Mónica Marrero Almeida

Máster en Biología Molecular

Semana 17-22

Módulo 2: Proteínas

ACTIVIDAD/CASO PRÁCTICO

Hemos descubierto una variedad de un vegetal, que aparentemente es capaz de

crecer en terrenos de elevada salinidad. Estamos interesados en descifrar los
mecanismos que confieren a esta variedad estas capacidades extraordinarias, ya que
permitiría la repoblación de ciertos terrenos desérticos.

En el laboratorio disponemos de un completo equipamiento para la realización de todo

tipo de técnicas proteómicas.

Describe los pasos que darías y explica de forma detallada las técnicas proteómicas
que utilizarías para caracterizar el misterioso mecanismo molecular que permite a la
planta crecer.
INTRODUCCIÓN
La investigación proteínica consiste en el estudio de las proteínas y sus propiedades.
Las proteínas desempeñan un papel vital en los organismos vivos e intervienen en una
amplia gama de procesos biológicos. Existen muchas técnicas para estudiar las
propiedades de proteínas individuales o las interacciones entre proteínas. Las proteínas
difieren entre sí por su tamaño, estructura molecular y propiedades fisicoquímicas. Estas
diferencias permiten el análisis y la caracterización de las proteínas mediante separación
e identificación.

Comenzamos con una muestra de sangre, células, cultivos, etc. con proteínas. Para
seguir el estudio se debe lisar o romper la célula con la muestra alterándola y
extrayendo la fracción proteica que queremos, es fundamental porque se procesan por
métodos mecánicos, químicos o enzimáticos que pueden afectar a la integridad y a la
actividad de la proteína o degradarlas.

Luego la purificación es para aislar un solo tipo de proteína, es muy importante para
la caracterización de las funciones, estructuras e interacciones. También se pueden
fraccionar, separando las proteínas en fracciones según sus propiedades: carga,
tamaño, afinidad, etc. Para esto se utilizan varias técnicas como:

- Electroforesis: Se basa en dividir las proteínas por su carga. Estimando su

pureza y su peso molecular.
- Cromatografía: Se fracciona según su carga, tamaño y afinidad.
- Western-Blot: Se separa según su tamaño y se visualiza según la proteína
diana que queramos por anticuerpos.
- Inmunofluorescencia: Utiliza anticuerpos fluorescentes unidos al antígeno diana
produciendo fluorescencia cuando se une.
- Inmunohistoquímica: Identifica componentes de tejidos por la unión de
antígenos con anticuerpos marcados. Visualizando su distribución y distribución de
la célula y del tejido.
- Proteómica: Estudia las funciones, estructura e interacciones de las proteínas.

Después se deben cuantificar para averiguar la concentración a la que se trabaja. Se

suele utilizar el método Bradford.

Por último se deben analizar todos los datos resultantes y compararlos con una base
de datos confiable, para sacar una conclusión del estudio realizado.
 Para realizar esta actividad me he basado principalmente en la tesis de Hernández y
Salvador (2011) que enuncia el análisis proteómico de la hoja de amaranto bajo
condiciones de estrés salino. Utilizando los geles de electroforesis bidimensional (2-DE)
en las hojas de las plantas para averiguar la tolerancia natural a la salinidad de las
plantas.

Primero debemos tener en cuenta la clasificación de plantas halofíticas y glicofíticas,

las halofitícas pueden crecer en concentraciones de 400 mM de NaCl y las glicofíticas,
son tolerantes a la salinidad desarrollándose en 50 mM de NaCl.

También es importante saber cómo afecta la salinidad en altas concentraciones a las

plantas. Las vacuolas no pueden excluir los iones de Na+ y Cl- pudiendo causar
toxicidad y afectando al crecimiento y a las proteínas.

Para el estudio se cultivaron 5 grupos de plantas de amaranto, el primero es como

control (sin tratamiento) y los otros 4 están tratados con 150 mM de ClNa y se van
tomando muestras de hojas a 1h, 10h, 24h y 7 días. Luego el material fue congelado con
N2 líquido, moliéndose y manteniéndose a -80ºC hasta su uso.

Se pueden realizar varias técnicas como:

- Determinación de las concentraciones de prolina y azúcares totales de las

hojas.

- Extracción de proteínas totales de las hojas.

Para la extracción de proteínas totales de las hojas, previamente se ha recolectado la

muestra (hojas) y se ha congelado. Luego a la muestra se le añade una solución con la
que se agita y centrifuga para filtrar el sobrenadante. Se vuelve a centrifugar para
generar una pastilla que se lava para limpiar impurezas y secarla. Posteriormente se
resuspenden y se rehidratan. Para determinar la concentración de proteínas totales con
la solución de Protein Assay y utilizando BSA como estándar y se realiza por triplicado.

- Electroforesis en doble dimensión (2-DE) de las proteínas de las hojas.

Se realiza la primera dimensión por isoelectroenfoque, con tiras rehidratadas de la

muestra durante 16h a temperatura ambiente y luego se almacenan a -20ºC.
Posteriormente se equilibran durante 15 min. Después se transfiere a geles de
poliacrilamida al 13%, haciéndolo por triplicado y tiñendolo.
 - Adquisición y análisis de imágenes de los geles 2 DE.

Se adquieren las imágenes mediante un sistema (PharosFX Plus) y analizan

mediante otro programa (Melanie v.7.0). La detección de las manchas de proteínas se
realiza substrayendo el fondo e identificando la mancha en cada gel. El peso molecular
(PM) se determina con respecto al marcador de peso molecular y el punto isoeléctrico
por la migración de las tiras de gradiente de pH.

Imagen 1: Perfil en 2-DE de las proteínas de la planta problema. Las flechas indican las manchas (+/-
50% con respecto al control).

- Espectrometría de masas de las manchas de proteínas.

Las manchas seleccionadas se cortaron del gel 2-DE, se lavaron para remover los
posibles contaminantes. Luego los fragmentos se secan en el evaporador. La digestión
se lleva a cabo durante toda la noche a 37ºC con tripsina porcina. Los fragmentos
resultantes se lavan y se desalan. Los péptidos se separan por nano Cromatografía de
Líquidos de Ultra Presión (nano UPLC). La interpretación de los datos de masa y carga
(m/z) por MASCOT v2.2. y la búsqueda se realizó contra una base de datos (NCBInr).
Imagen 2: Abundancia relativa de las manchas diferenciales. Los histogramas muestran las diferencias en
la cantidad de proteína de la hoja mediante espectrometría de masas. El histograma A va de la mancha 6
a la 68, el B de 69 a 113 y el C de 115 al 258.
 En conclusión, se debe someter la planta problema a 2 situaciones: una con
salinidad y otra sin salinidad (muestra control). Luego recolectar hojas de cada una de
ellas y procesarlas mediante electroforesis 2-DE y espectrometría de masas y por último
analizarlas y compararlas con una base de datos para sacar las conclusiones de que
proteínas interactúan cuando sometemos a la planta a alta salinidad.

BIBLIOGRAFÍA
Apuntes del Máster

Detección, cuantificación y análisis de proteínas. (s. f.).

https://es.moleculardevices.com/applications/protein-detection-quantitation-and-analysis

Hernández, M. E., & Salvador, C. (2011). Análisis proteómico de la hoja de amaranto bajo

condiciones de estrés salino. https://repositorio.ipicyt.edu.mx/handle/11627/2974

Merk. (s. f.). Extracción de proteínas. Merck. https://www.merckmillipore.com/ES/es/life-

science-research/protein-sample-preparation/protein-

extraction/ZHWb.qB.hNgAAAE_NNF3.Mm0,nav

Preparación de muestras de proteínas: purificación, extracción, concentración de proteínas.

(s. f.). https://www.merckmillipore.com/ES/es/life-science-research/protein-sample-

preparation/fZCb.qB.8fEAAAE_RJJ3.Mmp,nav

www.tiarisbiosciences.com. (2024, 4 enero). Investigación de proteínas - Tiaris Biosciences.

Tiaris Biosciences. https://tiarisbiosciences.com/es/products-services/protein-research/