Lucía Alba Ordóñez 3ºGBTG

TEMA 2: CULTIVOS IN VITRO

Los cultivos in vitro se definen como el conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento y/o
crecimiento de células o tejidos de plantas (explanto: tallo, hojas, flores) en medio nutritivo y en
condiciones ambientales controladas. Existen 3 conceptos básicos que fundamentan el cultivo
in vitro de células y tejidos vegetales.

- La totipotencialidad celular, que es la posibilidad de obtener una planta entera a partir

de cualquier célula viva, bajo condiciones controladas de cultivo. No todas las células
vegetales poseen esta propiedad (células xilemáticas, por ejemplo).
- La desdiferenciación celular es la pérdida de las características de especialización de la
célula hasta un estado de desdiferenciación meristemática. La rediferenciación celular
es la diferenciación de células previamente desdiferenciadas para dar lugar a otros tipos
celulares. Esto ocurre in vitro en la naturaleza es casi imposible.
- Balance de reguladores del crecimiento vegetal, es decir, el balance entre las hormonas
vegetales (fundamentalmente auxinas y citoquininas).

1. MORFOGÉNESIS IN VITRO: ORGANOGÉNESIS Y EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA

Se entiende por morfogénesis in vitro al desarrollo de formas o estructuras de un organismo o

de parte de un organismo en los cultivos de células/tejidos vegetales (totipotencia). Se cultivan
in vitro células somáticas para desarrollar embriones o brotes en orden de conseguir una planta
completa.

Los prerrequisitos fisiológicos para la morfogénesis in vitro son el aislamiento físico y fisiológico
de la célula o tejido de su ambiente tisular organizado y el mantenimiento del equilibrio entre
los reguladores de crecimiento y otros factores del medio.

Existen dos vías por las que podemos producir la morfogénesis in vitro

- La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo de células del explanto inicial

órgano, tejido o segmento de tejido vegetal que fue utilizado para iniciar el cultivo) se
desdiferencian inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal.
No se obtienen por esta vía plantas completas directamente. Normalmente se obtiene
una yema adventicia a la que podemos favorecer la aparición de raíces.
- La embriogénesis somática se presupone de origen unicelular. Una célula del explanto
constituye el punto de partida para la obtención de un embrión somático. Se diferencian
embriones que completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un
embrión cigótico. El resultado es una planta completa, ya que estos embriones luego son
capaces de desarrollarse como uno normal.

Yema adventicia

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Embrión somatico
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Ambas vías se pueden producir de forma directa (el embrión o los órganos se forman
directamente del explanto) o indirecta (a partir del explanto se forma el callo, que es una masa
amorfa de células pequeñas con una alta tasa de división a partir de las cuales se formará el
embrión o los órganos de la planta).Que siga una vía u otra depende de la planta y de las
condiciones de cultivo.

La más interesante para la mejora de plantas sería la vía indirecta, ya que durante la
morfogénesis se producen más mutaciones, dando lugar a más variabilidad genética. Por el otro
lado la morfogénesis directa es más estable, con menos mutaciones por lo que es útil para clonar
aquellas variedades que nos interesen.

1.1. Caulogénesis y rizogénesis dependiente de auxinas/citoquininas.

La auxina y la citoquinina rigen la morfogénesis, las auxinas tienden a favorecer el

enraizamiento y las citoquininas tienden a favorecer la aparición de yemas adventicias. Lo
importante es la proporción de auxinas/citoquininas para que aparezcan yemas adventicias o
raíces. Si la proporción de auxinas/citoquininas es alta, es decir mucha auxina con respecto a la
citoquinina, se suele favorecer la aparición de raíces. Por el contra, si la relación
auxinas/citoquininas es muy baja, es decir más citoquininas que auxinas, normalmente se
suele favorecer la aparición de yemas adventicias.

↑AUX/CK: alta AUX y baja CK:

formación de raíces

↓AUX/CK: baja AUX y alta CK:

formación de yemas adventicias

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2. AUMENTO DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA: VARIACIÓN SOMACLONAL Y TRANSGÉNESIS

Los cultivos in vitro sirven para producir variabilidad genética y se pueden usar para obtener
variedades.

A partir de un cultivo in vitro podemos coger un explanto y desarrollarlo hasta obtener muchas
plantas que son clones de la planta madre. Si ese explanto no sufre mutaciones todas las plantas
son clones de la planta madre. Pero eso no ocurre así siempre, de hecho, lo normal es que las
células, que están estresadas, sufran mutaciones, entonces si regeneramos plantas completas
no serán idénticas a planta madre.

2.1. Variación somaclonal

La variación somaclonal se puede definir como la variabilidad genética que se produce en

plantas regeneradas a partir de cultivos in vitro. Además se considera una fuente de variación
genética usada en programas de mejoras. Las variaciones pueden ser:

- Variaciones genotípicas: cambios en el número y/o estructura de cromosomas y cambios

en la secuencia del ADN . Estas variaciones son estables, y por ello heredables.
- Variaciones epigenéticas: cambios en los patrones de metilación de ADN y modificación
de histonas. Las metilaciones son reversibles, por lo que solo si son estables se
heredarán.

Es un fenómeno favorecido en fase callosa (vía indirecta) y por la auxina 2,4 – D, que es un agente
mutagénico sintético que promueve la formación del callo.

El cultivo in vitro, por sus características técnicas y de mantenimiento, somete al explanto a un

gran estrés oxidativo que se traduce en la aparición masiva de radicales libres (superóxido,
peróxido de hidrógeno….s)Esto propicia la hiper/hipo- metilación del ADN, cambios en el
número de cromosomas, reordenamientos cromosómicos y deleciones/sustituciones de
nucleótidos y, en última instancia, mutaciones considerables y variaciones somaclonales.

Tenemos una planta madre, cogemos un explanto de ella. Este explanto puede formar callo y a
partir de ese callo se pueden obtener plantas normales, clones de la planta madre. También se
puede formar el callo y dentro de este,
algunas células pueden sufrir mutaciones,
de esta forma, si las plantas que se
regeneran a partir de este callo lo hacen a
partir de estas mutadas tendremos
plantas genéticamente distintas a la planta
madre. Pero si a partir del callo que tiene
células mutadas hay otras que no están
mutadas y a partir de ellas pueden
obtenerse plantas clones de la planta
madre. No siempre que se pasa por la fase
de callo hay mutaciones. Si la planta se
desarrolla a partir de células tanto
mutadas como no, se formará una
quimera.

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Ventajas y limitaciones de la variación somaclonal.

VENTAJAS LIMITACIONES
Los cambios suceden con una alta frecuencia Regeneración limitada a ciertos genotipos (a
veces poco interesantes). No se puede
realizar con todas las plantas.
Forma rápida de generar variabilidad Variantes somaclonales no pasan de la etapa
genética. de laboratorio. Es decir, luego no se pueden
cultivar.
Mejora especies de propagación sexual y Algunos somaclones son inestables y pierden
vegetativa las características interesantes a lo largo de
las generaciones.
Coste económico relativamente bajos Algunos somaclones presentan alteraciones
no deseables.
El nivel de cambios no deseados es mejor que
cuando se utiliza mutágenos químicos o
físico.

Desde un punto de vista productivo y comercial, se requiere:

- involucrar caracteres agronómicamente útiles (flores más bonitas o frutos más grandes),
- que el nivel de expresión del carácter introducido supere al de sus progenitores
- que el carácter mejorado esté combinado e integrado con todos los caracteres
agronómicos previos de la variedad que son importantes para el cultivo
- y que sea heredables

2.1. Transgénesis

Consiste en transformar c células o tejidos vegetales, selección de transformantes y a partir de

ellos generar plantas transgénicas completas vía cultivos in vitro. No ese trata de mejora vegetal
clásica. (tema 4)

2. APLICACIONES DE LOS CULTIVOS IN VITRO EN LA MEJORA DE PLANTAS

Micropropagación: Consiste en obtener clones, sin variaciones. Obtengo miles de explanto y

regenero plantas completas, tengo que evitar el paso por callo porque busco clones.

Los cultivos in vitro, gracias a su capacidad de regeneración, se pueden usar para la

micropropagación de plantas: multiplicación de las plantas de forma asexual, rápida, eficiente y
en grandes cantidades. Para ello se cogen explantos de la planta madre (normalmente
meristemos axilares., se cultiva y ii vitro y se favorece la regeneración de plantas a partir de esos
cultivos in vitro. Evitamos el pasaje por fase de callo para que no se produzcan fenómenos de
variación genética.

Cultivo de anteras: proporciona haploides del material que se está mejorando y, mediante la
duplicación cromosómica, se obtienen los dobles haploides. Esto permite obtener líneas puras
(homocigóticas) de forma directa. Mejora en tabaco, cebada, maíz…

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Fusión de protoplastos: Es la obtención de híbridos por fusión de protoplastos (células sin pared
celular) hibridación somática. Podemos tener 2 especies de plantas emparentadas que hayan
perdido la compatibilidad sexual y una forma de saltarnos la incompatibilidad sexual es mediante
la fusión de protoplastos. Sus genomas reordenan y cultivos in vitro se genera la planta
completa.