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Índice:

• Índice y objetivos: Página 1


• Separación proteínas por electroforesis (SDS-PAGE): Página 2
• Digestión con tripsina: Página 5
• Espectrometría de masas: Página 6

Objetivos:
El objetivo de la práctica consiste en aislar una proteína de un grupo de ellas e
identificarla. Para alcanzar el fin del experimento se debe concluir una serie de
pasos, estos siguen una temporalidad a lo largo de cinco días.

Los procesos resumidos son:


1. Separación proteínas mediante electroforesis de 1 dimensión. (separación
en función de masa).
2. Digestión con tripsina que corta la posiciones carboxilo de los residuos de
Lisina y Arginina (ambos con cadena laterales cargadas positivamente).
3. Después de la hidrólisis obtenemos los péptidos.
4. Mediante una cromatografía en fase reversa separamos los trozos
obtenidos de la hidrólisis de los no cortados.
5. La medición del tamaño de péptidos la haremos mediante una
Espectrometría de masas; obtenemos la huella peptídica de la proteína,
que es caraterística de cada proteína.
6. La bioinformática nos permite conocer que proteína es la que estamos
tratando, al acudir a una base de datos en la que introducimos el peso
molecular de la proteína y de cada trozo cortado con tripsina. Para esto
necesitamos un programa Aldente y nos conectaremos a él a través de un
servidor de acceso libre: EXPASY.

Sin embargo, es importante definir la utilidad de cada paso a seguir en el proceso


aislamiento e identificación de la molécula.

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Separación de Proteínas Mediante Electroforesis (SDS-
PAGE)

Es una técnica que se utiliza para separar proteínas de acuerdo con su movilidad
electroforética. Gracias al SDS la mayoría de proteínas adquieren una relación
carga/masa idéntica, por lo que se obtiene un fraccionamiento que obedece
únicamente a la longitud de la cadena.

El proceso de separación ocurre gracias a dos fases formadas con diferentes


composiciones de geles; en la parte baja va el gel de separación más concentrado
que el de empaquetamiento. Con esta distribución logramos que en el gel de
empaquetamiento las moléculas corran igualmente, llegando a la vez al gel de
separación, por el que corren dependiendo de su longitud.

Para realizar la electroforesis se utilizan los siguientes compuestos químicos:

Acrilamida (C 3 H 5 NO): Es un sólido que cuando se encuentra en disolución


acuosa experimenta autopolimerización de forma espontánea y lenta; el resultado
es que las moléculas de acrilamida se unen cabeza con cola. Sin embargo, si se le
añaden radicales libres el proceso ocurre mucho más rápido. La acrilamida es un
compuesto neurotóxico.

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Bisacrilamida(C7H10N2O2). Su estructura está compuesta por dos moléculas de
poliacrilamida enlazadas por sus grupos amino, no reactivos de cara a la
polimerización. Por ello, la bisacrilamida polimeriza conjuntamente con la
acrilamida pero establece puentes entre las cadenas lineales de poliacrilamida, y
así evita el deslizamiento de éstas y conduce a la formación del gel.

PSA (persulfato amónico) es la fuente de radicales libres y con ello es el


iniciador de la pilomerización.

TRIS (C 4 H 11 NO 3). Su pKa es de 8,3 a 20 ° C, por lo que es un buffer muy


satisfactorio en el rango de pH de aproximadamente 7 a 9. Este agente químico
irá en todos los tampones: separación, empaquetamiento, de carga y reservorio,
pero en diferentes concentraciones.

Glicina (amino ácido acético) (C 2 H 5 NO 2).Se ha utilizado como la fuente de


iones de arrastre o lento debido a su pKa es 9,69 y la movilidad de glicinato son
tales que la movilidad efectiva se puede establecer a un valor inferior al de las
proteínas más lento conocido de carga negativa neta en el rango de pH.. El pH
mínimo de este rango es de aproximadamente 8,0.

Temed (C6H16N2). Es un propagador de la polimerización. Aumentando su


contenido se disminuye la longitud media de la cadena de polímero y se
incrementa la turbidez del gel, al tiempo que disminuye su elasticidad. Se añadirá
al gel de separación.

Glicerol (C3H8O3). Contribuye a que la muestra baje por los pocillos que se
encuentran en la parte superior (gel empaquetamiento) debido a su densidad. Va
en el tampón de carga.

2-mercaptoetanol (HS-CH2CH2OH). Es un agente reductor que se utiliza para


romper los enlaces disulfuro garantizando que la proteína está totalmente
desnaturalizada antes de la carga en el gel, así se garantiza que la proteína corra
de manera uniforme a través del gel. Va en el tampón de carga.

Azul de bromofenol (BPB) (C19H10Br4O5S). Es el colorante marcador


universal. Las proteínas y ácidos nucleicos son en su mayoría incoloros. BPB es
el medio más utilizado de seguimiento, porque es viable en pH neutro y alcalino,
es una molécula pequeña, es ionizable y está cargado negativamente, por encima
de pH 4.6 y por lo tanto, se mueve hacia el ánodo. Al ser una pequeña molécula
que se mueve por delante de la mayoría de las proteínas y ácidos nucleicos, nos
sirve como indicación de cuando terminar la electroforesis. Se enlaza con las
proteínas débilmente y dar color azul.

Dodecilsulfato sódico (SDS) (C12H25NaO4S). se envuelve alrededor del


polipéptido. En este proceso, las cargas intrínsecas de los polipéptidos se vuelven

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insignificante cuando se compara con las cargas negativas aportadas por SDS.
Sin SDS, proteínas con pesos moleculares similares que migran de manera
diferente debido a las diferencias en la proporción de carga en masa, ya que cada
proteína tiene un punto isoeléctrico y peso molecular particular a su estructura
primaria. Añadir SDS resuelve este problema, ya que se une a la proteína y la
rodea, dando una cierta carga negativa uniforme a lo largo de la longitud del
polipéptido.

Para hacer la electroforesis se necesita poner la muestra en el tampón de carga


que se inoculará en los pocillos. A medida que se aplica un voltaje, los aniones (y
las muestras de moléculas cargadas negativamente) migran hacia el electrodo
positivo en el gel inferior. Puesto que el voltaje cae entre los buffers de cloro y
glicina, las proteínas se apilan en finas capas. Los polipéptidos irán moviéndose
en función de su tamaño los que más abajo vayan serán los más pequeños y
viceversa.

El siguiente paso consiste en teñir con azul de Coomasie el gel de separación y


se retira el de empaquetamiento. Es de tipo aniónico, y se une a proteínas de
modo inespecífico. Su estructura es predominantemente no polar, por lo que
habitualmente se usa en disolución con metanol y acético . Las proteínas del gel
se fijan gracias al ácido acético y al mismo tiempo se tiñen. El colorante en
exceso que se incorpora en el gel se puede eliminar destiñendo con una
disolución de composición idéntica excepto por el colorante. Luego se aclara
todo con agua y se deja sumergido una noche. Las proteínas se detectan como
bandas azules contra un fondo claro. Posteriormente se escanea el gel.

Mi banda corresponde a la banda de 50 kD. Sin embargo el resultado de la recta


patrón no es ese sale alrededor de 100 kD incluso corrigiendo al descartar valores
altos y bajos de tamaño del estándar. Podría ser que el estándar no estuviese en
buen estado y a la hora de hacer la recta me salen datos muy desviados.

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Digestión con tripsina de las proteínas separadas mediante
electroforesis SDS-PAGE.
Lo primero que se hace es recoger el gel y cortar la banda que queremos e
introducirlo en tubo con una disolución de bicarbonato amónico que sirve para ir
retirando el tinte y esto se hace combinado con temperatura y agitación.

Es importante definir cual es el mecanismo de acción de la tripsina, que se añade


a continuación para entender el experimento.

El mecanismo enzimático que es similar a otras serín proteassa.. Estas enzimas


contienen una tríada catalítica consiste en histidina-57, aspartato-102, y serina-
195. Estos tres residuos forman un relé de carga que sirve para hacer el sitio
activo nucleofílico con serina. Esto se logra mediante la modificación del medio
ambiente electrostático de la serina. La reacción enzimática que catalizan
tripsinas es termodinámicamente favorable, pero requiere la energía de activación
significativa (que es "cinéticamente desfavorable"). Además, la tripsina contiene
un "agujero oxianión" formado por los átomos de hidrógeno de las amidas de la
Gly-193 y Ser-195 que forman el esqueleto, que sirve para estabilizar la carga
negativa sobre el átomo de oxígeno carbonilo de la amida troceados.

El residuo de aspartato (Asp 189) en el bolsillo catalítico (S1) de las tripsinas es


responsable de captar y estabilizar cargado positivamente la lisina o arginina, y
es por tanto responsable de la especificidad de la enzima. Esto significa que la
mayor parte de tripsina rompe las proteínas en la parte carboxilo (o "C-terminal")
de la lisina, y arginina, excepto cuando uno es seguido por prolina. Las tripsinas
se consideran endopeptidasas, es decir, la división se produce en la cadena
polipeptídica en lugar de en las zonas terminales situada en los extremos de los
polipéptidos.

Las tripsinas tienen un pH óptimo de funcionamiento de alrededor de 8 y la


temperatura óptima de funcionamiento de alrededor de 37 ° C.

La tripsina es producida en el páncreas, en forma de zimógeno inactivos, en


forma de tripsinógeno.

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Representación esquemática de la tripsina

Por lo tanto una vez añadido el enzima a la muestra ya tendríamos péptidos


aunque también polipéptidos (la tripsina), nos interesa quedarnos con los
primeros, y desechar los segundos.

Preparación de los péptidos para la espectrometría de masas


Antes de pasar la muestra por el espectrómetro de masas se debe separar los
péptidos trípticos de los polipéptidos restantes. Esto se consigue mediante una
cromatografía en fase reversa, siendo la fase estacionaría una columna de C18
(Zip-Tip ed Millipore). En la fase móvil (líquida) iría la muestra.

Previamente se desnaturaliza la muestra gracias al ácido trifluoro acético (TFA),


pero siempre en unas cantidades que no hagan bajar el pH por debajo de 2 porque
sino se iniciaría un proceso de hidrólisis, dando péptidos no deseados al no ser
trípticos. También habría que someter a ultrasonidos la muestra para desprender
el péptido del gel.

La cromatografía en fase reversa (Zip-Tip), se hace con el fin de se separar la


muestra (los péptidos cortados) de la tripsina que queda desnaturalizada y unida a
la fase estacionaria. Además este proceso sirve para concentrar la muestra y para
eliminar sales.

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Con acetonitrilo se lava la Zip-Tip, también se la añade TFA que aparte de para
el lavado sirve también para equilibrar. Una vez equilibrado el Zip-Tip se añade
la muestra que se carga y descarga varias veces con el fin de impregnar la fase
estacionaria con la tripsina. Posteriormente se lava varias veces, para que salga
toda la cantidad de péptidos posible, esto se hace acetonitrilo y TFA.

Una vez obtenida la muestra libre de la tripsina se coloca en la placa Maldi y se


añade la matriz.

La matriz consiste en ácido α-ciano-4-ácido hidroxcinámico, también TFA y


acetonitrilo. Sus características son:
. Peso molecular relativamente bajo (para permitir la evaporación superficial),
pero son lo suficientemente grandes (con una baja presión de vapor suficiente) no
se evapore durante la preparación de la muestra o mientras está parado en el
espectrómetro.
. A menudo son ácidos, por lo tanto actuar como una fuente de protones para
fomentar la ionización de la muestra.
. Tienen una fuerte absorción óptica ya sea en el rango de UV o infrarrojos, para
que rápida y eficientemente absorba la radiación láser.
. Tienen grupos polares con lo que permite su uso en soluciones acuosas.

Los solventes se vaporizan, dejando sólo la matriz recristalizada, pero ahora con
las moléculas de la muestra extendido por todo el cristal.

Se colocaría luego en el espectrómetro. Nosotros haremos un Maldi-Tof.


Se denomina MALDI por sus siglas en castellano Matriz Asistida láser de
desorción / ionización, y por el TOF detector de iones que se acopla al MALDI
cuyo nombre procede de sus siglas en castellano Time-Of - de vuelo.

1. Esquema general de funcionamiento

El láser se dispara en los cristales en el lugar de MALDI. La matriz absorbe la


energía del láser y se cree que en primer lugar la matriz es ionizada por este

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evento. La energía del láser expulsa iones de la matriz electrónicamente
excitados, cationes y macromoléculas neutrales, que crean una densa nube de gas
por encima de la superficie de la muestra. La macromolécula es ionizada por las
colisiones. La transferencia de energía es suficiente para promover la transición
de las moléculas de la matriz y los péptidos del estado sólido al estado gaseoso.
Entonces, las moléculas se aceleran en el campo eléctrico de un espectrómetro de
masas y vuelan hacia un detector de iones, donde su llegada se detecta como una
señal eléctrica. Su masa es proporcional a su tiempo de vuelo (TOF) y se puede
calcular en consecuencia.

2. Placa portamuestras 3.Tubo de vuelo

Para calibra el aparato se utiliza una serie de péptidos (cuya masa se conoce)
provenientes de proteínas como ACT, angiotensina e insulina bovina.

El análisis espectrométrico de masas produce una lista de los pesos moleculares,


y la secuencia de cada fragmento. Estos datos son recogidos y comparados en
grandes bases de datos. Utilizamos entonces el Aldente a través de EXPASY, en
él se introduce nuestra huella peptídica y además el peso total de polipéptido que
teníamos antes de haberlo digerido con tripsina, esto lo habíamos calculado a
través de una recta patrón. También hay que indicar de qué tipo de organismo
proviene y tipo de enzima utilizado para el corte , para afinar más la búsqueda.
Así obtendríamos un nombre para la proteína con la que estuvimos trabajando.
Sin embargo, los datos provenientes de la espectrometría de masas no dan un
tanto por ciento de similitud suficiente como para definir la proteína con la que
trabajamos.