Informe De Laboratorio Nº 2

Informe De Laboratorio Nº 2

Iniciación de un cultivo de callos de zanahoria (Daucus Carota L.)

1. Introducción

El cultivo in vitro de plantas puede definirse como el cultivo de células, tejidos, órganos,
embriones y plantas enteras, en condiciones asépticas, dentro de recipientes adecuados
conteniendo un medio nutritivo y en un ambiente controlado, cuyo objetivo es la formación
de células o productos deseados (Cañal et al., 2001).

El callo es un tipo de tejido que se forma como respuesta a una lesión o corte en una planta.
En otras palabras, es como una agrupación de células que crece a partir de la zona dañada de
una parte de la planta. Los callos generalmente consisten en células que son frágiles, largas
y llenas de vacuolas, lo que significa que están altamente especializadas, pero no están
organizadas de manera ordenada. Algunas veces, los callos pueden ser sólidos y densos,
pueden contener áreas con pequeños grupos de células que tienen la capacidad de regenerar
y desarrollar nuevos brotes o raíces (Randel et al., 2015). En esencia, estas células no
especializadas, llamadas células meristemáticas, son capaces de iniciar procesos como la
formación de embriones vegetales o el crecimiento de nuevos órganos en la planta.

Las células meristemáticas son un tipo especializado de células vegetales que desempeñan
un papel central en la organogénesis y el crecimiento de las plantas. Estas células tienen la
capacidad única de dividirse de manera activa y continua, lo que significa que pueden generar
una amplia variedad de tipos celulares especializados. Su importancia en la organogénesis
radica en su capacidad para formar los tejidos y órganos fundamentales de la planta, como
raíces, tallos y hojas. Estas se encuentran en regiones específicas llamadas meristemos, que
son áreas de crecimiento activo en las plantas. Aquí, estas células trabajan para producir
nuevas células que se diferenciarán en diferentes tipos celulares y, finalmente, darán lugar a
la formación de estructuras vegetales maduras (Taiz, & Zeiger, 2007).

El Medio MS, desarrollado por los científicos Murashige y Skoog, es una formulación de
medio de cultivo ampliamente utilizada en la biotecnología vegetal y la investigación en
ciencias vegetales. Este medio se compone de una mezcla equilibrada de sales minerales,
azúcares y nutrientes esenciales que proporcionan un entorno óptimo para el crecimiento y
desarrollo de tejidos vegetales in vitro, como cultivos de callos, explantes y plántulas
(Phillips & Garda, 2019). El Medio MS es conocido por su versatilidad y capacidad para
 Informe De Laboratorio Nº 2

inducir la proliferación celular y la diferenciación en una amplia variedad de especies

vegetales.

Esta práctica proporciona una oportunidad para comprender los procesos de cultivo de tejidos
vegetales, que son esenciales en la propagación de plantas, y puede ser una base para futuras
investigaciones en áreas de biotecnología vegetal y la producción sostenible de cultivos.

1.1 Hipótesis
Se espera que, al colocar fragmentos de zanahoria en un entorno de cultivo
específico y controlado, dentro de condiciones de laboratorio (in vitro), se pueda
inducir la formación de callos. Este fenómeno sugeriría la capacidad de las células
vegetales para reorganizarse y generar tejido no especializado. Además, se espera
que factores como la composición del medio de cultivo, los reguladores de
crecimiento y la duración de la exposición tengan un impacto significativo en la
eficacia de la formación de callos en diversos medios de cultivo.
1.2 Objetivo general
Observar el efecto de distintos reguladores de crecimiento sobre el desarrollo de
tejido meristemático en callos de zanahorias (Daucus carota L.).
1.3 Objetivos específicos
 Analizar la morfología y el desarrollo de callos generados en los explantes
de zanahoria.
 Evaluar el efecto de distintas combinaciones de nutrientes y reguladores
de crecimiento en el medio de cultivo

2. Metodología
2.1 Materiales
Tabla 1. Materiales y equipos utilizados
Materiales Función
Placa Petri con Medio MS (Murashige y Medio de cultivo con tratamiento.
Skoog) solidificado con agar 0.7% y
diferentes concentraciones de ácido
 Informe De Laboratorio Nº 2

naftalen acético (ANA) y

bencilaminopurina (BA)
Cajas Petri Almacenamiento del medio de cultivo.
Cámara de flujo laminar Mantener el ambiente libre de
contaminantes externos.
Mechero de alcohol Esterilización del asa previo y posterior
a la inoculación
Incubadora Control de la temperatura.
Bisturí Realización de cortes.
Pinzas Manipulación de los explantes.
Vaso precipitado Para sostener los segmentos en la
desinfección.
Fuente. Elaboración propia.

2.2 Métodos
 Preparación de los medios

Primeramente, se preparó medio MS (Murashige y Skoog) solidificado con agar 0.7% y

diferentes concentraciones de ácido naftalen acético (ANA) y bencilaminopurina (BA).

Tabla 2. Concentraciones de los tratamientos para la práctica.

Tratamiento ANA (mg/L) BA(mg/L)

Control (CK) 0 0
ANA 1 0
BA 0 1
ANA+BA 1 1
Fuente. Elaboración propia

 Preparación de muestras

Se seleccionaron raíces en buen estado y mecánicamente ilesas. Estas raíces se lavaron

utilizando jabón y agua corriente del grifo, frotándolas con un cepillo para quitar cualquier
suciedad o impureza. Luego, se tomaron segmentos de 10 centímetros de estas raíces y se
sumergieron en una solución de lavandina comercial al 20% (v/v) durante un período de 20
 Informe De Laboratorio Nº 2

minutos para desinfectarlas. Posteriormente, se enjuagaron tres veces con agua destilada
estéril, manteniendo cada enjuague durante tres minutos para asegurarse de que no quedaran
residuos de la solución desinfectante en las raíces.

 Siembra de explantes en campana de flujo laminar

Después de desinfectar los segmentos de zanahoria, los trasladamos a una placa petri estéril
en una campana de flujo laminar para continuar con el proceso de cultivo, el cual se realizó
el miércoles 16 de agosto de 2023. Se cortó 1 centímetro de cada superficie de corte del
segmento que estuvo en contacto con la lavandina y se desechó. Luego, se transfirió la
sección restante a una placa petri estéril. A continuación, se realizaron cortes de secciones
transversales de 2 mm de espesor de los segmentos de la raíz y se extirpó piezas uniformes
de 5x5 mm que contenían el cambium en la parte central de cada sección.

Después de cada manipulación se sumergió el bisturí y las pinzas en etanol al 96 % y se pasó

la punta de las herramientas a través de la llama rápidamente para evitar contaminación en la
muestra. En total se colocaron 6 explantes con la parte de corte basal del segmento en
contacto con medio en cada placa petri.

Por último, se cubrieron las placas con film plástico y se las transfirió a la incubadora, donde
se cultivaron en la oscuridad a una temperatura 25 ºC.

Figura 1. Siembra de explantes en medios con tratamiento.

 Informe De Laboratorio Nº 2

3. Resultados
3.1 Semana 1

En la semana correspondiente al 23 de agosto de 2023 pasada una semana de la siembra de

los explantes, las muestras se mantuvieron sin alteraciones evidentes y no se observó ningún
signo de contaminación en el medio de cultivo de las placas (Tabla 3). Por lo tanto, se obtuvo
un 0% de contaminación y 0% de desarrollo de callos en dicha semana.

Tabla 3. Control de placas en la semana 1.

Control Bencilaminopurina (BA) Ácido naftalen acético (ANA) ANA+BA

Fuente. Elaboración propia.

3.2 Semana 2

En la semana correspondiente al 30 de agosto de 2023, se observaron cambios significativos.

Se observó que tanto la placa de control como la placa de Petri con el tratamiento ANA
estaban contaminadas con bacterias (Tabla 4). En la placa con tratamiento ANA, la
contaminación se encontraba en uno de los seis explantes, lo que podría tener un impacto
negativo en la eficiencia del desarrollo de los callos. Por esta razón, se decidió desechar
ambas placas, ya que las bacterias presentes estaban consumiendo los nutrientes necesarios
para el crecimiento del tejido, en lugar de permitir que los callos se desarrollaran
adecuadamente.
 Informe De Laboratorio Nº 2

Tabla 4. Control de placas en la semana 2.

Control Bencilaminopurina (BA) Ácido naftalen acético (ANA) ANA+BA

Fuente. Elaboración propia.

 Placa sin contaminación

Figura 2. Medio MS con bencilaminopurina (BA)

La placa con tratamiento BA se encontraba intacta, sin rastro de contaminación. El tamaño

de los explantes era el mismo, pero fue separada para su observación.
 Informe De Laboratorio Nº 2

 Placa con crecimiento de callo

Figura 3. Medio MS con bencilaminopurina (BA) y ácido naftalen acético (ANA)

La placa que contenía ambos tratamientos BA como ANA presentó cambios notables en su
morfología. Se observó un cambio en el tamaño de los explantes, con un aumento en la
longitud debido al crecimiento celular.

Al examinar los explantes, se notó que habían crecido considerablemente en comparación

con su tamaño original al momento de la siembra. En los extremos de los explantes, se
evidenció un crecimiento que resultó en bordes curvados y una ligera inclinación hacia arriba.
Esta curvatura fue más evidente cuando se observaron los explantes desde abajo o desde un
lado, y fue el resultado del crecimiento celular en curso (Figura 3).

En la semana 2 se registró:

Tabla 5. Porcentaje de contaminación y desarrollo de callos en las placas petri.

Tratamiento Contaminación Desarrollo de callos

Control 45% 0%

BA 0% 0%

ANA 15% 0%

ANA+BA 0% 60%

Fuente. Elaboración propia.

 Informe De Laboratorio Nº 2

El control experimentó la mayor tasa de contaminación, con un 45% de las muestras

afectadas. Mientras que el medio que contenía la combinación de BA y ANA mostró un
incremento del 60% en el desarrollo de callos en comparación con los otros tratamientos.

3.3 Semana 3

En la tercera semana, que corresponde al 7 de septiembre de 2023, se tomó la decisión de

descartar la placa que estaba con tratamiento BA debido a la presencia de contaminación
bacteriana y fúngica, además de la ausencia de desarrollo de callos en esta placa. En ese
punto, solo quedaba una placa para llevar a cabo el registro de datos, que era aquella tratada
con BA y ANA. Hasta la tercera semana, esta placa no mostró señales de contaminación y
se pudo observar un crecimiento de callos en todos los explantes que se habían sembrado
(Figura 4). Los callos presentaban un tamaño más grande y una textura más densa en
comparación con las semanas anteriores, y se notaba un mayor crecimiento celular en los
extremos de los explantes (Figura 5).

Figura 4. Vista lateral del medio MS con tratamiento ANA+BA.

 Informe De Laboratorio Nº 2

Figura 5. Desarrollo de callos del medio MS con tratamiento ANA+BA.

En la semana 3 se registró:

Tabla 6. Porcentaje de contaminación y desarrollo de callos en las placas petri.

Tratamiento Contaminación Desarrollo de callos

BA 40% 0%

ANA+BA 0% 100%

Fuente. Elaboración propia.

En la segunda semana, tanto la placa de control como la placa con tratamiento ANA se
eliminaron debido a la presencia de contaminación. Durante esta semana, la placa tratada con
BA mostró un alto grado de contaminación, llegando al 40%, y no se observó desarrollo de
callos por lo cual dicha placa fue desechada. Sin embargo, en contraste, la placa que contenía
el tratamiento ANA+BA permaneció libre de crecimiento microbiano hasta la tercera
semana, indicando una adecuada manipulación durante la siembra. Además, se logró un
desarrollo del 100% en la formación de callos, ya que los seis explantes presentaron cambios
morfológicos notables.

En estos explantes hubo un crecimiento en el tejido parenquimático, estas células al ser

altamente divisibles y versátiles, tienen la capacidad de responder a estímulos específicos,
como la exposición a reguladores de crecimiento. A través de la proliferación celular, las
células parenquimáticas se multiplican rápidamente, dando origen a los callos.
 Informe De Laboratorio Nº 2

4. Discusión
 Crecimiento a partir del cambium

El cultivo se realizó utilizando células del cambium de zanahoria. Estas células del cambium
tienen características citológicas típicas de células meristemáticas, lo que significa que son
células en estado indiferenciado con la capacidad de dividirse y desarrollarse en diversos
tipos celulares. Estas células se originan a partir de la desdiferenciación de células
parenquimáticas o de colénquima. Tienen una forma alargada y se encuentran en la corteza
del tallo, formando un cilindro continuo o placas a diferentes profundidades desde la
superficie. Esta particularidad facilita el crecimiento de callos y la posterior regeneración de
plantas a partir de cultivos de tejidos (Botti, 1978). Los callos de zanahoria son altamente
relevantes en la investigación debido a su capacidad única de regeneración y diferenciación
celular, lo que los convierte en un modelo de estudio valioso.

 Reguladores de crecimiento

Los reguladores de crecimiento son compuestos químicos que actúan como señales y
controladores clave en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Estos compuestos influyen
en una variedad de procesos vitales, como la división celular, la elongación, la diferenciación
de tejidos, la floración y la respuesta a factores ambientales. Estos pueden ser producidos
naturalmente por las plantas o sintéticamente para su uso en la agricultura y la horticultura.
Su aplicación estratégica y controlada tiene un impacto significativo en la modificación de
características de las plantas, la propagación vegetativa, la mejora genética y la producción
de cultivos. os resultados en la generación de callos están influenciados significativamente
por la concentración de los reguladores de crecimiento presentes en el medio de cultivo. La
concentración de estos es un factor importante que determina el tipo de respuesta celular y el
desarrollo de los callos. Concentraciones adecuadas de reguladores de crecimiento pueden
estimular la formación de callos, mientras que concentraciones insuficientes o excesivas
pueden inhibir o desencadenar respuestas no deseadas.

 Desarrollo de callos en diferentes tratamientos

La placa control y la placa con tratamiento ANA se descartaron por contaminación. Por otro
lado, se observó un progreso favorable en la placa que contenía el medio con tratamiento
 Informe De Laboratorio Nº 2

ANA+BA (auxina y citoquinina) en contraste con la placa que tenía únicamente tratamiento
con BA (auxina). Esta última, aunque se mantuvo libre de contaminación en las primeras
semanas, no logró generar callos en el período esperado, sin embargo, la placa que contenía
los explantes con ambos tratamientos desarrollaron callos observables desde la segunda
semana.

La falta de desarrollo de callos de zanahoria en el medio que contenía solo citoquininas puede
deberse a varios factores. Las citoquininas son fitohormonas que tienden a promover la
diferenciación y el crecimiento de brotes y otros tejidos más diferenciados, en lugar de la
proliferación celular inicial que se requiere para la formación de callos. En un medio con solo
citoquininas, es posible que las células no reciban el estímulo adecuado para dividirse y
formar una masa celular inicial que caracteriza a los callos (Bustamante et al., 2012). Para
inducir eficazmente la formación de callos, generalmente se requiere una combinación de
reguladores de crecimiento, como auxinas y citoquininas. Las auxinas son responsables de
estimular la división celular inicial y la formación de una masa celular no diferenciada,
mientras que las citoquininas actúan posteriormente en la diferenciación de esos callos en
tejidos específicos. La falta de auxinas en un medio con solo citoquininas puede limitar la
capacidad de las células para comenzar el proceso de formación de callos (Sanders et al.,
2007).

 Contaminación

Uno de los principales desafíos radica en la posible contaminación de los cultivos, que puede
ocurrir por dos razones: la presencia de microorganismos que afectan la superficie o el
interior del explante (llamados endófitos) y la introducción de microorganismos durante la
manipulación en el laboratorio, generalmente debido a acciones del operador. Los tipos de
contaminantes más comunes son hongos, bacterias y levaduras, mientras que los menos
frecuentes incluyen virus, viroides y microartrópodos, como los ácaros (Cuevas et al., 2004).
Dado que la viabilidad del explante apenas varió, se presume que la contaminación de las
tres placas no fue interna, sino que se debió a una manipulación incorrecta durante el proceso,
ya sea en la siembra o en la desinfección del explante.
 Informe De Laboratorio Nº 2

5. Conclusión

Para que el callo pudiera desarrollarse en las mejores condiciones posibles, era esencial
mantener un entorno completamente libre de contaminación, de modo que las células
vegetales no compitieran por nutrientes con otros microorganismos. En muchos casos, los
grupos no lograron obtener callos sin contaminación, y en algunos casos ni siquiera lograron
iniciar el desarrollo de callos debido a que no trabajaron desde el principio en condiciones
adecuadas de esterilidad.

Existen varios factores que influyen en la obtención exitosa de callos vegetales. En primer
lugar, es fundamental trabajar con un explante joven que contenga células con un alto
potencial de totipotencialidad o la capacidad de convertirse en diferentes tipos celulares.
Además, mantener condiciones de esterilidad adecuadas es esencial para prevenir la
contaminación de microorganismos no deseados. El tiempo de desinfección de las zanahorias
también debe ser controlado cuidadosamente, ya que un tiempo prolongado puede permitir
que el desinfectante penetre en el interior y dañe más células de las necesarias. Por último,
es crucial equilibrar las cantidades de reguladores de crecimiento, como las auxinas y las
citoquininas, ya que esta proporción determinará en gran medida si se logra o no la formación
de callos de manera exitosa.

La combinación de auxinas y citoquininas se revela como un enfoque altamente beneficioso

y efectivo para el desarrollo de callos vegetales. La presencia de auxinas estimula la
proliferación celular inicial y la formación de una masa celular no especializada, mientras
que las citoquininas posteriormente promueven la diferenciación de estos callos en tejidos
específicos, como brotes y hojas. Esta combinación proporciona un equilibrio óptimo para la
formación de callos organizados y con el potencial de regeneración en plantas completas.
Los resultados respaldan la importancia de una relación adecuada entre estos reguladores de
crecimiento en el medio de cultivo, lo que se traduce en un éxito significativo en la
micropropagación y la manipulación de tejidos vegetales.
 Informe De Laboratorio Nº 2

6. Referencias
1. Cañal, M. J., Rodríguez, R., Fernández, B., Sánchez-Tames, R., & Majada, J.
P. (2001). Fisiología del cultivo in vitro. Biotecnología vegetal, 1(1).
2. Randel, M., Chong-Pérez, B., & Pérez-Alonso, N. (2015). Organogénesis in
vitro en el género Digitalis. Biotecnología vegetal, 15(4).
3. Taiz, L., & Zeiger, E. (2007). Fisiologia vegetal (Vol. 10). Universitat Jaume.
4. Phillips, GC y Garda, M. (2019). Medios y prácticas de cultivo de tejidos
vegetales: una descripción general. In Vitro Biología celular y del desarrollo-
Planta, 55, 242-257.
5. Botti, C. (1978). Estudio anatómico de la formación de callo
en. AGRICULTURA TECNICA (CHILE), 38, 98-102.
6. Bustamante, G., Imata, J., Linares, L., Mostajo, D., Pacheco, R., & Vilca, A.
(2012). Efectos de las fitohormonas (auxinas, giberelinas y citoquininas) en
el crecimiento de hipocótilos de Caesalpinea spinosa (Molina) Kuntze
“Tara”. Curso de Fisiología Vegetal. Universidad Nacional de San Agustín,
Arequipa, Perú.
7. Sanders, C. B., Hernández, P. E. M., & Nieto, J. A. U. (2007). Enraizamiento
y formación de callos en estacas de siete especies del género
Bursera. Agrociencia, 41(1), 103-109.
8. Cuevas, M. C. S., & Salaverría, J. L. (2004). Control de la oxidación y la
contaminación en el cultivo in vitro de fresa (Fragaria X ananassa
Duch.). Revista Científica UDO Agrícola, 4(1), 21-26.