta prueba tarda 6 horas.

Las tiras de ensayo contienen 6 controles: el control de conjugado (CC), control de amplificación
(AC), el control de tuberculosis (TUB) representa la región del gen rARN 23s presente en todos
los miembros del Complejo M. tuberculosis y el control de las zonas de los loci rpoB, katG e inhA.
Todas deben estar presentes para la validación del resultado. El CC indica la eficiencia del
conjugado para unirse al substrato, la banda CA indica amplificación de la reacción y ausencia
de inhibidores de la muestra, la banda TUB confirma la presencia de complejo Mycobacterium
tuberculosis. Mientras que las bandas correspondientes a los loci rpoB, katG e inhA permiten
conocer si se amplificaron dichas regiones y deben aparecer cuando la banda “TUB” está
presente. Para estudiar el aislado la tira consta de 21 sondas adicionales.

Para detectar resistencia a Rifampicina se dispone de 8 sondas tipo silvestre (WT)

correspondientes a la región del gen rpoB que codifica para los aminoácidos 505 a 534 (WT1 a
WT8) y 4 sondas específicas de las mutaciones más frecuentes que confieren resistencia a
rifampicina MUT1, MUT2, MUT3 Y MUT4 (D516V, H526Y, H526D, y S531L, respectivamente).

Respecto a la resistencia a isoniazida, la prueba comprende las mutaciones más frecuentes

ocurridas en los genes katG e inhA, que confieren resistencia a este fármaco. En el caso del gen
katG, están presentes 3 sondas, una WT y dos que corresponden a las mutaciones MUT1 (AGC
por ACC: S315T1) y MUT2 (AGC por ACA: S315T2). Mientras que para el gen inhA, están
presentes 6 sondas, 2 WT, 2 corresponden a la región promotora del gen inhA (-8, -15 y - 16), dos
sondas corresponden a inhA WT1 (-15 y -16) y WT2 (-8). Otras 4 detectan mutaciones de C15T
(MUT1), A16G (MUT2), T8C (MUT3A) y T8A (MUT3B).

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 Tira Genotype

Mutaciones en el gen rpoB y su correspondiente sonda Wild Type y bandas de mutación

Bandas wild type Codones analizados Desarrollo bandas de mutación Mutaciones

rpoB WT1 505 - 509 F505L
T508A
S509T
rpoB WT2 510 - 513 L511P*
rpoB WT2/WT3 510 - 517 Q513L*
Q513P
del 514-516
rpoB WT3/WT4 513 - 519 rpoB MUT1 D516V
D516Y
del 515
rpoB WT4/WT5 516 - 522 rpoB MUT1 del518*
N5181
rpoB WT5/WT6 518-525 S522L
S522Q
rpoB WT7 526-529 rpoB MUT2A H526Y¡
rpoB MUT2B H526D
H526R
H526P*
H526Q*
H526N
H526L
H526S
H526C
rpoB WT8 530-533 rpoB MUT3 S531L
S531Q*
S531W
L533P
F: Fenilalanina; L: Leucina; T: Treonina; A: Alanina; S: Serina; P: Prolina; Q: Glutamina; D: Ácido aspártico; V: Valina;
Y: Tirosina; H: Histidina ; N: Asparagina; C: Cisteina; W: Triptofano

Mutaciones en el gen katG y su correspondiente Wild Type y bandas de mutación

Bandas wild Codón Desarrollo bandas de Mutaciones

type analizado mutación
katG WT 315 katG MUT1 S315T1
katG MUT2 S315T2

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 Mutaciones en la región promotora del gen inhA y su correspondiente WT y bandas de mutación

Bandas wild Posición del ácido nucleico Desarrollo bandas de Mutaciones

type analizado mutación
inhA WT1 –15 inhA MUT1 C15T
–16 inhA MUT2 A16G
inhA WT2 –8 inhA MUT3A T8C
inhA MUT3B T8A

DIAGNÓSTICO DE LEPRA

La Organización Mundial de la Salud (OMS), en 1.980, en su Guía para la lucha antileprosa

expresó:

“Si hay un diagnóstico que no pueda formularse sin tener la absoluta certeza, es el de la lepra. Si
existe la más mínima duda en el diagnóstico, el enfermo debe mantenerse en observación hasta
que nuevos datos confirmen la enfermedad. Esto evitará el daño sicológico, social y de otro tipo
que podría causársele innecesariamente en caso de diagnóstico equivocado”

EXAMEN CLÍNICO

El diagnóstico de la lepra se basa la historia clínica y en el examen clínico detallado y completo,

en el cual debe observarse las características de las lesiones dérmicas, su distribución o simetría
y las alteraciones neurológicas, ya que se pierde primero la sensibilidad térmica y dolorosa, luego
la táctil.

La Baciloscopia para lepra se utiliza para la clasificación bacteriológica de los pacientes con
lepra en: paucibacilares (índice bacilar igual a 0) y multibacilares (índice bacilar mayor a 0).
En la Baciloscopia para lepra se deben tomar 6 muestras: linfa de oreja derecha, linfa de
oreja izquierda, linfa de 2 lesiones si existen o linfa de codos, rodillas o falange proximal del
tercer dedo de la mano tanto derecha como izquierda. Las 6 muestras tomadas se colocan
en la misma lámina, se hacen las 6 baciloscopias y se saca el Índice Bacilar (I.B.). Para ello
se informa el resultado de cada una de las 6 baciloscopias realizadas, anotando el número
de cruces de cada sitio para poder obtener este índice, el cual es igual a la suma de las
cruces dividido por el número de sitios tomados. Cuando se toman 6 muestras, este índice
puede oscilar entre 0.16 y 3 para los multibacilares y para los paucibacilares será 0.

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 Figura 2. Baciloscopia para Lepra. Lectura: se emplea la misma escala utilizada en la baciloscopia para
tuberculosis, leyendo cada una de las 6 baciloscopias.

CÁLCULO DEL ÍNDICE BACILAR

El índice bacilar es el promedio de las cruces encontradas en cada una de las baciloscopias
de las muestras leídas.

Muestra Resultado baciloscopia

Linfa de lóbulo izquierdo +++
Linfa de lóbulo derecho ++
Linfa codo izquierdo +
Linfa codo derecho +
Linfa lesión I +
Linfa lesión II 0

IB= 3 + 2 + 1 + 1 + 1 + 0 = 1.3
6

En pacientes multibacilares el IB oscila de 0.2 a 3, cuando se utilizan 6 muestras. En los

pacientes paucibacilares el IB será igual a 0.

En la orden médica, el médico debe marcar de qué lesiones quiere que el laboratorio tome
las muestras:

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IMPORTANCIA CLÍNICA

La baciloscopia de esputo detecta los enfermos de tuberculosis pulmonar los cuales se deben
buscar entre todos los sintomáticos respiratorios (SR), definidos como aquellos pacientes que
presentan sintomatología respiratoria con tos y expectoración de más de 15 días de evolución,
a quienes se les debe practicar baciloscopia seriada de esputo (3 muestras de esputo).

Este procedimiento de laboratorio tiene importancia diagnóstica, ya que es el examen esencial e

insustituible para la detección de tuberculosis pulmonar; y también tiene importancia
epidemiológica ya que detecta los pacientes bacilíferos que representan riesgo para la
comunidad. Además, tiene importancia en el control del tratamiento, permitiendo seguir el curso
de la enfermedad mediante una baciloscopia control mensual y en la evaluación del programa
control de tuberculosis en cada una de las regiones del país. Sin embargo, como se mencionó
anteriormente, debe sustituirse por su baja sensibilidad por una prueba molecular que además
de confirmar la presencia de Complejo Mycobacterium tuberculosis, detecte al menos resistencia
a Rifampicina.

La Baciloscopia para lepra se utiliza para la clasificación bacteriológica de los pacientes con
lepra en: paucibacilares (índice bacilar igual a 0) y multibacilares (índice bacilar mayor a 0). Este
dato junto con la clínica y la histopatología permitirá ubicar a los enfermos en los grupos de:
lepra indeterminada, lepra tuberculoide, lepra dimorfa o lepra lepromatosa; y a su vez definirá el
control del tratamiento a administrar. Desde el punto de vista epidemiológico permite conocer si
aumentan o disminuyen las fuentes de infección, previniendo la aparición de nuevas fuentes
como son las evoluciones de formas indeterminadas a formas lepromatosas. En lo que respecta

18
a la evaluación del programa, cuantificando la proporción de casos nuevos clasificados
bacteriológicamente, la proporción de pacientes multibacilares sometidos a control
bacteriológico durante el tratamiento y la vigilancia, se puede determinar el funcionamiento del
programa en una región.

El tratamiento de los pacientes multibacilares se debe hacer con 3 drogas: rifampicina, dapsona
y clofacimina, durante 1 año; se vigilarán durante 5 años, se les practicará baciloscopia cada 3
meses (tanto en el periodo de tratamiento como en el de vigilancia), y se examinarán sus
convivientes cada 6 meses. Los pacientes paucibacilares recibirán como tratamiento 2 drogas:
rifampicina y dapsona durante 6 meses, se les practicará baciloscopia al terminar el tratamiento
y al final del período de vigilancia, se vigilarán durante 2 años, y se examinarán sus convivientes
una vez al año.

OBJETIVOS:
• Realizar la coloración de Ziehl Neelsen (ZN) en muestras de esputo como
herramienta diagnóstica para diagnóstico de TB pulmonar.
• Aprender a leer, informar e interpretar las baciloscopias.
• Observar los diferentes cultivos de micobacterias.
• Conocer las distintas pruebas empleadas para el diagnóstico de Complejo
Mycobacterium tuberculosis.

Coloración de ZN:

a. Colocar las láminas a colorear en los soportes y cubrirlas totalmente con fucsina
fenicada de Ziehl Neelsen, previamente filtrada.
b. Calentar suavemente con la llama, pasando lentamente el mechero por debajo
hasta que se produzca emisión de vapores, evitando que hierva la fucsina. Cuando
estos sean visibles, contabilizar 5 minutos y dejar de calentar, calentando
nuevamente cuando estos desaparezcan. Este procedimiento se repite hasta que
se completen los 5 minutos teniendo cuidado de no dejar hervir el colorante y de
reponerlo cuando sea necesario. Si ocurre evaporación del colorante, agregar
nuevamente fucsina.
c. Dejar enfriar la lámina, descartar la fucsina, lavar con agua corriente.
d. Decolorar con el alcohol ácido al 3% (v/v) cubriendo la lámina durante 3 minutos
y repitiendo el proceso hasta que sea necesario y no se produzca más
desprendimiento de colorante.
e. Lavar con agua y cubrir con azul de metileno que es el colorante de contraste
durante 1 minuto.
f. Lavar suavemente con agua de chorro. Limpiar la parte posterior de la lámina
para retirar residuos de colorante que puedan interferir con la lectura. Dejar secar
la lámina a TºA.
g. Colocar una gota de aceite de inmersión, evitando que la punta del gotero entre 19
en contacto directo con el extendido y observar al microscopio.
LECTURA E INTERPRETRACIÓN
Al enfocar la lámina con objetivo de inmersión (100X), los bacilos ácido alcohol resistentes
se verán rojos sobre un fondo azul. Se debe recorrer la lámina contando el número de BAAR
que se observan en cada campo en superficie y en profundidad con ayuda del ajuste
micrométrico y colocándo el número en cada cuadro de la cuadrícula de 100 cuadros, hasta
completar los campos que sean necesarios de acuerdo a la positividad encontrada, lo cual
será evidente con la lectura de los primeros campos. Recorrer la lámina en línea recta de
izquierda a derecha por el centro hasta el extremo. Baje o suba y regrese de derecha a
izquierda.
23

Luego se suma la cantidad de BAAR observados y se promedia por el número de campos

microscópicos observados. Cuando la muestra contiene muy poquitos BAAR o no tiene
ninguno, se deben observar los 100 campos, si la muestra contiene de 1 a 10 baar por
campo solo será necesario contar 50 campos y si la muestra contiene de 10 a 100 baar por
campo, solo será suficiente observar 20 campos.

Promedio Bacilos por campo = Sumatoria baar en 100 campos = 100 campos
100

5 0 0 1 8 1 0 0 3 7
0 0 0 4 0 0 0 3 8 0
1 0 0 0 6 2 0 9 0 5
4 0 0 4 2 5 7 0 0 0
0 0 4 0 0 6 0 0 0 0
8 0 2 0 5 4 0 3 0 0
1 8 1 0 0 0 7 3 0 2
6 0 4 0 0 6 2 2 5 1
0 3 0 4 0 0 0 0 0 0
2 1 0 0 2 0 0 5 4 0

20
Informe de resultados

Resultado del examen Resultado

microscópico

No se encuentran BAAR en los 100 No se observan bacios ácido alcohol

campos observados resistentes

Se observa de 1 a 9 BAAR en 100 Número exacto de bacilos en 100 campos

campos observados

Se observa entre 10 y 99 BAAR en 100 Positivo (+)

campos observados

Se observan de 1 a 10 BAAR por campo Positivo (++)

en 50 campos observados

Se observan Más de 10 BAAR por Positivo (+++)

campo en 20 campos observados

BIBLIOGRAFIA

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OPS/OMS, ed. Tuberculosis. Detección de casos y quimioterapia, Washington 1980 OPS/OMS:6-8

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tuberculosis y de micobacterias no tuberculosas. INS; 2001

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Extrapulmonar.

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detection of tuberculosis infection.Health Technology Assessment 2007; Vol. 11: No. 3

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extensively drug resistant tuberculosis by 2015.

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OPS. Manual para el diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis. Normas y guía técnica. Parte
I.Baciloscopia. 2008 http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/166101/1/9789275330135.pdf

WHO. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio de Tuberculosis. 2012

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https://unitaid.eu/assets/2017-Unitaid-TB-Diagnostics-Technology- Landscape.pdf

Ministerio de Salud y Seguridad Social de Colombia. Resolución 227, de 20 de marzo de 2020.

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extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.minsalud.gov.co/Normatividad_Nuev
o/Resoluci%C3%B3n%20No.%20227%20de%202020.pdf)

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CUESTIONARIO

1. Haga la orden médica solicitando baciloscopia seriada y cultivo.

2. Haga el informe de la baciloscopia de esputo.
3. Enumere los fármacos antituberculosos de primera línea.
4. Enumere los fármacos antituberculosos de segunda línea de los grupos A, B y C.
5. Haga el informe de la baciloscopia de lepra y calcule el índice bacilar.
6. De acuerdo con el índice bacilar, ¿cuál es la clasificación del paciente ?
7. A un paciente que continúa con baciloscopia ++ a los dos primeros meses de tratamiento.
¿Qué examen(es) debe ordenarle? Explique su respuesta.
8. Si la prueba de Genotype MTBDRplus 2.0 le da el siguiente resultado interprételo y explique
qué conducta debe seguir.

Resultado Genotype

9. Qué mutaciones y en qué genes de la bacteria se encuentran ?

10. Cuando hay resistencia a Isoniazida por mutaciones en el gen inhA, esta resistencia ¿Con
qué otro fármaco hace corresistencia ?

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