CULTIVO IN VITRO

Cultivo in vitro (del latín en vidrio)

Abarca tanto el cultivo aséptico de tejidos como de células y órganos.

Se le llama in vitro debido a que se cultiva en recipientes de vidrio o plástico

transparente.

Esta técnica consiste en cultivar un inóculo con potencial de diferenciación bajo

condiciones asépticas en presencia de nutrientes y hormonas.
 Historia del cultivo in vitro

En un principio los investigadores sugerían que las células en las plantas se

diferenciaban al retener sólo aquella parte del genoma necesario para el tipo celular del
órgano al que estaban destinadas.

Factores externos Células Cambio de forma y funciones

 No se sabía si los cambios sufridos por la diferenciación
eran permanentes e irreversibles o si sólo eran
Cambio de forma y funciones
características temporales para que las células se
adaptaran a necesidades funcionales del organismo en
general y del órgano en particular.

Vochting en 1878, realizó experimentos sobre la polaridad celular y observó que células de tallos
eran capaces de rediferenciarse y formar raíces y brotes
Demostró que la diferenciación no era permanente
sino que estaba dada por la posición relativa de la
célula en la planta (Bhojwani y Razdan 1983, Ferl y
Paul 2000).

Ahora se sabe que la diferenciación celular está regulada por la expresión genética y que no implica
la pérdida de material genético (Ferl y Paul 2000).
Características generales:
• Ocupa espacios pequeños.

• Control de las condiciones de cultivo:

Ambientales (temperatura, humedad, luz), nutricionales (minerales, otros compuestos).

• Cultivo “aislado” biótica (ausencia de otros organismos) y abióticamente (viento, etc).

• Manipulación de las fases de desarrollo (diferenciación y desdiferenciación)

• Posibilita manipulaciones

• Puede conservar material biológico por periodos de tiempo prolongados.

• Cultivo in vitro en espacios pequeños.
Control de las condiciones de cultivo

Ambientales:
Control de las condiciones de cultivo

Nutricionales:
• Cultivo “aislado” biótica (ausencia de otros organismos) y abióticamente (viento, etc).
• Manipulación de las fases de desarrollo (diferenciación y desdiferenciación)
• Posibilita manipulaciones
• Puede conservar material biológico por periodo de tiempo prolongados.

Mediano y largo plazo

Aplicaciones:

1. Multiplicación vegetativa “en masa”

2. Saneamiento

3. Obtención rápida y numerosa de progenie a partir de un solo individuo

4. Soporte en programas de mejora convencional

5. Sistema complementario a conservación de germoplasma convencional

6. Producción de metabolitos secundarios

7. Base inicial de diferentes aplicaciones biotecnológicas

8. Regeneración de plantas transgénicas

1. Multiplicación vegetativa “en masa”
 2. Saneamiento
Producción de plantas libres de virus mediante dos técnicas: Cultivo de meristemos- Microinjerto in vitro

Cultivo de meristemos: disección e incubación

del meristemo apical de una planta en
condiciones de asepsia.
2. Saneamiento

Termoterapia y crioterapia
3. Obtención rápida y numerosa de progenie a partir de un solo individuo

La micropropagación vegetal nos permite propagar masivamente material vegetal en

cualquier época del año y en corto tiempo conservando su potencial genético y
calidad sanitaria.
 4. Soporte en programas de mejora convencional

El mejoramiento genético es la ciencia de incrementar la productividad, la resistencia al medio ambiente y a las

enfermedades presentes en el mismo, generando una mejor adaptación de las especies animales y vegetales
domésticas o la belleza y calidad de sus productos, por medio de modificaciones del genotipo
5. Sistema complementario a conservación de germoplasma convencional

• Especies en peligro de extinción

• Especies con interés comercial
6. Producción de metabolitos secundarios
Cultivo de protoplastos

Es el cultivo de células sin pared pectocelulósica.

Es decir, células con los componentes vivos rodeados

solamente por la membrana citoplásmica.

Debido a la ausencia de pared celular los protoplastos son

adecuados para trabajos en manipulación genética que no
serían posibles con plantas o células intactas, además son
muy utilizados para estudios fisiológicos, bioquímicos y
biofisicos.
Teoría celular:

1. Todos los organismos consisten de una o más células.

2. Las reacciones químicas de cualquier organismo, incluido su proceso de liberación de energía y biosíntesis,
toman parte dentro de las células,
3. Todas las células se originan sólo de células preexistentes, y
4. Las células contienen la información hereditaria que pasa de la célula madre a la célula hija.

Totipotencia integridad información genética que guarda la célula

La totipotencia incluye la potencialidad total de expresión del genoma presente en la célula, aunque no
toda la información se llegue a expresar
Este evento ocurre en la naturaleza, la forma más puntual de ubicar su manifestación es la
embriogénesis, ya que un cigoto proveniente de la fusión de los gametos sexuales es
totipotente, el cual posteriormente da lugar a todos los tipos celulares que aparecen por rutas
sucesivas que restringe cada linaje celular a su destino especifico.
Cultivo in vitro

Se puede apreciar la totipotencia a partir de una sola célula, ya que la capacidad de producción de embriones no está
restringida al desarrollo del cigoto (embriogénesis somática).

La embriogénesis somática es la expresión perfecta de totipotencia de células vegetales,

En este proceso se provoca la reanudación de la mitosis y se favorece la desdiferenciación celular.
 Diferenciación celular

La diferenciación es un término cualitativo y se

refiere a la especialización de las células para
ser estructural y funcionalmente diferentes.

Esta diferenciación en plantas puede ser

reversible, ya que las células diferenciadas
pueden ser estimuladas y revertir a una forma
embrionaria (desdiferenciación)
Competencia
Capacidad de las células para reconocer señales (hormonas o del medio) que
activan una ruta particular de diferenciación.

Determinación
Activación de una ruta particular de diferenciación.
 Tipos de crecimiento in vitro

CRECIMIENTO ORGANIZADO

Se refiere al tipo de cultivo que se inicia con una parte organizada de la planta (ápices,
hojas, brotes, semillas, etc.) y esa parte u órgano sigue creciendo In vitro manteniendo
sus características estructurales.
Se aplica también cuando se desarrolla una estructura a partir de un tejido
desorganizado (organogénesis).
CRECIMIENTO DESORGANIZADO

Este tipo de crecimiento se caracteriza porque a partir de fragmentos de tejidos u

órganos se produce un tejido sin estructura específica que contiene un número
limitado de algunos tipos de células especializadas encontradas en una planta intacta.
Un tejido desorganizado (o callo) puede crecer con subcultivos y puede ser
mantenido en medio sólido o líquido durante varios meses o años.

Puede ser usado para iniciar suspensión de células y protoplastos.

 Tipos de propagación in vitro

Cultivo de órganos

Corresponde al cultivo de un órgano

de la planta con el fin de propagar la
planta.

Cultivo de meristemas o de ápices,

microestacas, cultivo de embriones.
Callos

Corresponde a un conjunto de células

procedentes de la desorganización de un tejido
o de una suspensión de células.

El callo tiene la peculiaridad de presentar

células no diferenciadas para su última función
pero que conservan el poder de dividirse (célula
meristemática o embriogénica).
Suspensión de células
Las suspensiones celulares consisten de células libres y microagregado
de células en medio líquido en movimiento.
Un protoplasto es una célula de planta, bacteria u hongo que ha
perdido total o parcialmente su pared celular, para lo cual se usan
mecanismos enzimáticos que degradan los peptidoglicanos que la
componen.
 Fitohormonas

Son sustancias químicas producidas por algunas células vegetales en sitios estratégicos de la planta y
que son capaces de regular de manera predominante los fenómenos fisiológicos de las plantas.

Se producen en pequeñas cantidades en tejidos vegetales, a diferencia de las hormonas animales,

sintetizadas en glándulas. Pueden actuar en el propio tejido donde se generan o bien a largas distancias.

Las hormonas vegetales controlan un gran número de sucesos, entre ellos el crecimiento de las plantas,
la caída de las hojas, la floración, la formación del fruto y la germinación.
Reguladores de crecimiento:
Los reguladores vegetales son compuestos sintetizados químicamente u obtenidos
de otros organismos y son, en general, mucho más potentes que los análogos
naturales.

• Oportunidad de aplicación
• Dosis
• Sensibilidad de la variedad
• Condición de la planta

Cada planta requerirá de condiciones específicas de crecimiento que pueden

afectarse por la concentración de ellos en el medio.

Se han convertido en las primeras herramientas capaces de controlar el crecimiento

y actividad bioquímica de las plantas por lo que son ampliamente utilizadas.
Clasificación de los reguladores de crecimiento

• Estructura molecular
• Actividad a nivel vegetal
• Efectos inhibitorios o estimulantes
 Función de los principales reguladores de crecimiento

Los reguladores son capaces de controlar toda la actividad metabólica en función de garantizar
la homeostasis intracelular y extracelular.

Auxinas:

Los principales puntos de acción se encuentran a nivel celular, donde tienen la capacidad de dirigir e
intervenir en los procesos de división, elongación y diferenciación celular.

Esta suele encontrarse muy bien distribuida en la mayoría de las células y tejidos vegetales, por lo que
puede interferir en procesos de diferenciación unicelular, pluricelular o incluso tener acción en los
diferentes tejidos vegetales.
• Capacidad para inducir la formación y elongación de tallos a nivel vegetal.
• Promover la división celular en cultivos de callos en presencia de citoquininas.
• Capacidad de inducir la producción de diferentes raíces adventicias sobre los
tejidos de hojas y tallos recién cortados

AIA (natural) Ácido 3-indol-acético

IBA (Sintético) Ácido indol-butírico
2,4-D (Sintético) Ácido 2,4-diclorofenoxiacetico
NAA (Sintético) Ácido α-naftalenacético
Giberelinas:
• También conocidas como ácidos giberélicos.
• Aparecieron por primera vez cuando unos investigadores analizaron algunas fitopatologías
relacionadas con el arroz.
• Se pudo observar la asociación de un hongo (Gibberella fugikuroi) con la sobreexpresión de
giberelina y que ocasionaba un incremento en el crecimiento apical de la planta, con una morfología
delgada en el desarrollo del vástago vegetal.
• Posteriormente se diferenciaron 3 giberelinas (GA1, GA2, y GA3).
• Las giberelinas están involucradas a nivel vegetal en el desarrollo de tejidos, cuyo desarrollo es
constante.
• Elongación de raíces, hojas jóvenes, floración.
Citoquininas:
• Son un tipo de hormonas especificas derivadas de la adenina.
• Se observó que tenían capacidad de iniciar y sustentar la proliferación de tejidos madre cuando eran
aplicadas sobre organismos vegetales en pequeña cantidades.
• La primera Citoquinina fue zeatina, encontrada en el agua de coco.
• Actualmente se sabe que tienen la capacidad de estimular e inducir una alta proliferación y división
celular.
• Suelen inducir la iniciación y elongación de las raíces, activar la senescencia de las hojas, permitiendo
estimular el desarrollo fotomorfogénico vegetal.
• Aumentan y generan la producción de brotes a nivel vegetal.
• Se producen de forma abundante en la punta de la raíz y se transportan por el xilema hacia las hojas.
• Suele acompañarse de auxinas debido a su alta complementariedad en la estimulación y desarrollo
vegetal.
Ácido abscísico:
• También conocido como ABA
• Puede detener o retrasar la germinación
• Función en la maduración del embrión
• Induce la floración.
Ácido salicílico:
• Mejora y potencializa la floración vegetal
• Incrementa la longevidad de la floración
• Inhibe la síntesis de etileno
Etileno:

• Regula los procesos relacionados con la maduración y senescencia vegetal

• Cumple un papel importante en la maduración de las hojas, inicio de la floración, aparición de frutos y de más
órganos
• Se ha observado su intervención en procesos sinérgicos y antagónicos combinado con otras fitohormonas
• Induce y mejora la aplicación de las auxinas, ácido abscísico y citoquininas en procesos de maduración y
desarrollo foliar
Conclusiones de los reguladores de crecimiento:

• Proveen una alta utilidad debido a la variedad de procesos en los que están involucrados.

• Recientemente se ha descubierto que los reguladores vegetales son útiles para controlar la producción
de metabolitos secundarios de importancia médica que las plantas pueden producir de manera natural.

• Pueden ser empleados en el proceso de producción masiva de alimentos de manera más acelerada y
en condiciones de esterilidad adecuadas y aptas para el consumo humano.
 Morfogénesis
Se define como la formación o la génesis de órganos y comprende el crecimiento y la diferenciación
celular.

En tejidos cultivados in vitro el proceso morfogenético puede inducirse ya que, las células vegetales
son capaces bajo determinados estímulos de desdiferenciarse y diferenciarse de nuevo.

Esta plasticidad celular se conoce como totipotencia celular.

Rutas de morfogénesis:

Organogénesis

La organogénesis es una de las vías morfogenéticas en la

cual se diferencian meristemos a partir de las células o
tejidos cultivados. Cuando se produce un meristemo apical
su desarrollo da lugar a una planta.

Embriogénesis

Es una vía morfogenética donde se generan embriones a

partir de células somáticas en cultivo. Los embriones
somáticos (ES) siguen las mismas etapas de desarrollo que
los embriones cigóticos pero no son el resultado de la
fecundación de los gametos.
¿Cómo inducir estos procesos?
Para inducir la organogénesis en los diferentes tipos de explantes se pueden utilizar distintos
reguladores de crecimiento, normalmente reguladores de crecimiento de tipo auxina combinados con
reguladores de crecimiento de tipo citoquinina.

Para inducir la embriogénesis se suelen utilizar auxinas y en concreto el 2-4 D (ácido 2-4
diclorofenoxiacético).

No obstante, en cada caso se requiere de unos reguladores en concentraciones determinadas

que se determinan empíricamente.
 Organogénesis vs Embriogénesis

Si la respuesta al estímulo morfogenético es la formación de un meristemo apical (organogénesis), las

condiciones tienen que ser las adecuadas para que éste crezca y de lugar a tallos que puedan aislarse y
enraizar.

Cuando se producen embriones (embriogénesis), éstos necesitan desarrollarse y pasan por todas las
fases de desarrollo embrionario (globular, corazón, torpedo y cotiledonar), al igual que un embrión
zigótico, hasta geminar originando una planta.

Por ello los medios y condiciones que necesitan para conseguir plantas por una u
otra vía son muy distintos.