Evaluación y Validación de Métodos en el Laboratorio Clínico 2:

Validación Analítica (parte 2)

TM Alfonso Hernández Monsalves, PhD

Bases del Laboratorio Clínico TEMD1110

 Test
Diagnósticos

Observación

Hipótesis ¿Diagnóstico?
Diagnóstico

Entrevista

Identificar signos y
síntomas

Proceso Diagnóstico
 Test
Diagnósticos

Diagnóstico

EXACTOS
¿Cómo puede un laboratorio
estar absolutamente seguro
de que el resultado que
informa es “exacto”?
Precisión v/s Exactitud
 Exacto y Preciso
0,9998 1,0002

0,9989 1,0012 Solo Exacto

0,9983 0,9987 Solo Preciso

1,0000
Ni Preciso, Ni
0,9956 0,9991 exacto
 Instrumentos Métodos
“Calibrados” validados

Muestras
“Sesgo”
representativas
Algunos conceptos

Concepto Cualitativo Medición cuantitativa

Exactitud Error de medición
Grado de cercanía de una medición aislada con el Comprende tanto las influencias sistemáticas
“ valor verdadero” como aleatorias
Precisión Imprecisión (SD, CV)
Repetibilidad (en una corrida) Una medida de la dispersión de los errores
aleatorios
Precisión intermedia (largo plazo)
Reproducibilidad (interlaboratorial)
Veracidad Sesgo
Grado de cercanía de un valor medio con el “ valor Una medida del error sistemático
verdadero”
Exactitud
Veracidad, Exactitud y Precisión

Expresa la cercanía entre el valor que es aceptado, sea como un

valor convencional verdadero (material de referencia interno), sea
Veracidad como un valor de referencia (material de referencia certificado o
estándar) y el valor promedio obtenido al aplicar el procedimiento
de análisis un cierto número de veces.

Aplica a un conjunto de resultados de mediciones implica la

combinación de los componentes aleatorios y de un error
Exactitud sistemático común o de un componente de sesgo (Norma ISO
5725-1 e ISO 3534-1)

Grado de concordancia entre resultados de mediciones obtenidas

Precisión independientes bajo condiciones establecidas (repetibilidad y
reproducibilidad).
Precisión v/s Exactitud

Sesgo

Recuperación

EXACTITUD = VERACIDAD + PRECISIÓN

Determinación de la Veracidad: Sesgo

La diferencia entre la expectativa relativa a los resultados de un ensayo o una medición y el

valor verdadero. Es el error sistemático total en contraposición al error aleatorio.

Para determinar el sesgo puede utilizarse material de referencia, material fortificado,

material control, material ensayo de aptitud

Para este fin, se debe medir un analito de concentración conocida y se determina la

diferencia en valor absoluto entre el valor conocido y la media del valor obtenido

Una diferencia sistemática importante en relación al valor de referencia aceptado se

refleja en un mayor valor del sesgo, cuanto más pequeño es el sesgo, mayor veracidad
indica el método.
Determinación de la Veracidad: Sesgo

ഥ−𝐗
𝑺𝒆𝒔𝒈𝒐 = 𝐗 ഥ𝑎
Donde:
ഥ = lectura obtenida o valor promedio de las lecturas obtenidas.
𝐗
ഥ 𝑎 = valor asignado, valor certificado del material de referencia o valor esperado.
𝐗

ഥ𝑎 − 𝐗
[𝐗 ഥ]
𝒕𝒄𝒂𝒍𝒄 =
𝒔× 𝒏
Donde:
𝒕𝒄𝒂𝒍𝒄 = t observado o calculado
ഥ 𝑎 = Valor esperado o valor certificado en concentración
𝐗
ഥ = Promedio de valores leídos u observados en concentración
𝐗
𝒔 = Desviación estándar
𝒏 = Número de lecturas o valores observados
Determinación de la Veracidad: Sesgo
Lectura Resultado (mg/dL) (X - Xa) Sesgo ഥ = 20,38
1 20,4 20,4-20,1 0,3
𝑿
2 20,8 20,8-20,1 0,7
ഥ 𝒂 = 20,10
𝑿
3 20,6 20,6-20,1 0,5 𝒔 = 0,27
4 20,0 20,0-20,1 -0,1 n = 10
5 20,4 20,4-20,1 0,3
6 20,6 20,6-20,1 0,5 [20,10 − 20,38]
7 20,5 20,5-20,1 0,4 𝒕𝒄𝒂𝒍𝒄 =
8 19,9 19,9-20,1 -0,2 0,27 × 10
9 20,3 20,3-20,1 0,2
10 20,3 20,3-20,1 0,2 𝒕𝒄𝒂𝒍𝒄 = 0,32

𝟎, 𝟑𝟐 < 𝟐, 𝟐𝟔𝟐

No existen diferencias significativas

Recuperabilidad o Recuperación

Capacidad de un método de determinar todo 𝑪𝒆 − 𝑪𝒐

el analito presente en la muestra, según el 𝑹=
𝑪𝒂
alcance del método (algunos solo
determinan algunas especies del analito). Donde:
R = Recuperabilidad
Ce = es la concentración de analito de la muestra enriquecida.
La mejor manera de determinar la eficacia C0 = es la concentración de analito medida en la muestra sin
de extracción del método es adicionar adicionar.
diferentes concentraciones del analito a las 𝑪𝒂 = es la concentración de analito adicionado a la muestra
enriquecida.
muestras (muestra enriquecida) y
procesarlas por el método completo Expresada como porcentaje:
%𝑹 = 𝑹 × 𝟏𝟎𝟎
Se recomienda realizar a lo menos 6
mediciones (ideal 10) de cada uno, en lo
𝒕𝒄𝒂𝒍𝒄 = t observado o calculado
posible en tres niveles R = recuperabilidad
[100 − %R] 𝒔 = Desviación estándar de las
𝒕𝒄𝒂𝒍𝒄 =
Considerar LoD y uLoQ 𝒔× 𝒏 lecturas de %R
𝒏 = Número de lecturas o
valores observados
Recuperabilidad o Recuperación

1° Medición Lectura C0 Ca Ce R %R
1 9,11 3,00 12,01 0,967 96,7
2 9,08 3,00 12,07 0,997 99,7
3 8,94 3,00 12,14 1,067 106,7
4 8,78 3,00 11,84 1,020 102,0
Agregar
5 9,05 3,00 11,94 0,963 96,3
6 9,02 3,00 12,30 1,093 109,3
2° Medición 𝑪𝒆 − 𝑪𝒐
𝑹= %𝑹 = 𝑹 × 𝟏𝟎𝟎
𝑪𝒂

ഥ %𝑅 = 101,8
𝑿 Criterio de Aceptación: 85 - 115 %
Recuperabilidad o Recuperación

En caso de utilizar como criterio de aceptabilidad la prueba t:

ഥ %𝑅 = 101,8
𝑿 [100 − %R]
𝒕𝒄𝒂𝒍𝒄 =
𝒔× 𝒏
𝒔%𝑅 = 5,32

𝑛=6 𝒕𝒄𝒂𝒍𝒄 = 𝟎, 𝟏𝟑𝟕

0,137 < 2,571

ഥ %𝑅 = 101,8
𝑿 No existen diferencias significativas
Determinación de la Veracidad

1. Estimación del Sesgo

2. Ensayos de recuperación.
3. Comparación con métodos
de referencia.
4. Análisis de muestras de
referencia certificadas.
Comparación con métodos de referencia

• Se analizan muestras de pacientes por el

método en estudio y otro método de
comparación, luego se estima el error
sistemático basándose en las diferencias
observadas para ambos métodos.
• El método de comparación debe en lo posible
ser el de referencia (“gold standard”).
• Es una técnica cuyos resultados se han
comparado con métodos definitivos y/o
trazables a materiales estándar de referencia.
Comparación con métodos de referencia

Número de muestras a usar

• Mínimo de 40 para los dos test.
• Deben elegirse de modo de cubrir todo el rango de trabajo del método y
representar el espectro de patologías esperadas en la aplicación de rutina del
método.
• Es mejor realizar ensayos de las muestras por duplicado o triplicado (a partir
de varias alícuotas diferentes) en diferentes corridas o por lo menos en
diferente orden.

Período de tiempo:
• Mínimo de 5 días, lo ideal 20 días, corriendo 2 a 5 muestras de pacientes por
día.
Comparación con métodos de referencia

Análisis de datos:

Graficar los resultados y hacer una

inspección visual de los mismos.
• Cualquier muestra con resultados
discrepantes debe ser reanalizada.
• Para los métodos que se espera
coincidan hacer primero un
gráfico de “diferencias”. Las
mismas deberán oscilar alrededor
de la línea del cero.
Comparación con métodos de referencia

Cálculos estadísticos
• Para la comparación de resultados que cubren un amplio rango analítico lo
mejor es el cálculo de la regresión lineal.

• Permite estimar el error sistemático a más de una concentración de

decisión médica.

• También se puede calcular el coeficiente de correlación r que permite

saber si el rango de datos es lo suficientemente amplio para dar buenos
estimados de la pendiente y la ordenada en el origen (r > 0,99).
Análisis de muestras de referencia certificadas

• Se analiza un mínimo de 3 concentraciones y 5

determinaciones por el método a validar y se
compara el resultado obtenido con el valor
verdadero declarado.

Criterio de aceptación:
• El valor medio debe estar dentro del 15% del
valor nominal excepto en el Límite de
cuantificación (LoQ) que puede ser el 20%.
• Comparar con rangos de confianza del
fabricante
Veracidad
VERACIDAD Turbidimetría
Para determinación de haptoglobina

MRC Serodos Lote 0002 Replicado Valor

Haptoglobina (mg/dL) 1 101,0
n = 10 2 104,0
3 100,3
4 99,3
5 106,6
6 100,2
7 105,3
8 101,4
9 94,3
10 99,9

Media experimental 104,0

Media certificada 101,2
Veracidad
VERACIDAD Turbidimetría
Para determinación de haptoglobina
Valor Obtenido Valor MRC
Media 101,2 104
SD (s) 3,5 -

ഥ−𝝁 × 𝒏
𝑿
𝒕=
𝒔
𝟏𝟎𝟏, 𝟐 − 𝟏𝟎𝟒 × 𝟏𝟎
𝒕=
𝟑, 𝟓
𝒕 = 𝟏, 𝟒𝟖
No existe diferencia estadística significativa
1,48 < 2,232 y por lo tanto las muestras son iguales y
homogéneas (Existe Trazabiliadad)
Precisión
Precisión

Grado de concordancia entre resultados de mediciones obtenidas de una

serie repetida de análisis, sobre una muestra homogénea, bajo condiciones
establecidas (Norma ISO 3534).
Depende sólo de la distribución de errores aleatorios y no tiene ninguna
relación con el valor verdadero o el valor especificado.

Puede considerarse a tres niveles:

• Repetibilidad (en una corrida)
• Precisión intermedia (largo plazo) → reproducibilidad intralaboratorial
• Reproducibilidad (interlaboratorial)
Precisión

REPETIBILIDAD (REPETITIVIDAD): Precisión obtenida bajo las mismas

condiciones de operación en un intervalo corto de tiempo (mismo día), por
un mismo analista, en la misma muestra homogénea y en el mismo equipo.

PRECISION INTERMEDIA: Precisión obtenida dentro del laboratorio bajo

condiciones diferentes (diferentes analistas o equipos, días distintos), con la
misma muestra homogénea.

REPRODUCIBILIDAD: Expresa la precisión entre laboratorios como resultado

de estudios interlaboratoriales diseñados para estandarizar la metodología.
Precisión: Repetibilidad

Se estudia mediante experimentos de replicación.

El propósito es observar la variación esperada en el resultado de un test bajo las
condiciones de operación normales de un laboratorio.
Estima el error causado por factores como el pipeteo, condiciones de reacción, de
los sistemas, etc (Errores aleatorios)
Suele ser mayor en sistemas no automatizados.
Las muestras de ensayo comúnmente usadas son: soluciones estándar, materiales
de control, pooles de pacientes o muestras frescas de pacientes individuales.
Se emplean los resultados de 20 alícuotas de cada material y se calcula la media,
la desviación estándar y el coeficiente de variación.
Precisión: Repetibilidad

Muestra (pool)

Alícuotas

Análisis

Resultado A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 An
Análisis Estadístico de la Precisión

• Media:
σ 𝒙𝒊
ഥ=
𝑿
𝒏
• Desviación estándar
σ(𝑥𝑖 − 𝑥)ҧ 2
𝑠=
(𝑛 − 1)

• Coeficiente de variación
𝒔
𝑪𝑽 = × 𝟏𝟎𝟎
ഥ
𝑿
• Análisis de varianza F (comparación de la desviación estándar)
• Estudio homogeneidad muestra:
– Análisis de varianza (F)
– Prueba de t de Student.
Repetibilidad

Homogeneidad Muestra ഥ𝟏 − 𝑿
𝑿 ഥ𝟐
𝒕=
Replicado Muestra Contramuestra 𝒔𝑿ഥ 𝟏 𝑿ഥ 𝟐 × 𝟐Τ𝒏
n 10 10
1 104,7 98,7 Media 100,3 99,9
2 100,2 96,4 s 2,3 2,4 𝒔𝑿ഥ 𝟏 𝑿ഥ 𝟐 = 𝟎, 𝟓 × 𝒔𝟐 𝑿ഥ 𝟏 + 𝒔𝟐 𝑿ഥ 𝟐
3 98,75 103,5 %CV 2,28 2,42
4 102,6 99,2
5 97,5 97,3
6 99,5 98,0 𝒔𝑿ഥ 𝟏 𝑿ഥ 𝟐 = 𝟎, 5 × 2,32 + 2,42
7 100,1 101,3
8 101,7 100,2
𝒔𝑿ഥ 𝟏 𝑿ഥ 𝟐 = 2,351
9 100,9 100,8
10 97,3 103,4 100,3 − 99,9
𝒕=
2,351 × 2Τ10
𝒕 =0,423

0,423 < 2,262

No existe diferencia estadística significativa y por lo tanto las

muestras son iguales y homogéneas.
Repetibilidad

El criterio de aceptabilidad para la precisión se puede hacer en base a coeficiente de variación

de Horwitz (𝐶𝑉ℎ %):

𝐶𝑉ℎ % = 2[1−(0,5 𝑙𝑜𝑔 𝐶)]

Donde
C = Concentración nominal del analito expresado en potencia de 10, (ejemplo 1 mg/L = 106)

Se considera como repetibilidad (precisión intralaboratorio) aceptable

cuando la cuando el valor del CV experimental (CVr%) < CVh%/2
 Reproducibilidad

Replicado Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5

1 99,7 103,3 92,7 86,7 80,7
2 105,4 102,3 92,6 88,8 85,0
3 99,6 98,7 108,3 113,0 117,8
4 103,4 95,4 95,8 92,4 89,0
5 96,3 93,2 97,1 96,9 96,7
6 99,3 105,5 96,5 95,0 93,5

n 30
Media 97,0
s 4,5
%CV 4,64

https://www.socscistatistics.com/tests/anova/default2.aspx
Reproducibilidad

Si F < P, no existe
diferencia estadística
significativa en las
mediciones de los
grupos.
Reproducibilidad

El criterio de aceptabilidad para la precisión se puede hacer en base a coeficiente de variación

de Horwitz (𝐶𝑉ℎ %):

𝐶𝑉ℎ % = 2 × 2[1−(0,5 𝑙𝑜𝑔 𝐶)]

Donde
C = Concentración nominal del analito expresado en potencia de 10, (ejemplo 1 mg/L = 106)

Se considera como reproducibilidad interlaboratorio aceptable cuando el

valor del CV experimental (CVR%) < 2CVh%/3
Repetibilidad

Valor asignado = 10,3 mg/L (0,0000103) Replicado Día C obtenida mg/L Replicado Día C obtenida mg/L
1 1 10,3 11 5 9,6
2 1 9,9 12 5 9,1
Valor Obtenido
3 2 9,7 13 6 10,0
Media 9,9
4 2 10,0 14 6 10,1
SD (s) 0,4
5 2 9,3 15 6 9,1
CV(%) 4,39 6 3 10,1 16 7 9,9
7 3 10,3 17 7 10,3
8 4 11,2 18 8 11,0
2 × 2[1−(0,5 𝑙𝑜𝑔 𝐶)] 9 4 9,3 19 9 10,5
𝐶𝑉ℎ % =
3 10 4 9,0 20 9 10,1

2 × 2[1−(0,5 𝑙𝑜𝑔 0,0000103)]

𝐶𝑉ℎ % =
3
13,974
𝐶𝑉ℎ % =
3
Se cumple el criterio de aceptabilidad
𝐶𝑉ℎ % = 4,66 4,39 < 4,66
establecido.