TINCIÓN ZIEHL NEELSEN Y BACILOSCOPÍA

Dra. Pilar Arlet Pacheco Bleichner

I. INTRODUCCIÓN

La tinción de Ziehl Neelsen es el método de coloración diferencial que nos permite observar
los Bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR) que no se tiñen con la tinción Gram porque las
características de la Pared bacteriana son diferentes.

Existen diferentes géneros bacterianos que corresponden a la clasificación de BAAR pero

principalmente aquellos que pertenecen a los familia Actynomicetales son los comprendidos
en esta clasificación, de los cuales las Mycobacterias toman importancia al comprender dentro
de su género al Mycobacterium tuberculosis variedad hominis y al Mycobacterium bovis
agentes causales de la tuberculosis humana, considerada una enfermedad endémica en
nuestro país.

El conocimiento de esta técnica pero sobre todo la interpretación de la misma reviste

importancia en el campo profesional ya que el Programa Nacional de Control de Tuberculosis
ha establecido bajo normas estrictas los procedimientos de diagnóstico de pacientes
sospechosos de tuberculosis, sin embargo en el área rural la mayoría de los centros de salud
de atención primaria solo cuentan con auxiliares de enfermería o responsables populares de
salud para hacerse cargo del manejo de éstos pacientes y el conocimiento adecuado de los
procesos de diagnóstico de la misma podría ser una ventaja en el desenvolvimiento de
profesionales en el campo de trabajo.

II. PARED BACTERIANA BAAR

La pared bacteriana de los BAAR son bacterias que retienen el colorante primario y son
incapaces de ser desteñidas por el alcohol ácido.

Su pared celular está conformada por peptidoglicano y un 90% de una fracción Lipídica
conformada en su mayoría de ácidos grasos cuyo mayor componente es el ácido micólico, esto
confiere a la pared una característica hidrófoba hecho que impide el paso de sustancias
acuosas con facilidad por lo que se utiliza el fuego como adyuvante para la penetración del
colorante.

Tiene otras fracciones denominadas proteicas y lipoide en las que se encuentra la tuberculina y
otras proteínas que conforman la complejidad de la pared BAAR.

III. OBTENCION DE LA MUESTRA

El proceso de obtención de una muestra adecuada es un paso fundamental en el diagnóstico

de las diferentes enfermedades infecciosas.

La muestra adecuada para el diagnóstico de la tuberculosis pulmonar es el esputo que es la

secreción procedente del árbol bronquial que puede ser mucosa, mucopurulenta, purulenta,
hemopurulenta o hemática franca, en esta muestra puede encontrarse una concentración de
bacilos adecuada como para ser observados en el microscopio.
Sin embargo la tuberculosis afecta otros órganos y algunas muestras pueden ser utilizadas
para la baciloscopía sin embargo no es lo adecuado y el diagnóstico de la tuberculosis
extrapulmonar debe ser por cultivo ya que la sensibilidad de la tinción disminuye en otras
muestras, sin embargo puede realizarse esta técnica en orina, LCR, líquido pleural, líquido
ascítico, sangre, pus, etc. sin embargo el hecho de no observar BAAR no descarta la
enfermedad.

 Envase para recolección de esputo:

o Boca ancha: 50mm de diámetro
o Capacidad: 30 a 50 ml para facilitar la manipulación y evitar derrames.
o Cierre hermético con tapa rosca para evitar la desecación de la muestra y la
eliminación de aerosoles
o Recipiente plástico resistente a roturas
o Recipiente transparente para observar la calidad de la muestra
 Número de muestras
o Se recomienda 3 muestras para diagnóstico inicial de la tuberculosis
 Primera muestra: en el momento de la consulta
 Segunda muestra: en la casa del paciente la mañana siguiente.
 Tercera muestra: en el momento de dejar la segunda muestra
o Para el seguimiento del tratamiento se debe seguir la norma.
 Calidad de la muestra: una buena muestra tiene las siguientes características
o Cantidad: 3 a 5ml
 Calidad: muestra espesa, mucopurulenta o purulenta
 Métodos de recolección de muestra
o Expectoración espontánea:
 Elegir un lugar ventilado
 Tomar el envase previamente identificado
 Solicitar al paciente que expectore tres veces en el frasco, en lenguaje
simple que el paciente entienda, sin derramar a los costados evitando
eliminar saliva pura.
o En pacientes que no pueden expectorar como los niños, adultos mayores o
pacientes con pérdida del conocimiento se pueden utilizar otros métodos:
 Inducción del esputo: Fluidificar con nebulizaciones
 Utilizar ambientes ventilados
 Seguir normas de bioseguridad: utilización de barbijo y
guantes
 Nebulizar por 10 minutos
 Acostar al paciente boca abajo en una camilla a 45 grados
 Recoger el producto de la expectoración
 En caso de niños realizar masajes fisioterapéutico en la
espalda .
 En caso de que no se produzca la expectoración aspirar los
fluidos.
o Lavado gástrico: los niños no pueden expectorar y se tragan el esputo
entonces se utiliza esta técnica para recuperar bacilos.
  Aspirar tres muestras
 Utilizar envase de esputo
 Realizar el procedimiento en ayunas
 Introducir la sonda naso gástrica instilar 10 a 15ml de solución
fisiológica y aspirar, se sugiere cultivar la muestra.
o Lavado bronquial: por ser un método invasivo debe tenerse cuidado y ser
realizada por médicos especialistas
 Utilizar un fibrobroncoscopio y obtener la muestra

Al entregar la muestra al laboratorio:

 Comprobar la calidad de la muestra

 Comprobar los datos del paciente

o Conservación de la muestra:
 Se debe procesar las muestras en el día
 En el caso de que no suceda, introducir la muestra en bolsas plásticas y
llevar al refrigerador en una caja de plástico o de cartón
 Proteger del calor excesivo
 Evitar riesgo de derrame
IV. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: TINCIÓN ZIEHL NEELSEN

Se debe preparar el lugar de trabajo, tener todos los materiales cerca y se debe trabajar en
una cabina de flujo laminar durante el proceso de frotis y fijación de la muestra. Colocar una
hoja de papel madera embebido en hipoclorito de sodio como base, en caso de no contar con
cabinas de flujo laminar utilizar bandeja de tinción con una base de papel madera embebida en
hipoclorito de sodio.

Colocar todos los siguientes materiales dentro de la cabina de flujo laminar o la bandeja de
tinción:

 Mechero bunsen o mechero de alcohol

 Muestras de esputo: dejar reposar por al menos 20 minutos para evitar los aerosoles
 Aplicadores de madera
 Portaobjetos listos para usar
 Frasco con hipoclorito de sodio diluido para desechar los aplicadores

El manipulador debe trabajar con gorro, barbijo, guantes, bata de protección y lentes de
protección

El procedimiento se divide en dos pasos: frotis y proceso de tinción como tal.

1. Frotis:
 Desengrasar los portaobjetos en una solución de alcohol medicinal, dejar secar
en el mechero o ayudar con una tela que no desprenda pelusas para evitar los
falsos positivos
 Identificar los portaobjetos con los siguientes datos con lápiz graso:
 i. Código del paciente
ii. Número de muestra I –II o III
 Realizar el frotis: destapar la muestra, partir el aplicador de madera por la
mitad y con la parte acerrada recoger la parte más representativa de la
muestra y colocar la misma en el portaobjetos, esparcir la muestra realizando
movimientos de vaivén de izquierda a derecha o de arriba para abajo
realizando un extendido en 2/3 de la placa respetando los márgenes de
seguridad de los costados, el frotis debe ser grueso y cuadrangular. Desechar
el aplicador en hipoclorito de sodio al 1%, cerrar el envase de la muestra
 Fijar la muestra al medio ambiente o pasar por el mechero sin que la
temperatura sobrepase la temperatura de la mano para no quemar el frotis.
2. Técnica de tinción: colocar los portaobjetos sobre las cubetas de tinción o sobre las
varillas de tinción.
a. Primer colorante: cubrir la superficie del extendido con fucsina fenicada (fucsina
básica y fenol - mordiente) y utilizar una estopa para calentar los extendidos pasar
la misma por debajo de los extendidos durante aproximadamente 5 minutos sin
dejar que hierva el mismo ya que podrían formarse precipitados y observarse
como BAAR, esperar que la tinción se caliente y despida vapores esto implica que
los ácidos grasos de la pared BAAR se diluirán y permitirán el paso de la tinción
una vez que se hayan emitido los vapores dejar enfriar el frotis, en este momento
la fucsina básica, el fenol que actúa como mordiente y los ácidos micolicos han
conformado un complejo denominado micolato de fucsina que es el que le da la
coloración a los BAAR.
b. Lavar el frotis retirar el exceso de fucsina
c. Decolorar: cubrir el extendido con alcohol ácido de 1 min a 3minutos verificar
que el extendido se haya decolorado, todas las estructuras que no sean BAAR
quedarán decoloradas.
d. Segundo colorante: cubrir el extendido con azul de metileno, dejar actuar durante
1 a 3min para dar contraste al extendido y poder observar mejor los bacilos
e. Dejar secar y observar al microscopio.

V. BACILOSCOPÍA

La baciloscopía es la observación microscópica de los extendidos con dos objetivos:

 Cualitativos: observar la presencia de BAAR

o Morfología: Bacilos
o Agrupación: carece
o Apetencia tintoreal: BAAR – observamos bacilos rosados o rojizos
 Cuantitativo: cuantificar el número aproximado de BAAR en un extendido.
o Se debe comenzar la lectura depositando aceite de inmersión en el extendido,
enfocar y observar desde uno de los extremos, realizar el barrido de arriba
abajo o de izquierda a derecha de manera sistemática.
o En el extendido vamos a observar: células descamativas, leucocitos, moco y
BAAR en el caso de que existieran
 o Se debe contar el número de bacilos observados en cada campo microscópico
y hacer un reporte de cada campo en el cuadro correspondiente, observar al
menos 100 campos cuando no existen muchos BAAR sin embargo el número
de campos dependerá de la concentración de BAAR, si no se observan BAAR
reportar “0”.
o Interpretación: la interpretación se realiza en un sistema de cruces para poder
hacer el seguimiento del tratamiento y podemos realizar la interpretación de
la siguiente manera:
 Método OPS/OMS y del PNCT:
 Realizar un recuento total del número de bacilos
o Negativo: No se observan BAAR en 100 campos
observados
o 1 a 9 BAAR (anotar en número exacto de BAAR): Se
observan de 1 a 9 BAAR en 100 campos observados.
o Positivo (+): Se observan entre 10 a 99 BAAR en 100
campos observados
o Positivo(++): Se observan de 1 a 10 BAAR por campo
en 50 campos observados
o Positivo (+++): Se observan más de 10 BAAR por
campo en 20 campos observados
 Ejemplos:
 Si la sumatoria todos de los bacilos dan como resultado un
número de 65 B.A.A.R en 100 campos observados la
interpretación corresponde a Positivo (+)
 Si la sumatoria de todos los bacilos corresponde a 99 bacilos
en 50 campos, procedemos a dividir el número de BAAR entre
el número de campos observados:
o 99BAAR/50 campos = 1,98 BAAR por campo en 50
campos observados

Que interpretamos como Positivo (++)

 Si la sumatoria de todos los bacilos corresponde a 421

bacilos en 20 campos, procedemos a dividir el número de
BAAR observados entre el número de campos observados
o 421BAAR/20 campos= 21,6 BAAR por campo en 20
campos observados.

Cuya interpretación corresponde a Positivo (+++)

VI. BIBLIOGRAFIA

1. Trigoso y col. Bacteriología básica. Segunda edición. La Paz – Bolivia. Universidad Mayor
de San Andres. 1992 p.137-148
2. Forbes BA, Sahm FD, Weissfeld SA. Bailey y Scott.Diagnóstico Microbiologico. 12ªedición
Buenos Aires: médica Panamericana, 2009

3. Organización Panamericana de la Salud. Manual para el diagnóstico bacteriológico de la

tuberculosis: Normas y guía técnica, Parte I: La Baciloscopía. Washington, DC.: OPS; 2008.
p 11-17; 23-34.

4. Programa Nacional de Control de la Tuberculosis: Manual de diagnóstico y tratamiento de

la tuberculosis - Normas técnicas. La Paz; 2009.