Documento elaborado por Dr.

Enrique Durán Páramo

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Práctica 1.- “La curva de calibración”.

1.- OBJETIVOS.

1.1.- Objetivo general.

Comprender la función y objetivo de la curva de calibración para la estimación
de la concentración de algún compuesto.

1.2.- Objetivos específicos.

a).- Desarrollar una curva de calibración para la estimación de la concentración
de azúcares reductores por el método del ácido 3,5–dinitrosalicílico (DNS).
b).- Desarrollar una curva de calibración para la estimación de la concentración
de proteína por el método de Bradford.

2.- INTRODUCCIÓN.
Una curva de calibración muestra la relación entre la concentración o cantidad
de un compuesto y la respuesta de un instrumento utilizado en un análisis.
También se le conoce como curva estándar, curva patrón, curva tipo o curva de
referencia. Representa una gráfica de la señal de respuesta del ensayo con
respecto a la concentración o masa de un compuesto.
Casi todas las mediciones cuantitativas que se realizan en los sistemas
biológicos requieren la calibración de la relación entre la señal que se está
midiendo y la concentración o masa de un compuesto analizado. Para ello,
normalmente se prepara un conjunto de soluciones de concentración conocida
del compuesto que se quiere analizar (estándar); posteriormente se mide a cada
solución de concentración conocida la señal o respuesta del instrumento
empleado en el análisis. De esta forma se relaciona la concentración conocida
del compuesto con la señal del instrumento utilizado. La variable dependiente (la
señal del instrumento) se grafica en el eje “y” (ordenada), mientras que la variable
independiente (la concentración del compuesto) en el eje “x” (abscisa).
Una vez que se grafican los puntos de intersección entre los datos de
concentración contra los datos de la señal del instrumento, se utiliza el método
estadístico de mínimos cuadrados para calcular la ecuación de una línea recta,
de tal forma que la desviación de los puntos con respecto a la línea recta sea
mínima (Figura 1). La línea recta resultante es la línea que más se ajusta. La
ecuación resultante se le conoce como la ecuación de regresión lineal:

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y = mx + b
donde,
y = la variable dependiente,
x = la variable independiente,
m = la pendiente de la línea recta,
b = la intersección con el eje “y” (ordenada al origen).

Por ejemplo, Absorbancia (λ= 540 nm)

Señal del instrumento (unidades)

Límite de linealidad

Pendiente = m

Recta: y= mx + b

Concentración (g/L)

Figura 1.- Curva de calibración de concentración de un compuesto contra absorbancia.

La ecuación de regresión lineal va acompañada del coeficiente de correlación

“r2”, cuyo valor máximo es de 1.0; cuando el coeficiente de correlación tiene un
valor cercano a 1.0 se considera que existe menor desviación con relación a la
línea recta trazada.
De esta forma, la concentración de un compuesto en una solución puede ser
conocida a través de la utilización de una curva de calibración del compuesto en
cuestión.
En la presente práctica se desarrollarán dos curvas de calibración a partir de
datos experimentales.
Primeramente, se desarrollará una curva de calibración para la estimación de la
concentración de azúcares reductores por el método del ácido 3,5–
dinitrosalicílico (DNS).
Posteriormente, se desarrollará una curva de calibración para la estimación de
la concentración de proteína por el método de Bradford.

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3.- MATERIALES Y MÉTODOS.

3.1.- Reactivos, Materiales y Equipos.
Reactivos: Glucosa, tartrato de sodio y potasio, hidróxido de sodio, ácido 3,5-
dinitrosalicílico, azul brillante de Coomassie G-250, etanol, ácido fosfórico,
albúmina sérica bovina (BSA), agua destilada.
Materiales: Micropipetas automáticas, tubos Eppendorf, puntas de pipeta,
botellas de vidrio, papel filtro Whatman No. 1, celdas para espectrofotómetro,
agitadores magnéticos, gradillas para microtubos, espátula.
Equipos: Baño de agua, vórtex, espectrofotómetro UV-Vis, placas de agitación,
balanza.

3.2.- Métodos.
A continuación, se describen los métodos analíticos que se utilizarán para el
desarrollo de las curvas de calibración.

3.2.1.- Método del ácido 3,5–dinitrosalicílico (DNS) para estimación de la

concentración de azúcares reductores.
La glucosa es un azúcar reductor cuya concentración puede ser estimada por el
método de cuantificación de azúcares reductores utilizando el reactivo del ácido
3,5-dinitrosalicílico (DNS). El método del ácido 3,5-dinitrosalicílico cuantifica los
grupos reductores hemi-acetal. La cantidad de ácido dinitro-amino-salicílico
formado es estimada colorimétricamente a una longitud de onda de 540 nm y
está directamente relacionada con la cantidad de azúcares reductores presentes
en la muestra.

3.2.1.1.- Preparación del reactivo del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS).

a).- Disolver 30.0 g de tartrato de sodio y potasio en agua destilada.
b).- Agregar 1.6 g de hidróxido de sodio previamente disuelto en agua destilada.
c).- Agregar 1.0 g de DNS previamente disuelto en agua destilada.
d).- Aforar a 100 mL con agua destilada.
e).- Almacenar el reactivo en botella ámbar, al abrigo de la luz y a temperatura
ambiente.

3.2.1.2.- Preparación de la solución de glucosa y preparación de las

muestras (diluciones).
a).- Preparar 25 mL de una solución de glucosa 0.2% (2 g/L); disolver 50 mg de
glucosa en 25 mL de agua destilada.
b).- Preparar por triplicado las muestras (diluciones) de acuerdo a lo señalado en
la Tabla 1.

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Tabla 1.- Diluciones para la curva de calibración de glucosa.

Volumen Volumen
[Glucosa] solución agua
Muestra
(g/L) glucosa destilada
(mL) (mL)
1 (Blanco) 0.00 0.00 1.00
2 0.20 0.10 0.90
3 0.40 0.20 0.80
4 0.60 0.30 0.70
5 0.80 0.40 0.60
6 1.00 0.50 0.50
7 1.20 0.60 0.40
8 1.40 0.70 0.30
9 1.60 0.80 0.20
10 1.80 0.90 0.10
11 2.00 1.00 0.00

3.2.1.3.- Procedimiento para la estimación de la concentración de azúcares

reductores por el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS).
a).- En un tubo Eppendorf de 1.5 mL de volumen, se mezcla 0.1 mL del reactivo
de DNS + 0.1 mL de muestra.
b).- Se homogeniza la solución en el vórtex.
c).- Se calienta el tubo con la solución en un baño de agua a ebullición (100ºC),
durante 5 minutos exactos.
d).- Inmediatamente después, el tubo con la solución se pone en un baño de
agua fría durante 10 minutos para detener la reacción.
e).- Posteriormente, se añade 1 mL de agua destilada a la solución.
f).- La solución se homogeniza en el vórtex.
g).- La solución se pasa a una celda (cubeta) de espectrofotómetro de 1.5 mL.
h).- En un espectrofotómetro se selecciona la longitud de absorbancia de 540
nm y se ajusta a cero de absorbancia con la muestra No. 1 que representa el
blanco (0.1 mL de agua destilada + 0.1 mL de reactivo DNS, tratado bajo el
mismo procedimiento).
i).- Posteriormente, se determina la absorbancia (λ= 540 nm) de la muestra y se
anota el valor de absorbancia en la Tabla 3.
h).- Realizar el mismo procedimiento con todas las muestras (diluciones)
preparadas.

La Figura 2 presenta el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico para la estimación

de la concentración de azúcares reductores.

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Figura 2.- Método del ácido 3,5-dinitrosalicílico para la estimación de la concentración de azúcares reductores (Created with BioRender.com).

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3.2.1.4.- Desarrollo de la curva de calibración para la estimación de la

concentración de azúcares reductores por el método del ácido 3,5-
dinitrosalicílico (DNS).
a).- Elaborar la curva de calibración en donde se grafique en el eje de las
ordenadas (eje “y”) el promedio de la absorbancia determinada a una longitud de
onda de 540 nm y en el eje de las abscisas (eje “x”) la concentración de glucosa
(g/L).
b).- Utilizar el método estadístico de mínimos cuadrados para calcular la
ecuación de una línea recta, de tal forma que la desviación de los puntos con
respecto a la línea recta sea mínima. Determinar la ecuación de la línea recta
que relaciona a los dos parámetros:
y = mx + b
En donde “y” representa el promedio de la absorbancia determinada (λ= 540 nm);
“x” representa la concentración de glucosa (g/L); “m” representa la pendiente de
la línea recta; “b” representa la intersección al origen (la ordenada al origen).
Promedio de absorbancia (λ= 540 nm) = (pendiente)*([glucosa](g/L)) + b
Especificar el valor del coeficiente de correlación “r2”.

3.2.2.- Método de Bradford para la estimación de la concentración de

proteína.
El método de Bradford se basa en la unión del azul brillante de Coomassie G-
250 a la proteína, lo cual provoca un color azul con un máximo de absorción a
una longitud de onda de 465 a 595 nm. La unión del colorante es independiente
del tipo de aminoácidos presentes en las proteínas que se desean cuantificar. La
concentración de proteína se determina por medio de una curva de calibración
con el reactivo de Bradford y con albúmina sérica bovina (BSA) como estándar
de proteína.
3.2.2.1.- Preparación del reactivo de Bradford.
Preparar 1L de una solución de 0.01% (w/v) de azul brillante de Coomassie G-
250, 4.75% (v/v) de etanol y 8.5% (v/v) de ácido fosfórico.
a).- Disolver 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 en 50 mL de etanol
al 95% (v/v).
b).- Añadir 100 mL de ácido fosfórico al 85% (v/v).
c).- Diluir la solución resultante a un volumen final de 1L con agua destilada.
d).- Filtrar el reactivo con papel filtro Whatman No. 1 cuando se observen restos
sólidos.
e).- Verificar que el reactivo preparado sea color café. Si tiene un tono azulado
no es adecuado, por lo que se tiene que desechar y volver a preparar
nuevamente.
f).- Almacenar en botella ámbar a temperatura ambiente.

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3.2.1.2.- Preparación de la solución de albúmina sérica bovina (BSA) y

preparación de las muestras (diluciones).
a).- Preparar 25 mL de una solución de BSA (100 mg/L); disolver 2.5 mg de BSA
en 25 mL de agua destilada.
b).- Preparar por triplicado las muestras (diluciones) de acuerdo a lo señalado en
la Tabla 2.

Tabla 2.- Diluciones para la curva de calibración de BSA.

Volumen Volumen
[BSA] solución agua
Muestra
(mg/L) BSA destilada
(mL) (mL)
1 (Blanco) 0 0.00 1.00
2 10 0.10 0.90
3 20 0.20 0.80
4 30 0.30 0.70
5 40 0.40 0.60
6 50 0.50 0.50
7 60 0.60 0.40
8 70 0.70 0.30
9 80 0.80 0.20
10 90 0.90 0.10
11 100 1.00 0.00

3.2.2.3.- Procedimiento para la estimación de la concentración de proteína

por el método Bradford.
a).- En un tubo Eppendorf de 1.5 mL de volumen, se mezcla 0.75 mL del reactivo
de Bradford + 0.25 mL de muestra.
b).- Se homogeniza la solución en el vórtex.
c).- Se deja en reposo la solución a temperatura ambiente y durante 5 minutos
exactos.
d).- La solución se pasa a una celda (cubeta) de espectrofotómetro de 1.5 mL.
e).- En un espectrofotómetro se selecciona la longitud de onda de 595 nm y se
ajusta a cero de absorbancia con la muestra No. 1 que representa el blanco (0.25
mL de agua destilada + 0.75 mL de reactivo de Bradford, tratado bajo el mismo
procedimiento).
f).- Posteriormente, se determina la absorbancia (λ= 595 nm) de la muestra y se
anota el valor de absorbancia en la Tabla 4.
g).- Realizar el mismo procedimiento con todas las muestras (diluciones)
preparadas.

La Figura 3 presenta el método de Bradford para la estimación de la

concentración de proteína.

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Figura 3.- Método de Bradford para la estimación de la concentración de proteína (Created with BioRender.com).

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3.2.2.4.- Desarrollo de la curva de calibración para la estimación de la

concentración de proteína por el método Bradford.
a).- Elaborar la curva de calibración en donde se grafique en el eje de las
ordenadas (eje “y”) el promedio de la absorbancia determinada a una longitud de
onda de 595 nm y en el eje de las abscisas (eje “x”) la concentración de BSA
(μg/mL).
b).- Utilizar el método estadístico de mínimos cuadrados para calcular la
ecuación de una línea recta, de tal forma que la desviación de los puntos con
respecto a la línea recta sea mínima. Determinar la ecuación de la línea recta
que relaciona a los dos parámetros:
y = mx + b
En donde “y” representa el promedio de la absorbancia determinada (λ= 595 nm);
“x” representa la concentración de BSA (mg/L); “m” representa la pendiente de
la línea recta; “b” representa la intersección al origen (la ordenada al origen).
Promedio de absorbancia (λ= 595 nm) = (pendiente)*([BSA](mg/L)) + b
Especificar el valor del coeficiente de correlación “r2”.

4.- DATOS EXPERIMENTALES.

4.1.- Para la curva de calibración de azúcares reductores (glucosa), se realizaron
diluciones por triplicado, las cuales se trataron de acuerdo con el método del
DNS, descrito anteriormente. La Tabla 3 presenta los resultados de absorbancia
(λ= 540 nm) obtenidos.
Tabla 3.- Absorbancia obtenida para la curva de calibración de glucosa.

Absorbancia Absorbancia Absorbancia

[Glucosa]
Muestra 1 2 3
(g/L)
(λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm)
1 (Blanco) 0.00 0.000 0.000 0.000
2 0.20 0.089 0.078 0.092
3 0.40 0.205 0.213 0.243
4 0.60 0.388 0.415 0.397
5 0.80 0.578 0.596 0.611
6 1.00 0.814 0.776 0.798
7 1.20 0.915 0.954 0.931
8 1.40 1.152 1.173 1.148
9 1.60 1.254 1.238 1.211
10 1.80 1.426 1.458 1.419
11 2.00 1.605 1.587 1.625

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4.2.- Para la curva de calibración de proteína (BSA), se realizaron diluciones por

triplicado, las cuales se trataron de acuerdo con el método de Bradford, descrito
anteriormente. La Tabla 4 presenta los resultados de absorbancia (λ= 595 nm)
obtenidos.
Tabla 4.- Absorbancia obtenida para la curva de calibración de BSA.

Absorbancia Absorbancia Absorbancia

[BSA]
Muestra 1 2 3
(mg/L)
(λ= 595 nm) (λ= 595 nm) (λ= 595 nm)
1 (Blanco) 0 0.000 0.000 0.000
2 10 0.025 0.031 0.021
3 20 0.075 0.063 0.072
4 30 0.128 0.135 0.119
5 40 0.175 0.183 0.165
6 50 0.226 0.218 0.229
7 60 0.278 0.287 0.269
8 70 0.326 0.319 0.321
9 80 0.354 0.370 0.345
10 90 0.412 0.405 0.421
11 100 0.456 0.475 0.469

5.- RESULTADOS ESPERADOS.

a).- Curva de calibración para la estimación de la concentración de azúcares
reductores (glucosa) por el método del ácido 3,5–dinitrosalicílico (DNS).
b).- Curva de calibración para la estimación de la concentración de proteína
(BSA) por el método de Bradford.

6.- BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA.

Bonner, P.L.R. (2019). Protein purification. 2nd edition. CRC Press, USA.

Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities
of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72:248-254.

Miller, G. L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal.
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Ninfa, A.J. y Ballou, D.P. (2004). Fundamental laboratory approaches for Biochemistry and
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Sashidhar Rao, B. y Deshpande, V. (2005). Experimental Biochemistry. I.K. International Pvt.,

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Seidman, L.A. y Moore, C.J. (2000). Basic laboratory methods for Biotechnology. Prentice Hall,
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Stewart, K.K. y Ebel, R.E. (2000). Chemical measurements in biological systems. John Wiley,
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