Laboratorio de Análisis Químico II INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA 1

ESPECTROFOTOMETRIA DEL VISIBLE

DEMOSTRACION DE LAS LEYES
FOTOMETRICAS Y ERROR RELATIVO DE LA
CONCENTRACION

I OBJETIVOS
 Preparar soluciones de permanganato de potasio
 Medición de los patrones a la longitud de onda de trabajo
 Construir la curva de calibración
 Verificar la conformidad de la ley Beer
 Determinar las concentraciones límites de los patrones

II GENERALIDADES
Después de determinar la longitud de onda a la cuál deben de realizarse las medidas, se calibra el
método midiendo una serie de patrones del constituyente en estudio. Generalmente se prepara una
solución diluida de la sustancia que se desea determinar, se pipetean cuidadosamente porciones de
esta solución, de distinto volumen, se añade el reactivo que forma color, y se ajustan las condiciones
para que se desarrolle el color en forma óptima, se diluye cada solución a un volumen predeterminado
en una fiola, y luego se mide la absorbancia de cada solución a la longitud de onda analítica o de
trabajo.

Las medidas de la absorbancia se realizan comúnmente utilizando un blanco, que debe ser idéntico a
la muestra en todo, excepto en que no debe contener el constituyente que se ha de determinar. El
blanco deberá contener los reactivos, aditivos, disolvente, etc., en la misma naturaleza y concentración
que las utilizadas en cada muestra desconocida en la que se desarrolle color. De esta manera, las
lecturas de las muestras están corregidas automáticamente para cualquier absorción pequeña por
acción de los reactivos y del disolvente. Con los datos absorbancia para las diferentes concentraciones
de las series patrón se construye una curva de calibrado. La cantidad de luz absorbida por cada patrón
se encuentra bien definida y se debe ajustar a ciertas leyes físicas denominadas leyes fotométricas:

a) Ley Lambert - Bouguer

Presenta dos partes:

1.- “La relación entre la energía radiante transmitida, P, y la incidente, Po, es una constante
expresada como T, y se denomina TRANSMITANCIA”.
T = P / Po
2.- “La energía de radiación transmitida decrece en progresión geométrica cuando la longitud del
camino óptico aumenta en progresión aritmética”. Se expresa matemáticamente de la siguiente
manera:
 log T = ab = A = - log T = - ( P/ Po ) = log ( Po/ P )

b) Ley Beer
Expresa la relación entre transmitancia y concentración de material absorbente, es decir, que la
transmitancia disminuye en progresión geométrica cuando la concentración aumenta en progresión
aritmética. Por tanto:
-log T = ac = A = - log (P / Po) = log (1/ T) = -log T

c) Ley Combinada Lambert - Beer

Resulta de la combinación de la ley de Lambert con la de Beer y suele llamarse simplemente ley de
Beer. Esta ley establece que: “la cantidad de luz o energía ultravioleta o infrarroja absorbida o
transmitida por una solución es una función exponencial de la concentración de sustancia absorbente
presente y de la longitud de la trayectoria hacia la muestra”. Se obtiene las siguientes relaciones:
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A = abc = = - log T = -log (P/ Po) = log (Po / P ) = log ( 1 / T ).

Donde:
T = transmitancia
a = absortividad del medio
b = Trayecto óptico
P = poder de radiación transmitida
Po= poder de radiación incidente.

Esta forma matemática de la ley combinada muestra que la absorbancia A en función de la

concentración “c” es una línea recta de pendiente “a”, y la representación de log T frente a la
concentración es una línea recta de pendiente negativa. La representación gráfica de esta ley se
denomina representaciones de la ley Beer.

III FUNDAMENTO
La obtención de la curva de calibrado y la demostración de la ley de Beer se determinan
experimentalmente, preparando una serie de soluciones patrones y midiendo la absorbancia de cada
solución a la longitud de onda analítica, máxima o de trabajo. Con los datos de absorbancia frente a las
concentraciones de los patrones se gráfica en un sistema cartesiano y la representación debe ser una
línea recta de pendiente positiva si cumple con la ley Beer.

IV ARREGLO EXPERIMENTAL

V APARATOS
 Espectrofotométro : Shimadzu 160 -A
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 Cubeta  : 1 cm. De trayecto óptico

 Región de trabajo  : Espectro visible
 Longitud de Onda de trabajo  : 525 nm

VI MATERIALES
 Fiolas de 100 y 250 ml.
 Buretas por 25 ml.

VII REACTIVOS
 Solución Stock O,100N de permanganato de potasio
 Solución madre de permanganato de potasio de 100 ppm .de manganeso
 Soluciones patrones de manganeso

VIII TECNICA
1.- PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PATRONES
Preparar a partir de la solución Stock de KMnO 4 0, 1000 N una solución estándar diluida de 100 ppm
en manganeso para un volumen de 250 ml y luego por dilución preparar las soluciones patrones
siguientes:

CUADRO DE SOLUCIONES

No Concentración ppm Volumen a Volumen a preparar

Patrón Medir del estándar ml
1 0,5 0.5 100.0
2 1,0 1.0 100.0
3 2,0 2.0 100.0
4 4,0 4.0 100.0
5 6,0 6.0 100.0
6 8,0 8.0 100.0
7 10,0 10.0 100.0
8 12,0 12.0 100.0
9 16,0 16.0 100.0
10 20,0 20.0 100.0
11 30,0 30.0 100.0
12 40.0 40.0 100.0

2.- Selección de Modo

Cuando se enciende el instrumento el interruptor es llevado hacia arriba en la posición “ON “y es
iniciado su funcionamiento. Cuando aparece el menú de modo básico seleccionar el modo “5” que
corresponde al modo cuantitativo.

3.- Ajuste de Parámetros

En el mostrario de la función CUANTITATIVO o de determinación de la concentración, ajuste los
parámetros de medición.

MOSTRARIO DE CAMBIO DE PARAMETRO EN EL MODO CUANTITATIVO

CUANT. CAMBIO DE PARAMETRO S / N ?

1.- METODO : 1
1λ = 525 NM
2 .- STANDAR No = 12
3.- MUESTRA No = 1
4.- REPETIR = 1
5.- IMPRESION DE DATOS NO
6.- CURVA DE TRABAJO NO LINEAL NO
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7.- FILA

Para ajustar el primer parámetro “METODO” se sigue los siguientes pasos:

 Para una medida a una longitud de onda única.presionar “SI” ENTER, 1 ENTER. Luego introducir
la longitud de onda de medición.
 Para una medida con 2, 3 longitudes de onda, o para un análisis con valores derivados...presionar
“SI” ENTER, y presionar la opción 2, 3 o 4 y ENTER.

El segundo parámetro “STANDARD” significa introducir el número de soluciones patrones cuyos

valores de absorbancia se van a medir.

El tercer parámetro “MUESTRA No”, significa la solución muestra, este será creado automáticamente.

El sexto parámetro “CURVA DE TRABAJO NO LINEAL”, cuando este parámetro es colocado en “SI”,
la curva trabajada es no lineal. Cuando este es colocado para “NO” , el trabajo de la curva es lineal .

Cuando los parámetros han sido ajustados a las condiciones adecuados presionar en “CAMBIO DE
PARAMETROS “NO. De acuerdo con la indicación de la pantalla, ingresar tantos valores de
concentración como muestras standard o patrones exista. El sistema pregunta “CAMBIO DE
CONCENTRACION S/ N”. Si se cometió un error en la introducción de datos, presionar “SI “
presionar el No del patrón para la corrección, ENTER, entrar el dato correcto, y ENTER.
Cuando no hay error en las entradas de concentración, presionar la tecla “NO “luego el sistema
pregunta “ INGRESO MANUAL DE DATOS DE ABSORBANCIA S/ N? “:
 Al presionar la tecla “SI “puede ingresar los valores de absorbancias desde el patrón número 1
hasta el último.
 Para medir las muestras standares o patrones...presionar “NO “y luego medir los patrones desde el
número 1.

Cuando la entrada manual de las absorbancias de los patrones se ha terminado, el sistema pregunta
“CAMBIO DE DATOS S/N “igual que antes. Luego corregir las entradas equivocadas como se señaló
anteriormente, y presionar por último la tecla “NO “.

El sistema pregunta al operador “MOSTRARIO DE CURVA DE TRABAJO S/ N “, cuando se presiona

“NO “se puede iniciar una medición inmediatamente. Si se presiona “SI “, la curva de trabajo se indica
en la pantalla. Cuando el sistema pregunta “CAMBIO DE CONCENTRACION EN CURVA DE
TRABAJO S/ N ‘“, para cambiar la escala del eje de concentración de la curva de trabajo, presionar
“SI “(valor de concentración) ENTER. En este caso si se presiona “NO “, se indican la curva de trabajo
y su ecuación.

4.- Medición de la Muestra

Insertar una muestra y entonces presionar la tecla “STAR/STOP “, para iniciar su medición.

IX INTERPRETACIÓN DE DATOS
Para copiar la curva de trabajo obtenida en pantalla en función de los valores de absorbancia en el eje
de la ordenada frente a las concentraciones en partes por millón de manganeso en el eje de la abcisa,
presionar la tecla “COPY “.
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Para seleccionar las soluciones patrones para la construcción de la curva de calibración es necesario
calcular el error relativo de la concentración o de la absorbancia que surge de un error fotométrico de 1
%, y se efectua a partir de la ecuación siguiente:

dA = dC = 0.434 dT
A C t log t
Donde:
dA = dC = error relativo de la concentración o de la absorbancia
A C

dT = error fotométrico de 1 %
t = transmitancia.

X CUESTIONARIO
1.- ¿Que son y cuales son las leyes fotómetricas?

2.- Como obtiene y para que se utiliza una curva de calibración o de trabajo

3.- Como comprueba experimentalmente la ley Beer

4.- Señalar las razones por las cuáles se dan las limitaciones de la Ley de Beer

5.- A que se denominan y cuales son los errores personales

6.- Que criterios se maneja para seleccionar las soluciones patrones para ser utilizadas en un método
espectrofotómetrico
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7.- Representar en forma gráfica el error relativo de la concentración considerando el 0.5 % de error
fotométrico si las lecturas son de 1, 5, 10, 20, 30 ,40, 50, 60, 70, 80, 90, y 95 % de transmitancia

8.- Dar razones porque en espectroscopia se utilizan soluciones diluídas

9.- Cuando una curva de calibración no parte del origen señalar las razones que determinan este tipo
de curva

10.- Señalar los rangos de transmitancias y absorbancias de los patrones y de la muestra coloreada
donde el error relativo es mínimo
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Informe de laboratorio No 2
DEMOSTRACIÓN DE LAS LEYES FOTOMÉTRICAS Y
ERROR RELATIVO DE LA CONCENTRACIÓN

Fecha: 21/08/2021 No GRUPO: ___________

Análisis
 Preparación de la solución madre de 100 ppm Mn
 Preparación de soluciones patrones
 Obtención de la curva de calibración
 Verificación de la ley de Beer

Método: Espectrofotométrico del visible

Muestra: Soluciones de permanganato de potasio

A) CÁLCULO DEL VOLUMEN DE LA SOLUCIÓN STOCK

REQUERIDO PARA PREPARAR UNA SOLUCIÓN MADRE DE 100
ppm EN MANGANESO PARA UN VOLUMEN DE 250 ML.
Se aplica la ecuación de dilución para calcular el volumen de la solución
stock de MnO4 1130.50 ppm Mn (0.1 000 N)

V1 x 1130.55 ppm Mn = 250 ml x 100 ppm

V1 = 22.11 ml

Medir por bureta 22.1 ml de la

solución stock y depositar en fiola
x 250 ml

Diluir con agua destilada y

enrasar. Homogenizar la solución
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ur.11

b) CÁLCULOS PARA PREPARAR 100 ML DE LAS

SOLUCIONES PATRONES O ESTÁNDARES ppm Mn. A
PARTIR DE LA SOLUCIÓN MADRE
Se prepara a partir de la solución diluída de 100 ppm Mn. Cálculo del volumen a medir
V1 x 100 ppm = 100 ml x 0.5 ppm V1 = 0.5 ml
V2 x 100 ppm = 100 ml x 1.0 ppm V2 = 1.0 ml
V3 = 2.0 ml
V4 = 4.0 ml

TABLA DE PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PATRONES

No Concentración ppm Volumen a medir Volumen final

Patrón Mn de la solución de ml
100 ppm ml
1 0,5 0.5 100.0
2 1,0 1.0 100.0
3 2,0 2.0 100.0
4 4,0 4.0 100.0
5 6,0 6.0 100.0
6 8,0 8.0 100.0
7 10,0 10.0 100.0
8 12,0 12.0 100.0
9 16,0 16.0 100.0
10 20,0 20.0 100.0
11 30,0 30.0 100.0
12 40.0 40.0 100.0

B) PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES PATRONES

Se preparan las soluciones patrones diluidas para un volumen de 100 ml
a partir de la solución de 100 ppm Mn

Medir el volumen calculado

y depositar la solución en
fiola por 100.0 ml

Diluir, enrasar con agua

destilada. Homogenizar las
soluciones
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E) SELECCIÓN DEL MODO DE TRABAJO (MODO CUANTITATIVO)

MOSTRARIO DE CAMBIO DE PARAMETROS EN EL MODO CUANTITATIVO

CUANT. CAMBIO DE PARAMETRO S / N ?

1.- METODO : 1
1λ = 525 NM
2 .- STANDAR No = 12
3.- MUESTRA No = 1
4.- REPETIR = 1
5.- IMPRESION DE DATOS NO
6.- CURVA DE TRABAJO NO LINEAL NO
7.- FILA

F) MEDICIÓN DE LAS SOLUCIONES PATRONES

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TABLA DE RESULTADOS
No patrón Concentración ABS %T
ppm Mn
1 0.5 0.023 94.84
2 1.0 0.042 90.68
3 2.9 0.087 81.84
4 4.0 0.160 69.18
5 6.0 0.245 56.89
6 8.0 0.339 45.81
7 10.0 0.419 38.11
8 12.0 0.500 31.62
9 14.0 0.578 26.42
10 16.0 0.669 21.43
11 18.0 0.745 17.99
12 20.0 0.843 14.35
13 30.0 1.256 5.55

SOLUCIONES SELECCIONADAS

No Patrón Concentración ppm Mn ABS

1 6.0 0.245
2 8.0 0.339
3 10.0 0.419
4 12.0 0.500
5 14.0 0.578
6 16.0 0.669
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CÁLCULO DEL ERROR DE LA ABSORBANCIA O LA

CONCENTRACIÓN

c = 0.434  T
c t logt

Donde:
c/c = Error relativo de la concentración
 T = grado de inertidumbre 1% (0.01)
t = transmitancia

1) Cálculo del error relativo para 1 % t

= 0.434 (0.01) x 100% =
0.01 log 0.01
2) Cálculo del error relativo para 5 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =
0.05 log 0.05
3.- Cálculo del error relativo para 10 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =
0.1 log 0.1
4.- Cálculo del error relativo para 15 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =
0.15 log 0.15
5.- Cálculo del error relativo para 20 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =
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0.20 log 0.20

6.- Cálculo del error relativo para 30 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =
0.30 log 0.30
7.- Cálculo del error relativo para 40 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =
0.40 log 0.40
8.- Cálculo del error relativo para 50 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =
0.50 log 0.50
9.- Cálculo del error relativo para 60 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =
0.60 log 0.60
10.- Cálculo del error relativo para 70 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =
0.70 log 0.70
11.- Cálculo del error relativo para 80 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =
0.80 log 0.80
12.- Cálculo del error relativo para 90 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =
0.90 log 0.90
13.- Cálculo del error relativo para 95 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =
0.95 log 0.95

TABULACIÓN DE DATOS

%t ABS Dc/c

95 0.0222 20.50
90 0.0458 10.53
80 0.097 5.60
70 0.155 4.00
60 0.222 3.26
50 0.300 2.88
40 0.397 2.72
30 0.523 2.77
20 0. 699 3.10
15 0.824 3.51
10 1.000 4.34
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5 1.301 6.67
1 2.000 21.70

%t DC/C

95 20.50
90 10.53 SOLUCIONES MUY DILUIDAS
80 5.60
70 4.00
60 3.26
50 2.88 SOLUCIONES DILUIDAS
40 2.72
30 2.77
20 3.10 SOLUCIONES
15 3.51 CONCENTRADAS

10 4.34
5 6.67
1 21.70

CURVA DEL ERROR RELATIVO DE LA CONCENTRACIÓN

ERROR RELATIVO DE LA
CONCENTRACIÓN 21.7
20.5
ABSORBANCIA

10.53

6.67
5.6
4 4.34
3.26 2.88 2.72 2.77 3.1 3.51

95 90 80 70 60 50 40 30 20 15 10 5 1
% TRANSMITANCIA
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SELECCIÓN DE LAS SOLUCIONES PATRONES

No patrón Concentración ABS %T

ppm Mn
1 0.5 0.023 94.84
2 1.0 0.042 90.68
3 2.9 0.087 81.84
4 4.0 0.160 69.18
5 6.0 0.245 56.89
6 8.0 0.339 45.81
7 10.0 0.419 38.11
8 12.0 0.500 31.62
9 14.0 0.578 26.42
10 16.0 0.669 21.43
11 18.0 0.745 17.99
12 20.0 0.843 14.35
13 30.0 1.256 5.55

SOLUCIONES PATRONES SELECCIONADOS

No Patrón Concentración ppm Mn ABS

1 6.0 0.245
2 8.0 0.339
3 10.0 0.419
4 12.0 0.500
5 14.0 0.578
6 16.0 0.669

CURVA DE CALIBRACIÓN
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DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Apellidos y nombres __________________________________________________

Firma del alumno: ____________________

CUESTIONARIO
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