Examen práctico A

ANATOMIA Y FISIOLOGIA VEGETAL

Aislamiento y Cultivo in vitro de Meristemos de Rosa

grandinflora

Introducción
En la actualidad, diversas plantas de interés agroalimentario, medicinales, ornamentales y
forestales, se propagan por técnicas cultivo in vitro de meristemas, para erradicar infecciones
por virus y obtener semilla certificada libre de enfermedades patógenas (virus principalmente) y
mejorar su productividad.
La técnica de cultivo de meristemas se fundamenta en el hecho de que la distribución de los
microorganismos (virus, bacterias y micoplasmas) en los tejidos de la planta no es uniforme y
su concentración tiende a disminuir progresivamente hacia el ápice del tallo, por tanto, la
posibilidad de que en las células del meristema se encuentre menor número de partículas
virales o estén libres de éstas son mayores que en los tejidos más diferenciados de la planta.
El término de “cultivo de meristemas”, se utiliza para designar a fragmentos de tejidos en un
rango de 0,1 mm. hasta 1 cm. Sin embargo para el cultivo aséptico y el saneamiento este
término implica el aislamiento del domo meristemático más el primer primordio foliar en un
rango de 0.1 – 0.5 mm. a partir de este tamaño se considera cultivo de meristemas.
Las plántulas obtenidas por meristemas, se micropropagan clonalmente en medios de cultivo
suplementados con 6-BAP (citoquinina) , luego se transfieren a un medio de cultivo
suplementado con IAA (auxina) para el enraizamiento, a continuación se aclimatan a
condiciones ambientales en el invernadero, donde se llevan a cabo los análisis de certificación
utilizando plantas indicadoras para determinar si son libres de virus, si los resultados son
negativos entonces están aptas para ser transferidas al campo definitivo de producción.
En el cultivo in vitro de meristemas hay que tener en cuenta los siguientes factores:
 El medio de cultivo debe tener nutrientes necesarios (sales minerales, fuente de
carbono para la fotosíntesis, vitaminas y fitohormonas), para que las células vegetales
puedan desarrollarse con normalidad. El medio de cultivo más empleado es el
diseñado por Murashige y Skoog (MS).
 pH del medio de cultivo mantener en un rango de 5 - 6,5.
 Asepcia absoluta – trabajar en la cámara de flujo laminar.
 Temperatura en la sala de crecimiento entre 18 - 26ºC (aire acondicionado)
 Humedad relativa en el cultivo entre 75 – 80%
 Fotoperíodo – 16 horas luz fluorescente (1000 – 3000 lux).
Objetivos:
 Aislar, reconocer e introducir in vitro meristemos de Rosa grandiflora, para la
obtención de plantas libres de virus (certificada)
 Aplicar la técnica de cultivo in vitro de meristemas en la micropropagción de plantas.
Materiales y equipos:
1. Material biológico:
 Ramas con yemas de rosa grandinflora.
2. Equipos e instrumentos:
Estereoscopio binocular 2 tubos con plàntulas in vitro
 Pinzas cortas de punta roma
 Mangos de bisturí Nº. 7
 Hojas de bisturí de punta fina
 Tubos de prueba con medios de cultivo MS
 Placas Petri
 Parafilm
3. Medio de Cultivo
 Murashigue y Skoog (MS) suplementado con tres fitohormonas:
benzilaminopurina (6-BAP), indol acido acético (IAA) y 2,4 diclorofenoxiacético
(2,4D)(auxinas) (, vitaminas, sacarosa y Phytagel.
TAREA 1: Aislamiento, reconocimiento de las partes del meristema e introducción in vitro de
meristemas de Rosa grandiflora (30 Puntos). Para desarrollar esta tarea Ud. cuenta con todos
los instrumentos indispensables y los monitores que lo asesoraran.
Las células meristemáticas son morfológicamente indiferenciadas, pero especializadas en la
función de dividirse ordenadamente, su estructura y fisiología son muy diferentes a las de
cualquier otra célula de la planta.
Los meristemos se clasifican por su localización en la planta en: meristemos apicales,
meristemos laterales y meristemos intercalares. Teniendo en cuenta el tiempo de aparición del
meristema, también se clasifica en primarios y secundarios. Los meristemos apicales son
primarios, mientras los laterales son secundarios y se encuentran protegidos por los primordios
foliares que lo envuelven formando las yemas.
PROCEDIMIENTO:
1. Toma la muestra (tallo con yemas) y con ayuda del bisturí corta una yema
2. Colocar la yema en placa Petri
3. Toma la pinza con la mano izquierda y sujeta la yema por la parte basal.
4. Toma el bisturí con la mano derecha y separe o elimine las hojas externas de la yema
visualmente (sin estereoscopio).
5. Coloque la muestra en la placa Petri y enfoque en el estereoscopio binocular
6. Fije la muestra en la placa Petri con el bisturí de la mano izquierda por la parte basal.
7. Con la ayuda del bisturí de la mano derecha, elimine con sumo cuidado las hojas que
faltan aislar de la muestra, hasta encontrar y dejar libre sólo el meristema más uno ó
dos primordios foliares.
8. Con la ayuda del bisturí y sin perder de la vista, aisle el meristema con dos primordios
foliares.
9. Observa cuidadosamente el meristema aislado para identificar sus partes.
10. Abre el tubo de ensayo con medio de cultivo
11. Siembra o introduce el meristema en el tubo de ensayo en el medio de cultivo, trate de
hundir suavemente el meristemo.
12. Selle el tubo con papel parafilm y rotule con el plumón indeleble, colocando su código
de examen.
13. Reconoce la estructura del meristema aislado en el siguiente esquema y señale entre
el paréntesis el número que corresponde a cada parte indicada.
14.

4 2

1
5
a) Procambium: ( )
b) Meristema fundamental: ( )
c) Túnica: ( )
d) Primordio foliar: ( )
e) Corpus: ( )

TAREA 2: En su mesa Ud. tiene 3 tubos de ensayo con plantas in vitro, observa detenidamente
y marque las respuesta correctas. (10 Puntos):
1) En el tubo Nº 1, ¿qué cambios observa y que hormonas lo causa?
a) Organogénesis directa, citoquinina
b) Organogénesis indirecta, citoquinina
c) Organogénesis directa,auxina
d) Organogénesis indirecta, auxina
e) Diferenciación celular, ácido giberélico, auxina
2) En el tubo Nº 2 ¿Quéé cambios observa y que hormonas lo ocasiona?
 a) Organogénesis, IBA, ácido giberelico, auxinas
b) Embreogénesis, auxinas
c) Organogénesis, auxinas
d) Diferenciación celular, auxinas
e) Desdiferenciación celular, auxinas
3) En el tubo Nº 3 ¿qué cambios observa y que hormonas lo induce?
a) Organogénesis directa, Kinitina, ácido giberélico y citoquinina
b) Organogénesis indirecta, auxina,
c) Desdiferenciación celular, auxina,
d) Embreogénesis, Kinitina, ácido giberélico,citoquinina
e) Diferenciación celular, citoquinina
TAREA 3
Determine la divisiòn y el grupo al cual pertenece la planta de donde proviene
el meristemo aislado.

Divisiòn: Grupo:

a)Angiospermas a)Monocotiledoneas
b)gimnospermas b)Dicotiledoneas

Una vez terminada con las tareas, levante la mano.