Manual de Prácticas de Bioquímica

NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

1. El alumno ingresará al laboratorio con bata, la cual debe de ser blanca y de manga larga.
Es indispensable portar la bata abotonada. Así mismo se recomienda llevar zapatos
cerrados y no sandalias.
2. La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr, jugar, empujar, gritar,
etc.
3. Está terminantemente prohibido el uso de audífonos durante la práctica, salvo que estos
se requieran por deficiencia auditiva del estudiante
4. Antes de empezar el trabajo en el laboratorio tienes que familiarizarte con los elementos
de seguridad disponibles. Es necesario localizar las salidas principales y de emergencia
por si se diese el caso de una evacuación por fuego o por cualquier otro incidente, así
como conocer la localización exacta de extintores, duchas de seguridad y duchas de ojos.
5. En ningún momento se permitirá la aplicación de cosméticos, fumar, comer ni beber en el
laboratorio, ya que hay la posibilidad de que ellos se contaminen con productos químicos.
6. Limpiar las mesas de trabajo antes y después de cada práctica.
7. Para evitar quemaduras, se deberán apagar mecheros, planchas calientes o ambos
cuando éstos no se utilicen. Así mismo, se deberán emplear gradillas o pinzas para
sostener o transportar tubos calientes.
8. Mantener las sustancias químicas inflamables alejadas del fuego, planchas calientes o
ambos.
9. No se deberá olfatear, probar reactivos o ambos o las soluciones. No se debe mirar nunca
la interior de un tubo de ensayo que se esté calentando, ni apuntar hacia alguna persona
porque el contenido podría proyectarse en cualquier momento. La misma precaución debe
tomarse cuando se mezclan reactivos o se agiten vigorosamente los tubos.
10. Utilizar pipetores o perilla de goma para la medición de los líquidos corrosivos, ácidos,
bases, sustancias volátiles, venenos entre otros. No aspirar con la boca.
11. Evitar agregar agua sobre ácidos para evitar quemaduras por proyección. Para diluir
cualquier ácido, se vierte el ácido sobre el agua y nunca agua sobre ácido. Emplear baño
de hielo o baño de agua fría para preparar soluciones diluidas de ácidos.
12. Mantener los frascos de reactivos tapados para evitar derrames.
13. Usar guantes desechables cuando se manipulen muestras biológicas. Considerar que
cualquier material biológico es potencialmente infeccioso aún cuando proceda de
personas aparentemente sanas.
14. Los recipientes del laboratorio nunca deben utilizarse para el consumo y conservación de
alimentos y bebidas; tampoco las neveras u otras instalaciones destinadas al empleo en
los laboratorios.
15. Lavarse siempre las manos después de hacer cualquier análisis y antes de salir del
laboratorio.
16. No se puede hacer ningún experimento no autorizado.
17. Procure quitarse la bata hasta que salga del laboratorio.

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ACCIONES QUE SE DEBEN TOMAR EN CASO DE ACCIDENTE

1. En caso de que exista contacto de ácidos o bases con la piel, ojos o boca, se recomienda
enjuagar el área con abundante agua con el propósito de disminuir su acción por dilución.
2. En caso necesario llamar inmediatamente a los teléfonos de emergencia: Compañía de
Bomberos (119), Cruz Roja Arequipa (Telefax: 054-204343, Móvil: 95-9576843, RPM:
#842761).
3. En caso de ingestión de corrosivos NUNCA provocar vómito. Si existe ingestión de ácidos
hacer beber inmediatamente una solución de bicarbonato de sodio (2 cucharadas soperas
en 2 vasos con agua); en caso de ingestión de soluciones cáusticas (hidróxido de sodio o
de potasio) ingerir una cucharada de vinagre o 25 ml de jugo de limón en agua.
4. Al ingerir otras sustancias químicas hacer vomitar a la persona accidentada. Vigilar que
exista una ventilación adecuada y mantener las vías áreas permeables mientras se
traslada al hospital.
5. Si existe derramamiento de un ácido, neutralizar agregando bicarbonato de sodio y en
caso de bases agregar ácido acético (vinagre). NUNCA tratar de adicionar agua. Emplear
bata, guantes y gafas durante la limpieza.

RECOMENDACIONES PARA TENER EXITO EN LAS PRÁCTICAS

1. El alumno deberá leer la práctica completa y la discutirá con el profesor antes de la

realización de la misma.
2. Los útiles y objetos personales deberán ser colocados en la parte inferior de las mesas de
trabajo.
3. El material con el que se trabajará deberá estar perfectamente limpio antes y después de
la práctica.
4. Antes de preparar las mezclas de reacciones etiquetar adecuadamente cada uno de los
tubos de ensayo con marcador indeleble.
5. Por ningún motivo alterar el orden de adición de reactivos en la práctica.
6. Utiliza agua destilada en todos los experimentos en los que se solicite agregar agua.
7. Mantener los frascos de reactivos tapados para evitar contaminación o vaporización de los
mismos.
8. Utilizar sólo la cantidad requerida de reactivos para evitar el desperdicio de los mismos.
9. Evitar regresar excedentes de reactivo al frasco de donde se extrajo el mismo.

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PRACTICA 2

COLORIMETRIA Y FOTOMETRIA
Muchos experimentos en bioquímica dependen de la absorción de la luz
monocromática, de una solución, en la región visible y ultravioleta del espectro
electromagnético. Muchas moléculas de interés biológico absorben la luz en la longitud de
onda comprendida entre 200 - 800 nm ó 2000 - 8000 Å. Por ejm., purinas, pirimidinas y ácidos
aromáticos, así mismo los ácidos nucleicos y las proteínas. Otros ejm., son las hemoproteínas
(citocromos, hemoglobina y mioglobina) carotenoides y esteroides.

Muchos compuestos, sean o no coloreados, tienen la capacidad de absorber luz de una

determinada longitud de onda; pero en otros casos es necesario transformar la sustancia a un
derivado coloreado, usando un reactivo adecuado.

Tanto el color (colorimetría) como la transmitancia (fotometría) de la luz de una solución

pueden usarse como medida de su concentración.

La colorimetría es un procedimiento por el cual una solución coloreada de un material

de concentración desconocida se compara, mediante el color, con un estándar que contiene
una concentración conocida del mismo material. Hoy se usa poco ésta técnica. La mayor parte
de procedimientos analíticos usan el principio fotométrico, es decir, la medida de potencial
transmisor de luz de una solución coloreada, a una longitud de onda espectral específica.
Muchos aparatos llamados "colorímetros" son realmente fotómetros según la estricta
definición. Si la longitud de onda puede seleccionarse a lo largo de un intervalo continuo,
interponiendo un prisma o una red de dispersión, entre la fuente de luz y la muestra, el
instrumento se denomina "espectrofotómetro".

En fotometría o en espectrofotometría se compara la transmitancia de la luz a través de

una solución que contiene materiales absorbentes con la transmisión de la misma luz a través
de otra solución que solo contiene disolvente. Esta última se denomina solución de referencia
o reactivo blanco o simplemente blanco; debe ser idéntica a la primera excepto en que carece
de los materiales absorbentes de la luz que han de estudiarse. Ambas soluciones deben
medirse bajo idénticas condiciones de longitud de onda, intensidad de luz incidente y anchura
de cubeta (longitud de paso de luz).

1. ENERGIA RADIANTE
Las radiaciones electromagnéticas, conocidas corrientemente como luz, están
compuestas por paquetes de energía llamados fotones o cuantos. De acuerdo a la longitud de
onda, se conocen tres zonas: a) Ultravioleta (UV), comprende radiaciones de 100 a 300 nm de
longitud; b) Luz Visible (color), está constituida por radiaciones electromagnéticas de 390 a
770 nm de longitud de onda y c) El Infrarrojo, entre 2000 a 30000 nm.

Una onda de luz posee campos eléctricos y magnéticos oscilantes que están en fase,
pero son perpendiculares a la dirección de propagación. La longitud de onda, de la luz, se da
en cm y se relaciona con la velocidad de luz en el vacío, en cm/seg, y con la frecuencia, en
ciclos/seg:

Longitud de onda (), es la distancia entre los nudos de dos ondas de radiación
adyacente. Se mide en cm, nm, mm, mm, Å.

La velocidad (c), de propagación en el vacío es de 3 x 1010 cm/seg y algo menor al

atravesar sustancias transparentes.
La frecuencia (v), es el número de oscilaciones por segundo. Se expresa en ciclos/seg.

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La luz interacciona con la materia principalmente a través del campo eléctrico oscilante.
Para fines de absorción debe tenerse en cuenta que la luz es un paquete de energía o fotón
hv, donde h es la constante de Planck, 6.627 x 10-27 ergios segundo, y v es la frecuencia. De
aquí se desprende que la energía de la luz es directamente proporcional a la frecuencia:

y según la ecuación anterior inversamente proporcional a la longitud de onda.

Hay absorción de luz cuando la energía del fotón, hv, corresponde a la diferencia entre
los niveles de energía de la molécula.

2. LEYES DE ABSORCION
En Química Biológica se emplea la fotometría principalmente para regular o controlar la
concentración de diversas especies en mezclas de reacción. La absorción de luz a una
longitud de onda dada, está relacionada con la concentración de especies absorbentes por
medio de dos leyes.

2.1. Ley de Lambert. Lambert estudió la cantidad de luz monocromática absorbida por un
cuerpo y enunció la ley que dice: "la fracción de luz absorbida es proporcional al espesor del
absorbente x, e independiente e la intensidad de luz", o en otros términos, "la proporción de
luz incidente, absorbida por el medio, es independiente de su intensidad y cada sucesiva capa
unidad de medio, absorbe una fracción igual de la luz que pasa a través de él". Por ejm., si la
luz incidente es 100% y cada capa unidad de espesor x, absorbe el 20% de la luz incidente, la
luz transmitida es el 80%. Para otras capas unidad de espesor x, la luz transmitida disminuirá
como sigue: 64%, 51.2%, etc. que es la secuencia (0.8)0, (0.8)1, (0.8)2, (0.8)3, etc. Lo que
conduce a la expresión matemática:

Donde:
I0 = Intensidad e la luz incidente
I = Intensidad de la luz transmitida
x = grosor de la capa en cm
α = coeficiente de absorción del medio

En forma logarítmica tenemos:

Al pasar al sistema logarítmico de base 10, el coeficiente de absorción c, se convierte

en coeficiente de extinción molar k

o sea

por tanto

Donde: log I0/I es la densidad óptica (D.O.) o absorbancia (A). A es directamente

proporcional a x.

2.2. Ley de Beer. Beer estudió la influencia de la concentración de la solución de una

sustancia coloreada sobre la transmisión de la luz monocromática y halló la misma relación
entre la transmisión y el espesor de la capa atravesada. Teniendo en cuenta que la luz se
absorbe solamente cuando un fotón choca con una molécula, la ley de Beer puede anunciarse

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

como sigue: "cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, la
cantidad de luz absorbida o la probabilidad de absorción es proporcional al número de
moléculas c, contenidas en el haz de luz".

donde: c = concentración en mol/l.

Cuando en la ley anterior, la transmitancia disminuye exponencialmente con el número

de moléculas absorbentes. Por ejm., en el caso anterior se hizo variar el espesor de la capa,
ahora si hacemos que el espesor de la capa sea constante, es decir que sea 1 cm y variamos
la concentración de la solución de la sustancia coloreada tenemos que: si consideramos la Io
como 100% y la absorbancia de cada una de las concentraciones c, es 50% de la luz
incidente, la luz transmitida es 50%. Para otras concentraciones c, la luz transmitida disminuirá
como sigue: 25%, 12.5%, 6.25%, 3.13%, etc.

La ley de Beer es exacta sólo para luz monocromática y en muchos casos no se cumple
sobre todo a concentraciones altas.

2.3. Ley de Beer-Lambert. Es evidente que pueden combinarse las leyes de Beer y Lambert,
ya que tanto c como K incluyen un factor de concentración, de donde:

E = coeficiente de extinción molar

c = concentración en moles/litro

De aquí se deduce:

por consiguiente:

La ley combinada de Beer-Lambert nos dice que: "la fracción de luz incidente absorbida
por una disolución, a una determinada longitud de onda, está relacionada con el espesor de la
capa absorbente x, y con la concentración c, de la especie que absorbe". La Ley de Beer -
Lambert supone que la luz incidente es paralela y monocromática, y que las moléculas del
disolvente y del soluto están orientadas al azar.

2.4. Coeficiente de extinción molar. Por definición, el coeficiente de extinción molar E, es la

densidad óptica (log10 I0 / I) de una solución 1 M de la sustancia con un recorrido luminoso de
1 cm y generalmente se escribe E 1cm 1mol/l. La densidad óptica carece de dimensión, por lo que
E se expresa en términos de litros (concentración x longitud). E se expresa en unidades de
litros moles-1cm-1; es decir, en cm 2 / mmol y es numéricamente equivalente a la densidad
óptica de una solución milimolar de la sustancia con un recorrido luminoso de 1 cm. Con
frecuencia se utiliza el término E 1cm 1%, que es la extinción de una solución al 1% (1 g/100 ml)
cuando el camino recorrido por la luz es igual a 1 cm.

2.5. Coeficiente de extinción específica. En muchas ocasiones no se conoce el peso

molecular de algunos compuestos tales como proteínas y ácidos nucleicos presentes en una
mezcla y entonces se acostumbra expresar la concentración en g/l. En estos casos, se emplea
el coeficiente de extinción específico. Se le define como la densidad óptica de una solución al

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

10% (10g/l) del compuesto cuando el recorrido de la luz es 1 cm, E 10g/l.

1cm

2.6. Transmitancia (T). Es la capacidad de una solución para transmitir la luz. Se define como
la relación entre la intensidad de la luz que sale de la solución y la intensidad de luz entra a
ella.

Si la solución es absolutamente transparente I = 1, y su transmitancia será 1; este valor

es tanto menor de 1 cuanto mayor sea la luz absorbida por la solución. Se acostumbra,
también, expresar la transmitancia como porcentaje, es decir, porcentaje de luz transmitida:

Por tanto, los valores de T % van de 0 a 100%. Como la transmitancia va de 0 a 100%,

la expresión de Beer - Lambert será:

2.7. Absorbancia (A) o Densidad Óptica (D.O) o Extinción (E). Es la cantidad de luz
absorbida por una solución, equivalente al logaritmo negativo de la transmitancia y se mide en
unidades de 0 a 2 en la escala de absorción; 2 es el logaritmo de 100% de transmitancia. Este
es ó puede también calcularse restando a 2 el logaritmo del
porcentaje de transmitancia;

Si se construye una gráfica de A en función de c, se obtiene una recta, pues la

absorbancia es directamente proporcional a la concentración. La pendiente de la recta es Ex, y
el valor de la ordenada para c = 0 se considera cero.

Ejm. En un espectrofotómetro se ha ajustado al 100% la transmitancia de luz con agua

(blanco); la lectura de una solución de K2Cr2O7 en el mismo espectrofotómetro indica que T%
= 50 y la absorbancia es 0.301.

Solución: Hemos dicho que -log T ó -log I/I0 se denomina absorbancia. En este ejemplo:

Como:

tenemos:

reemplazando tenemos:

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

Ya que, en la práctica, siempre se ajusta la transmitancia a 100% (cuyo log = 2), la

absorbancia se puede calcular a partir de:

2.8. Limitaciones de la Ley de Beer-Lambert. Aunque la ley de Lambert se cumple en todos

casos hasta hoy estudiados, la de Beer tiene algunas alteraciones. Algunas veces la relación
lineal entre la absorbancia y la concentración predicha por la ley de Beer, no se cumple. Los
tres tipos de desviaciones son: a) instrumentales, que pueden ser ópticos, mecánicas o
ambas, b) las relacionadas con las muestras y; c) experiencia del investigador.

2.8.1. Desviaciones Instrumentales. La ley de Beer solo se cumple para luz monocromática.
En la práctica nunca se obtiene luz totalmente monocromática. La monocromaticidad puede
variar cambiando el ancho de la rendija.

Para la región visible del espectro se usan los fotocolorímetros. Difieren de los
espectrofotómetros en que usan filtros para obtener luz monocromática en lugar de un prisma
o red y una rejilla. Los filtros dejan pasar una ancha banda de luz; por ejm., un filtro de 540 nm
deja pasar una luz que oscila entre 525 y 555 nm. Por el contrario, las rendijas de los
espectrofotómetros ayudan a seleccionar mejor la longitud de onda a usarse, por lo cual se
puede suponer que con estos aparatos la ley de Beer tiene una menor desviación. También, la
ley de Beer se desvía con la luz no paralela.

2.8.2. Desviaciones Debidas a la Naturaleza de la Muestra. Se deben al cambio en la

concentración efectiva de la especie absorbente o la interferencia debida a los productos de
alguna reacción secundaria.

Muchas especies absorbentes contienen grupos ácidos o básicos. Puesto que los
conjugados del par ácido-base tienen una absorción diferente, si no se controla el pH habrá
desviaciones. De igual modo, si el equilibrio de la especie depende de la temperatura, habría
desviaciones si la temperatura sufre cambios. Si las moléculas del absorbente se absorben a
las paredes de la celda durante el curso de la observación, disminuyen la concentración
efectiva en la disolución y producen desviaciones aparentes de la ley de Beer, Los disolventes
también pueden cambiar las características de absorción. Las soluciones muy concentradas,
que originan un color muy intenso, también originaran desviaciones ya que la ley se cumple
solo hasta cierto límite máximo de concentración, característico para cada sustancia.

2.8.3. Desviaciones Debidas al Investigador. Principalmente se deben a una mala elección

de longitud de onda. La longitud de onda de la luz empleada debe coincidir con el máximo de
absorción de la solución. Esto permite también conseguir la sensibilidad óptima.

3. RANGOS ADECUADOS DE CONCENTRACION

Es muy difícil medir la concentración de las soluciones con exactitud por
espectrofotometría, ya que en algunos casos la intensidad de radiación transmitida I, es muy
pequeña, mientras en otras es muy alta. En la práctica, I debe de estar entre el 10% y el 90%
de Io (es decir, la absorbancia debe de estar entre 1.0 y 0.05), pero las medidas más seguras
se realizan cuando I» 50% de Io (es decir, absorbancia = 0.3). Estas condiciones pueden
conseguirse modificando la concentración del compuesto, el espesor de la célula o cambiando
la longitud de onda de la radiación (es decir, variando E). El primer procedimiento es el que se
realiza con más frecuencia.

4. CALCULO DE LA CONCENTRACION DE UNA MUESTRA PROBLEMA

Existen tres formas de cálculo.

4.1. Mediante el factor de calibracion (Fc). Resulta de dividir la concentración del estándar
entre la absorbancia del estándar:

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

el factor obtenido se multiplica por la lectura o absorbancia del o de los tubos que contienen la
solución problema, obteniéndose así la concentración de la muestra o muestras. Para
expresar la concentración en porcentaje, se toma en cuenta el volumen utilizado 100/V.

Según la Ley de Beer - Lambert tenemos que:

donde:
Ast = absorbancia del estándar o patrón
Am = absorbancia de la muestra problema
Cst = concentración del estándar o patrón

teniendo en cuenta que el espesor X es constante y que la tratarse de soluciones de la misma

sustancia el coeficiente de extinción K, será el mismo. Relacionando las dos expresiones
tenemos:

despejando:

Ya que tanto la lectura del problema como del patrón son equivalentes a la absorbancia,
se tiene:

Nótese que Cst / Ast es un constante y puede usarse como un factor sobre todo cuando
se va a determinar la concentración de una serie de muestras. Por tanto, la ecuación anterior
se puede reducir a:

donde: Fc = factor de calibración (Fc = Cst/Ast); esta expresión referida a porcentaje se

escribe:

v = volumen de la muestra utilizada para la determinación.

4.2. Mediante curvas de calibración. En este caso se utilizan varios patrones de

concentraciones progresivas y un blanco (el blanco contiene todos los componentes de la
muestra menos la sustancia a determinar). Luego se realiza la lectura (de absorbancia)
usando el filtro o la longitud de onda para la cual la sustancia tiene la máxima absorción. Se
registra el valor de absorbancia en una tabla.

Luego se construye una gráfica en un sistema de coordenadas, colocando las lecturas

correspondientes a los patrones en el eje de las "y" (eje de ordenadas) y las concentraciones
de los mismos en el eje de las "x" (eje de abscisas), con lo cual se obtiene una recta, que pasa
por cero si la sustancia obedece la ley de Beer-Lambert.

La muestra problema dará una lectura o absorbancia determinada que se busca en el

eje de las ordenadas de la gráfica anterior, luego por este punto se traza una perpendicular a

8
 Manual de Prácticas de Bioquímica

dicho eje hasta encontrar la curva (trazada con la lectura y concentración de los patrones). En
seguida, por este punto de intersección se traza una paralela al eje de ordenadas hasta tocar
el eje de abscisas (eje de concentración). Por lo tanto, la concentración de la muestra
problema está dada directamente por este punto del eje de abscisas.

En la curva de calibración puede observarse que hay una parte de la curva dentro de la
que se cumple perfectamente la ley de Beer-Lambert, es la parte recta que corresponde a una
función lineal. Sin embargo, puede también aplicarse a valores superiores por extrapolación
siempre que las desviaciones con respecto a la recta no sean muy grandes. Además, el uso
de la gráfica elimina los errores que podrían aparecer como consecuencia del uso del cálculo
de proporcionalidad en una región donde no se cumple la ley de Beer-Lambert. Esto último
corrobora la norma general que preconiza el uso de soluciones patrón para las comparaciones
colorimétricas cuyas densidades ópticas sean lo más cercanas posible al valor del problema.

4.3. Mediante la ecuación A = Ecx. Ecuación obtenida de la combinación de las leyes de

Beer-Lambert (en la que x es un valor constante por ser los tubos uniformes, o por usarse una
sola cubeta para hacer la lectura). Para esto se calcula una E relativa mediante , para
los patrones, (los valores hallados deben ser iguales si la sustancia cumple la ley de Beer).

El coeficiente de extinción debe mantenerse constante para un intervalo de

concentraciones de patrones y problemas. Una vez obtenido un valor E, la concentración de la
muestra se determina mediante la ecuación que sigue:

1. ESPECTROS DE ABSORCION. Se llama espectro de absorción a la gráfica que

representa la absorbancia en función de la longitud de onda. Muchos compuestos
contienen espectros característicos de absorción en la región visible y ultravioleta, lo cual
hace posible la identificación de dichos materiales en una mezcla.

Figura 1.
Espectros de
Absorción del
naftaleno,
antraceno y
tetraceno

2. VALORACIONES ESPECTROFOTOMETRICAS. El curso de una reacción química o la

posición de un equilibrio pueden determinarse en forma rápida con un espectrofotómetro si
puede medirse la absorción de uno de los componentes. Como ejemplo tenemos las
curvas de valoración de los indicadores:

9
 Manual de Prácticas de Bioquímica

donde las formas protonizadas o no protonizadas (o ambas) son coloreadas. Los máximos de
absorción para las dos formas suelen estar separados, por lo que se puede medir la
concentración de cualquiera de las formas. Si se disuelven cantidades iguales del indicador en
tampones de diverso pH y se mide la absorbancia en uno de los máximos de absorción, se
puede calcular el pK. La determinación espectrofotométrica del pK es el mejor método. El pK
se debe determinar a diversas concentraciones para comprobar las desviaciones de la ley de
Beer.

3. ESPECTROFOTOMETRIA Y ENZIMAS. Por las grandes ventajas de comodidad,

sensibilidad, amplio espectro espectral y una selección fina de longitud de onda, el
espectrofotómetro se utiliza en enzimología, principalmente, en tres tipos diferentes de
determinaciones: a) se puede determinar la concentración de un compuesto midiendo la
densidad óptica a una longitud de onda bajo condiciones en que no ocurran cambios y
suponiendo que el coeficiente de extinción del compuesto es conocido; b) se puede seguir
el curso de una reacción en un sistema completo de ensayo, midiendo la velocidad de
formación o desaparición de un compuesto absorbente de luz. Para este tipo de medidas
se dispone de espectrofotómetros que representan gráficamente la densidad óptica frente a
tiempo; c) un tercer tipo de medida interesante para la identificación de compuestos
requiere la determinación de la densidad óptica en función de la longitud de onda. También
este caso se dispone de instrumentos que trazan la curva automáticamente.

PARTE EXPERIMENTAL

EXPERIMENTO N° 1. DEMOSTRACION DE LA LEY DE BEER Y CONSTRUCCION DE

CURVAS DE CALIBRACION

OBJETIVOS
Poner en evidencia la ley de Beer-Lambert haciendo uso de concentraciones
progresivas del rojo de fenol.

FUNDAMENTO
Si se mantiene constante la longitud de onda de máxima absorción, la absorbancia
dependerá de la concentración

MATERIALES
Espectrofotómetro.
Tubos de ensayo
Gradillas
Pipetas
Rojo de fenol 1x10-4 M
Buffer borato 0.1 M, pH 9.8
Solución estándar de SBA 2mg/ml
Hidróxido de sodio 6%
Agua destilada

METODO DE TRABAJO
a) Curva de calibración para el rojo de fenol. Prepare un sistema de tubos como se indica a
continuación y lea a 540 nm:

TUBO N° Blanco 1 2 3 4 5 6
Buffer borato 0.1 M, pH 9.8 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
Rojo de fenol 1 x 10-4 M -- 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Agua destilada 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 --

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

DATOS EXPERIMENTALES

Concentración
Tubo
de Rojo de Abs Fc
N°
Fenol (M)
Blanco
1
2
3
4
5
6

b) Curva Estándar para proteínas. Micrométodo de biuret (Brewer y col 1974). Prepare un
sistema de tubos como se indica a continuación e incube por 15 minutos a 37 °C.
Transcurrido este tiempo se lee a 330 nm frente a un blanco apropiado.

TUBO N° 1 2 3 4 5 Blanco
Proteína (ml) 0.10 0.30 0.50 1.0 2.0 0.0
Agua destilada (ml) 1.9 1.7 1.5 1.0 0.0 2.0
NaOH 6% (ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Reactivo de Biuret (ml) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

DATOS EXPERIMENTALES

[Proteína]
Tubo N Abs Fc
mg/ml
Blanco -
1 0.2
2 0.6
3 1.0
4 2.0
5 4.0

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA

Para obtener las curvas de calibración, utilice papel milimetrado y grafique los valores
de absorbancia en las ordenadas y la concentración del colorante en las abscisas. Debe tener
en cuenta que el tamaño de los ejes en el plano debe ser del mismo tamaño, independiente de
la escala, para obtener una línea recta de aproximadamente 45°. Determinar el factor de
calibración promedio. Luego consigne la discusión, la conclusión o conclusiones a las que
arriba y la bibliografía consultada.

EXPERIMENTO N° 2. DETERMINACION FOTOMETRICA DEL pK DEL ROJO DE FENOL.

FUNDAMENTO:
El rojo de fenol es un ácido débil y la variedad donadora de protones se disocia en
solución, dando un protón y una variedad aceptora de protones:

Amarillo Rojo

Según la ecuación de Henderson-Hasselbalch, tenemos;

11
 Manual de Prácticas de Bioquímica

Sea igual a la suma de las variedades aceptora y donadora de

protones del ácido, o sea, la cantidad total de ácido existente. Por tanto, .
Reemplazando estos valores en la ecuación se tiene:

Esta es una ecuación de una recta, de tipo y = ax + b, donde b = pK; a = 1; y = pH; x =

log [A-] / [T] - [A-]. Por tanto, si se construye una gráfica con el pH en las ordenadas y los
valores de la expresión log [A-] / [T] - [A-] en las abscisas, tendremos una recta cuya
intersección con el eje vertical representa el pKa. Puede suponerse que en un medio ácido el
rojo de fenol no está ionizado, en solución alcalina está totalmente ionizada [A -], y en solución
tampón de pH 7.8 (ó 7.6) las dos formas se hallan en igual concentración.

Se ha encontrado que la variedad aceptora de protones presenta un máximo de

absorción cerca de 550 nm. Para esta longitud de onda, la variedad donadora absorbe muy
poca luz, por tanto, podemos aceptar que la absorción total a 550 nm corresponde casi
totalmente a la variedad aceptora. A 550 nm, la absorción de la luz por el rojo de fenol sigue
la ley de Beer-Lambert, o sea: donde se incluye la constante
correspondiente al trayecto luminoso.

Por tanto, si se construye una gráfica poniendo en las ordenadas una serie de valores
de absorbancia a 550 nm, para distintas concentraciones conocidas de A -, y en las abscisas
los valores de concentración, se obtiene una recta. A partir de esta curva de calibración es
posible, midiendo la absorbancia, determinar A- en una solución de concentración
desconocida, o medir la proporción entre A- y AH, en una solución donde se conoce la
concentración total del indicador. Si se mide la concentración de A- para algunos valores
conocidos de pH, en una solución cuya concentración total del colorante se conoce, se obtiene
una curva que permite deducir el pK del indicador.

MATERIALES
Espectrofotómetro.
Tubos de ensayo
Gradillas
Pipetas
Rojo de fenol 1x10-4 M
Buffer fosfato 0.1 M
Agua destilada

METODO DE TRABAJO
El pK del rojo de fenol es aproximadamente 7.8. Prepare el siguiente sistema de tubos:

TUBO N° Bl 1 2 3 4 5 6
Buffer fosfato 0.1 M, pH 7.2 4.0 4.0 -- -- -- -- --
Buffer fosfato 0.1 M, pH 7.6 -- -- 4.0 -- -- -- --
Buffer fosfato 0.1 M, pH 7.8 -- -- -- 4.0 -- -- --
Buffer fosfato 0.1 M, pH 8.0 -- -- -- -- 4.0 -- --
Buffer fosfato 0.1 M, pH 8.4 -- -- -- -- -- 4.0 --
Buffer fosfato 0.1 M, pH 8.8 -- -- -- -- -- -- 4.0
Rojo de fenol 1 x 10-4 M -- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Agua destilada 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

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 Manual de Prácticas de Bioquímica

DATOS EXPERIMENTALES

[A-] log [A-] /

Tubo Abs [T] - [A-] [A-] / [T] - [A-] pH
Moles [T] - [A-]
Blanco
1
2
3
4
5
6

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUCIÓN, BIBLIOGRAFÍA

En papel milimetrado se construye una curva del pH en las ordenadas en función del
valor correspondiente de log [A-] / [T] - [A-] en las abscisas. Se traza una línea recta por los
puntos experimentales, y se extrapola esta recta hasta el eje vertical. El punto de intersección
de la recta con el eje de pH representa el pK del indicador. Obsérvese que, al extrapolar hasta
el eje vertical, queda implícito que, a este nivel de esta intersección, log [A-] / [T] - [A-] vale
cero. Por tanto, [A-] / [T] - [A-] debe ser igual a 1 en este punto. Ya se sabe que pH = pK
cuando las variaciones donadora y aceptora de protones de un ácido débil tienen la misma
concentración en la solución. Luego consigne la discusión, la conclusión o conclusiones a las
que arriba y la bibliografía consultada.

CUESTIONARIO

1- ¿Qué es una radiación electromagnética?

2- Definir los parámetros ondulatorios de la radiación electromagnética.
3- ¿Cómo están relacionados la energía y la longitud de onda?
4- ¿A qué se llama radiación monocromática?
5- Ordene las regiones visible, infrarrojo y ultravioleta del espectroelectromagnético según la
Energía que poseen y justifique.
6- ¿Qué sucede cuando una molécula absorbe energía? ¿Qué sucede cuando un átomo
absorbe energía?
7- ¿Qué significa excitación y relajación de los analitos?

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