PRÁCTICA Nº 9

APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA EN VEGETALES

I. INTRODUCCIÓN

Los cromosomas son el objeto de estudio de una serie de investigadores. Las

investigaciones cromosómicas proporcionan información importante tanto para el
seguimiento de la senda evolutiva de las especies de un género como para el trabajo
práctico de mejoramiento y permite involucrar en las hibridaciones un espectro mayor
de especies silvestres y cultivadas con la finalidad de facilitar la introgeción de los genes
deseados.

La citogenética vegetal se aplica ampliamente en el monitoreo genético. La intensa

utilización de pesticidas, fertilizantes, reguladores del crecimiento y otras sustancias hace
necesario evaluar sus consecuencias genéticas. Estas sustancias hacen necesario evaluar
sus consecuencias genéticas. Estas sustancias, además de su efecto positivo sobre la
producción y/o resistencia de las plantas a plagas y enfermedades, pueden presentar
efectos negativos sobre el aparato cromosómico de la célula vegetal, llevando a la pérdida
de su estabilidad genética y cualidades utilitarias. Por ello los métodos de evaluación de
la influencia de las sustancias químicas sobre la estructura de los cromosomas son
indispensables en los test para la determinación de la capacidad mutagénica de las
sustancias que circulan en la biosfera.

A diferencia del tejido animal en las células vegetales, es necesario tener en cuenta los
siguientes pasos a) Obtención de la muestra b) Eliminación de la pared celular c) Fijación
y coloración de la muestra.

II. OBJETIVOS

 Aprender la técnica de obtención cromosomas en vegetales.

 Probar el efecto de un mutágeno químico en el cariotipo de los vegetales

III. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1 OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS EN VEGETALES.

1. Coloque los bulbos de cebolla en vasos pequeños que contenga agua de caño, hasta que
emerjan las nuevas raíces.
2. Corte los extremos de las raíces aproximadamente 2 mm.
3. Colóquelas en una luna de reloj
4. Agregue 2ml de HCl.
5. Flamee por tres veces consecutivas evitando que hierva la muestra.
6. Elimine el HCl y agregue el colorante evitando que hierva la muestra.
7. Flamee hasta que la muestra tome un color rojo oscuro, evitando que hierva.
8. Coloque una de las puntas de la cebolla en una lámina portaobjeto con unas gotas de
colorante nuevo.
9. Cubra la laminilla cubreobjeto.
10. Realice la técnica del Squach.
11. Observe la preparación a mayor aumento y con lente de inmerción.

3.2 PRODUCCIÓN DE ABERRACIONES CROMOSÓMICAS

1. Coloque los bulbos de cebolla en vasos pequeños que contenga agua de caño, hasta que
emerjan las nuevas raíces
2. Colocar las raicillas en un vaso pequeño que contenga una solución de colchicina o
cafeína (1%), y deje que permanezca por lo menos tres horas. Pasado este tiempo,
siga todos los pasos necesarios para obtener los cromosomas, realizados en el acápite
anterior.

3.3 PROBLEMAS PROPUESTOS

1. Cada especie posee un número característico de cromosomas. Por ejemplo, el maíz

(Zea mays) tiene 10 pares de cromosomas, una planta de tomate presenta 12 pares de
cromosomas. Al estudiar el cariotipo de una planta de maíz con 30 cromosomas en sus
células. Una planta de tomate preenta 48 cromosomas y una planta de maíz que
presenta 18 cromosomas ¿Qué tipo de anomalía encontramos en esta especie?
2. Cuando una planta de tipo cromosómico aa poliniza a una planta de tipo AA, ¿qué tipo
cromosómico de embrión y de esndospermo se espera en las semillas resultantes?
3. ¿En maiz (Zea mays), tiene un número diploide de 20¿Cuántos cromosomas se
esperarían en a) un producto meiótico (microsporas o megasporas), b) la célula
resultante de la primera divisón nuclear (cariocinesis) de una megaspora, c) un núcleo
polar, d) un núcleo espermático, e) la célula madre de microsporas, f) una célula de la
hoja, g) un saco embrionario maduro (después de la degradación de los núcleos no
funcionales), h) un núcleo del huevo, i) una célula endospérmica, j) una célula del
embrión, k) una célula del pericarpio y, l) una célula de la aleurona?
4. El número diploide de la cebolla es de 16. ¿Cuántos cromosmas se esperan como
producto de la segunda cariocinesis de la meiosis en el saco embrionario?
5. La especie de algodón americano Gossypium hirsutum tiene 26 pares de cromosomas.
La especie de algodón asiático G. arboreum tiene 13 pares de cromosomas, lo mismo
que la especie americana G. thurberin. Cuando se cruzan individuos de hirsotum con
otros de arboreum se obtienen triploides en cuyas meiosis se observan 13 pares de
cromosomas y otros 13 aislados. Los triploides obtenidos al cruzar hirsotum y
thurberin presentan una situación similar, es decir, 13 pares y 13 univalentes en sus
meiosis. Al cruzar thurberin y arboreum los individuos de la F1 son estériles ya que el
emparejamiento de los cromosomas durante la meiosis es irregular. ¿Qué te sugiere lo
comentado en cuanto al origen filogenético del algodón americano G. hirsotum?
6. Una especie A (n=5) fue cruzada con otra B (n=7). En el híbrido se produjeron sólo
unos pocos granos de polen que se utilizaron para fertilizar óvulos de B. Como
resultado de esta fertilización se produjeron algunas plantas con 24 cromosomas. Estas
plantas eran fenotípicamente diferentes de las parentales y fértiles. ¿Qué pasos pueden
haber llevado a tales resultados?
7. Un organismo tiene 2n=12 cromosomas. Cuántos cromosomas tendrá: a) un
monosómico b) n trisómico c) un tetrasómico d) un doble trisómico e) un nulisómico
f) un monoploide g) un triploide h) un autotetraploide
 PRÁCTICA N° 10

APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA Y

ELABORACIÓN DE IDIOGRAMAS EN ANIMALES

I. INTRODUCCIÓN

La citogenética es el estudio de los cromosomas y las enfermedades relacionadas,

causadas por un número y/o estructuras anormales de los cromosomas. Los cromosomas
son estructuras complejas localizadas en el núcleo de las células, compuestos por DNA,
histonas y otras proteínas, RNA y polisacáridos. Son básicamente los "paquetes" que
contienen el DNA. Normalmente los cromosomas no se pueden ver con un microscopio
óptico, pero durante la división celular se condensan lo suficiente como para poder ser
fácilmente analizados. Para recoger células con sus cromosomas en este estado
condensado se las expone a un inhibidor de la mitosis, que bloquea la formación del huso
mitótico y detiene la división celular en la etapa de metafase. Se pueden usar distintos
tejidos para obtener preparaciones de cromosomas; por ejemplo, sangre periférica,
medula ósea, fluido amniótico y productos de la concepción, esto para el caso de la
especie animal incluido el hombre; sin embargo, en los vegetales los tejidos de
preferencia son los que están en constante división como los meristemos. Aunque las
técnicas específicas difieren según el tejido usado, el método básico para obtener
preparaciones de cromosomas en animales es: a) Recolección de la muestra y preparación
inicial. b) Cultivo celular. c) Adición de un inhibidor de la mitosis para detener las células
en metafase. d) Recogida de las células. Este paso es muy importante para obtener
preparaciones de alta calidad. Implica exponer las células a una disolución hipotónica,
seguida de una serie de disoluciones fijadoras. Esto hace que las células se expandan, de
modo que los cromosomas se extiendan y puedan examinarse individualmente y e)
Tinción de las preparaciones cromosómicas para detectar los posibles cambios numéricos
y estructurales.
Morfología del Cromosoma
Bajo el microscopio, los cromosomas se ven como estructuras delgadas y
alargadas. Tienen un brazo corto y otro largo separados por un estrechamiento o
constricción primaria, llamada centrómero. El brazo corto se designa como p y el largo
como q. El centrómero es el punto de unión del huso mitótico y es parte integral del
cromosoma. Es esencial para el movimiento y segregación normales del cromosoma
durante la división celular. Los cromosomas metafásicos humanos presentan tres formas
básicas y se pueden clasificar de acuerdo con la longitud de los brazos corto y largo, así
como por la posición del centrómero. Los cromosomas metacéntricos tienen los brazos
corto y largo de aproximadamente la misma longitud, con el centrómero en el punto
medio. Los cromosomas submetacéntricos tienen los brazos corto y largo de longitudes
desiguales, con el centrómero más próximo a uno de los extremos. Los cromosomas
acrocéntricos tienen el centrómero muy cerca de un extremo, con un brazo corto muy
pequeño. Con frecuencia tienen constricciones secundarias en los brazos cortos,
conectando trozos muy pequeños del DNA, llamados tallos y satélites, al centrómero. Los
tallos contienen genes que codifican el RNA ribosómico.
El idiograma es básicamente un "mapa cromosómico" que muestra la relación
entre los brazos corto y largo, el centrómero (cen) y, en el caso de cromosomas
acrocéntricos, los tallos (st, de stalk) y satélites (sa). También se ilustran los patrones de
bandas específicos. Cada banda se numera para ayudar en la descripción de
reorganizaciones.
Análisis Cromosómico
Prácticamente todos los análisis citogenéticos de rutina se realizan sobre
preparaciones cromosómicas que se han tratado y teñido para producir un patrón de
bandas específico de cada cromosoma. Esto permite la detección de cambios sutiles en la
estructura de los cromosomas. El tratamiento de tinción más común se llama bandeo G.
Se dispone de otras técnicas de tinción que ayudan a identificar anomalías específicas.
Una vez que se han obtenido las preparaciones de cromosomas metafásicos teñidos,
pueden examinarse al microscopio. Típicamente, se observan y cuentan de 15 a 20
células, con un análisis completo de al menos 5 de ellas. Durante un análisis completo,
cada cromosoma se compara críticamente banda por banda con su homólogo. Es
necesario examinar tantas células para poder detectar un mosaicismo, con significado
clínico. Tras el análisis al microscopio, se toman imágenes de las células en metafase que
tengan mejor calidad, bien mediante fotografía o por digitalización de imagen
computerizada. Cada cromosoma puede entonces disponerse en pares de acuerdo con su
tamaño y patrón de bandas, formando un cariotipo. El cariotipo permite al citogenetista
examinar aún más en detalle cada cromosoma en busca de cambios estructurales. Se hace
entonces una descripción por escrito del cariotipo, definiendo el análisis cromosómico.

Fig. Idiograma de los cromosomas humanos

II. OBJETIVOS

 Comprender cómo se describen los cromosomas y cómo se preparan e interpretan los

estudios citogenéticos.
 Aprender los principios para elaborar un idiograma

III. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1 OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS DE ANIMALES

1. Obtención de la muestra. Tomar un animal pequeño, ponerlo en una campana de
vidrio y colocarle un algodón empapado en éter o cloroformo, hasta que el animal quede
anestesiado.
2. Inmediatamente tomar un bisturí y realizar incisiones a fin de obtener el hueso largo
de la pata (delantera, o posterior), de la forma más rápida posible.
3. Limpiar los huesos de los restos de tejido muscular y conjuntivo
4. Triturar el hueso con unas tijeras en un tubo de prueba que contenga la solución
hipotónica (KCl 0.0075M), si es un animal de sangre caliente ésta debe estar a 37°C
y si es un animal de sangre fría debe estar a temperatura ambiente. Por espacio de
20mín a 1 h:
5. Terminado este tiempo, llevar a centrifugación 1000 rpm, por 10 min., Eliminar el
sobrenadante y agregar al pelex, fijador Carnoy (3 etanol: 1 ác, acético glacial),
como mínimo dejar por un tiempo de 15 min. Pasado el tiempo centrifugar a 1000
rpm, por 10min. Repetir este último paso 2 veces al término del cual se tomará en un
a pipeta pasteur unas gotas de muestra y se goteará (2-3) encima de una lámina
portaobjeto previamente congelada, evitando la sobreposición de las gotas.
6. Secar las láminas con aire caliente. Colorear la lámina con Giemsa al 2%, por espacio
de 10 min. Sacarla, enjuagar con agua corriente, secarla y observar al microscopio.
7. Observan al microscopio con menor aumento, ubicar las metafases.
8. Ubicada la metafase hacer el cambio de objetivo al de objetivo de inmersión.
9. Contar los cromosomas vistos
3.2 ELABORACIÓN DE UN IDIOGRAMA

2. Tomar las fotos de las metafases proporcionadas por el profesor, corte los
cromosomas y proceda a armar los cariotipos pertenecientes a seres humanos, usando
las muestras proporcionadas.
3. Luego medir la longitud total de cada par cromosómico, y medir la longitud del brazo
p, a fin de elaborar un índice centrómérico de cada par cromosómico.
4. Tomar estas luego estas medidas y colocarlas proporcionalmente al índice
centromérico en un papel milimetrado, tomando en cuenta longitud total y distancia
de cada brazo.
5. Presente luego el ideograma correspondiente en un papel milimetrado.

3.3. PROBLEMAS PROPUESTOS

1. Si una mujer contrae sarampión durante el primer trimestre del embarazo, aún cuando
la madre no sufre graves trastornos, a menudo se presentan en el niño anormalidades
como defectos cardíacos y hepáticos, sordera, cataratas y daltonismo, patentes al
momento de nacer en los niños afectados. ¿Puede atribuirse un patrón de herencia a
estos resultados fenotípicos?
2. Se encuentra un paciente con el síndrome de Turner y daltonismo. Tanto su madre
como su padre tienen visión normal. ¿Cómo se puede explicar ésto?; ¿se puede saber
si el origen de la alteración ocurre en el padre o en la madre? Si el gen del daltonismo
está muy próximo al centrómero, ¿podríamos saber si el error ocurre en la primera o
en la segunda división meiótica? Repetir las cuestiones esta vez utilizando un paciente
daltónico con el síndrome de Klinefelter.
2. Se han encontrado individuos que son daltónicos en un ojo, pero no en el otro. ¿Qué
nos sugiere ésto si: a) ¿estos individuos son sólo, o fundamentalmente, mujeres? b)
¿son sólo, o fundamentalmente, hombres? (Asumir que éste es un caracter recesivo
ligado al cromosoma X).
3. Los hombres y mujeres que padecen el síndrome de Down son capaces de cruzarse
entre sí, aunque es un hecho raro. ¿Qué constitución cromosómica se espera en los
cigotos de tales cruzamientos, y en qué se convertirán esos cigotos?
4. - Sugiere cómo se pueden originar cada uno de los siguientes ejemplos de mosáicos
sexuales: a) XX/X0 b) XX/XXYY c) X0/XXX d) X0/XX/XXX
5. ¡Cuál sería la representación correcta del cariotipo de tres personas: una niña con
trisomía del par 21 (síndrome de Down); otra con monosomía que afecta a los
cromosomas sexuales y fenotipos femenino (síndrome de Turner) y otras
completamente normal y de sexo masculino?
6. A continuación, se describen algunso casos de personas que presentaron alteraciones
en el número de cromosomas Caso 1: en 1973 se descubrió que una niña presentaba
45 cromosomas y carecía de uncromosoma ·22. La niña falleció a los 15 dias de edad.
Caso 2: Un bebé que se presenta un cariotipo (47, XY +13) falleció a las pocas
semanas de nacer. Caso 3: Un niño tiene células con 47 cromosomas. Cada una de las
células posee 3 cromosomas ·18. Caso 4: Una persona posee sólo un cromosoma X y
ningún cromosoma Y. ¿Nombre los tipos de anomalías cromosómicas que se
describen?
7. Una mujer acude a la consulta médica debido a que ha presentado aborotos espontáneos
en repetidas oportunidades Al realizar diferentes exámenes a la mujer y a su esposo,
se descubre que este último tiene un cariotipo 47, XYY. Los investigadores plantearon
varías hipótesis para tratar de explicar la aparicieón del cariotipo anormal del hombre
¿Cuál es origen de esta anomalía?
8. Una mujer que gestaba por primera vez pierde al producto de la gestación debido a un
aboroto espontáneo. Se decide estudiar el cariotipo del producto debido a razones de
tipo genético, encontrándose que se trataba de un caso de triploídia y en cada célula
poseía 2 cromosomas X y un cromosoma Y. ¿Cómo se podría explicar la formación
de este embrión triploide?
9. Una persona de 56 años padece de cierto tipo de cácer. Al realizar pruebas de
laboratorio, un genético encuentra que algunas de las células cancerosas tenían 92
cromosomas cada una. ¿Qué tipo de anormalidad tiene estos tipos de células)
10. El siguiente cuadro muestra el tipo de alteraciones cromosómicas encontradas entre
1026 casos de abortos espontáneos:

Trisomía 45, Triploidía Tetraploidía Otros Total Total

X anormal
Número 101 43 41 13 24 222 1026
% anomalía 45.5 19 18.5 6 11 100
% total 9.8 4.2 4.2 1.2 2.3 21.1

¿Cuáles es la información que ud podría sacar con estos datos?