UNIVERSIDAD DEL ATLÁNTICO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA EDUCACIÓN

PROGRAMA DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA Y QUÍMICA

DISEÑO DE PRIMERS

INTEGRANTES: Fernando Osorio, Jesús Comas, Javier Polo

Grupo: 17A
Docente: Ada Luz Montes
Universidad del Atlántico

Parte 2: A cerca del diseño de los primers

 Como se calcula teóricamente la temperatura de hibridación (Tm) según:

A) Método de Wallace: La Temperatura de Fusión, Tm, de un oligonucleótido es un valor de

crítica importancia. Su determinación más confiable y exacta es empírica, sin embargo, es
bastante tediosa. Muchas fórmulas útiles y prácticas se han desarrollado para calcular la Tm
para experimentos de PCR, Southerns, Northerns, y para hibridizaciones in situ. Los
principales factores que afectan este valor son: concentración de sales, concentranción de
ADN, presencia de agentes desnaturalizantes (DMSO o formamida), secuencia, longitud y
condiciones de hidridización.
La ecuación mas simple para calcular la Tm está dada por la Regla de Wallace:
(1) Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
En donde A, G, C, y T corresponden al número de cada nucleótido presentes. Esta ecuación
se desarrolló para oligos 'cortos' de 14 a 20 bases que hibridizarían con sus correspondientes
complementarios unidos a una membrana con una concentración de NaCl 0.9M
B) Método del contenido de GC: El contenido GC se puede medir por varios métodos, siendo
uno de los más simples la temperatura de desnaturalización de la doble hélice del ADN con
un espectrofotómetro alternativamente, si la molécula ADN o ARN ha sido secuenciada
entonces el GC se puede obtener exactamente contando el número de bases.ncia TGCTCA
es: 2(1+2) + 4(1+2) = 18 °C.
C) Método termodinámico: Varias fórmulas se utilizan para calcular T m valores. Algunas
fórmulas son más precisas en la predicción de temperaturas de fusión de los dúplex de ADN.
Para los oligonucleótidos de ADN, secuencias es decir cortos de ADN, la termodinámica de
hibridación puede describirse con precisión como un proceso de dos estados. En esta
aproximación se descuida la posibilidad de estados de unión parciales intermedios en la
formación de un estado de hebra doble a partir de dos oligonucleótidos monocatenarios. Bajo
este supuesto uno puede describir elegantemente los parámetros termodinámicos para formar
AB ácido nucleico de doble cadena a partir de ácidos A y B. nucleico monocatenario.
AB ↔ A + B
A constante de equilibrio para esta reacción es. De acuerdo con la ecuación de van't Hoff, la
relación entre la energía libre, Δ G , y K es Δ G ° = - RT ln K , donde R es la constante de la
ley de los gases ideales y T es la temperatura Kelvin de la reacción.
 ¿Cuál es el rango en el número de nucleótidos en los primers?
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Normalmente los primers están en el rango de 17-28 bases de longitud. La temperatura de

hibridación se calcula usando la temperatura de fusión de los oligonucleótidos.
 ¿A que se debe la Formación de dímeros de cebadores?

Un dímero de cebadores se forma y se amplifica en tres pasos. En el primer paso, dos

cebadores recocidos a sus respectivos extremos 3' (paso I en la figura). Si esta construcción
es lo suficientemente estable, la ADN polimerasa se unirá y extenderá los cebadores de
acuerdo con la secuencia complementaria (etapa II en la figura). Un factor importante que
contribuye a la estabilidad de la construcción en la etapa I es un alto contenido de GC en los
extremos 3' y la longitud del solapamiento. El tercer paso se produce en el siguiente ciclo,
cuando se utiliza una sola hebra de producto de la etapa II como una plantilla a la que los
cebadores frescos recocido conduce a la síntesis de más producto PD.
 Cuál es el porcentaje de G/C apropiado para el diseño de primers

El contenido de G+C debe estar alrededor del 50-60%.

 A partir de un programa computacional de libre acceso para diseñar los primers de
interés para un gen específico que pretendas analizar diseña u obtén los primers más
óptimos y explica porque seleccionaste ese juego.

 Para poder realizar un primers, primero se buscó en internet una página llamada
NCBI, para escoger el gen con el que trabajamos:

 Se colocó la opción de “Gene” y escogimos el gen por el que se trabajó:

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 Luego se observó está imagen, y se escogió la opción FASTA.

 Para así observar la secuencia de ácidos nucleicos en este gen

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 Luego se seleccionó la secuencia, y se pegó en el recuadro del programa PRIMERS 3

PLUS:

 Luego de haber pegado la secuencia, le presionamos en el cuadro verde, el cual nos

soltó la siguiente información.
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