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Inmunología molecular 118 (2020) 174–181

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inmunología molecular

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Evaluación del potencial de nanocuerpos anti-CD3 recombinantes sobre la

función inmunomoduladora
Shima Moradi-Kalbolandi, Azadeh Sharifi-K, Behrad Darvishi, Keivan Majidzadeh-A, Neda jalili, Solmaz
Sadeghi, Marjan Mosayebzadeh, Hassan Sanati, Malihe Salehi, Leila Farahmand*
Departamento de Proteínas Recombinantes, Centro de Investigación del Cáncer de Mama, Instituto del Cáncer Motamed, ACECR, Teherán, Irán

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

Palabras clave: Las células T son las células efectoras más predominantes en la eliminación inmunomediada del cáncer y evitan la progresión
CD3 del tumor. Entre varios enfoques, la activación de células T por anticuerpos específicos, independientemente de su
nanocuerpo especificidad de TCR, se considera un enfoque eficaz para eludir la progresión del tumor. El marcador de superficie más
Modelo de ratón de xenoinjerto de linfocitos
común para todas las células T, que es crucial para la activación de las células T, se considera CD3. Por lo tanto, el objetivo de
infiltrantes de tumores (TIL)
nuestro estudio fue evaluar la eficacia preclínica del nanocuerpo anti-CD3 recombinante. Para ello, se amplificó por PCR la
Cáncer de mama
secuencia anti-CD3, tras clonación y expresión enE. coliy purificación, el nanocuerpo purificado con un peso molecular de∼17
kDa se confirmó mediante transferencia Western. Además, el análisis de citometría de flujo demostró que el nanocuerpo
purificado podía unirse a CD3 en la línea celular Jurkat. Posteriormente, los resultados de la inoculación de 3 μg/g de
nanocuerpo a ratones balb/c portadores de tumores indican la inhibición del crecimiento tumoral. Además, los niveles
circulantes de citocinas tumoricidas como IL-2 e IFNγ aumentaron mientras que las citocinas tolerogénicas como IL-4, 6 y 10
disminuyeron al final del tratamiento. Además, el análisis IHC confirmó la presencia y también el porcentaje de TIL en los
sitios tumorales en respuesta a la terapia anti-CD3. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que el nanocuerpo anti-CD3
purificado puede convertirse en un candidato prometedor para apuntar y activar CTL para inducir respuestas antitumorales y
puede proporcionar una base para futuros estudios que involucren otros tipos de cáncer.

1. Introducción Los anticuerpos monoclonales (mAb) anti-CD3 en pacientes con diabetes

La presencia de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) se ha considerado
durante mucho tiempo como un sello distintivo de la inmunidad antitumoral
y se ha asociado con un mejor resultado clínico en múltiples tipos de
carcinomas.Demaría et al., 2010;Zhang et al., 2003). Numerosos informes
han demostrado que un alto número de células T citotóxicas (CTL) en el
microambiente tumoral se asocia con una supervivencia prolongada y un
mejor pronóstico.Ruffini et al., 2009). Además, el papel clave de las células T
auxiliares en el mantenimiento de una respuesta inmunitaria antitumoral
eficaz se ha revisado exhaustivamente en la literatura (Quezada et al., 2010;
Xie et al., 2010). Por lo tanto, mejorar y aumentar el número de TIL y CTL en
el microambiente tumoral, así como equilibrar la función de las células T
auxiliares, será un enfoque inmunoterapéutico eficaz para impulsar las
respuestas inmunitarias antitumorales y lograr un pronóstico favorable en
los pacientes (Walser et al., 2018).
Uno de los enfoques más importantes incluye la aplicación de anticuerpos
monoclonales anti-CD3 que podrían regular una respuesta inmune activa. Los
estudios iniciales de Bisikirska et al. demostró que la administración de
tipo 1 podrían regular la respuesta inmune al aumentar el número de CD4
+
Células T y activación de CD8+células T Estos resultados proponen un enfoque
innovador que puede dar cuenta de la potenciación de los efectos del tratamiento
anti-CD3 (Bisikirska y Herold, 2004).
El complejo multicadena CD3 es parte del receptor de células T (TCR) que se
requiere para la activación de las células T después de la interacción con un
antígeno específico. Además, ahora existe evidencia considerable de que el mAb
anti-CD3 es capaz de inducir la proliferación de células T y promover la secreción
de linfoquinas en ausencia de antígeno al interactuar con las células T (Yoshizawa
et al., 1991).
Por lo tanto, el anticuerpo con la capacidad de unirse a la cadena épsilon CD3 (CD3e)
en las células T se considera un enfoque potente para desencadenar la activación de las
células T independientemente de su especificidad de TCR.Bacac et al., 2016). Además, se
ha demostrado que los fragmentos de anticuerpos son menos potentes que el mAb
completo para inducir la activación de las células T cuando los efectos inmunosupresores
están intactos. Además de unirse a CD3, los mAbs anti-CD3 también pueden promover la
actividad mitogénica de las células T a través de un mecanismo mediado por Fc a través
de la reticulación de células T, macrófagos y

⁎Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico:laylafarahmand@gmail.com (L. Farahmand).

https://doi.org/10.1016/j.molimm.2019.12.017
Recibido el 14 de abril de 2019; Recibido en forma revisada el 3 de diciembre de 2019; Aceptado el 20 de diciembre de 2019 0161-5890/
© 2019 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
S. Moradi-Kalbolandi, et al. Inmunología molecular 118 (2020) 174–181

monocitos o la oligomerización de CD3 y posteriormente inducen una señal para tabla 1

que las células T proliferen y secreten citocinas.Le Gall et al., 2004;Dépis et al., Cebadores utilizados para PCR.

2013). oligonucleótido 5′a 3′Secuencia

Se han informado efectos terapéuticos adversos de anti-CD3 entre dosis
bajas y dosis más altas (Dépis et al., 2013). La inhibición y la estimulación se LIC-F GACGACGACAAGATGAAAAAGAATATCGCAGGTCGAG
LIC-R GAGGAGAAGCCCGGTCAATGATGATGATGATGATGTCTTAA
asocian con dosis altas y bajas de anti-CD3 respectivamente (Urba et al.,
1992). Sin embargo, Hirsch et al. observaron solo actividad
inmunosupresora después de la administración in vivo de mAb anti-CD3 (
2.2. Construcción de nanocuerpo anti-CD3
Hirsch et al., 1989). Por lo tanto, el desafío es encontrar la dosis adecuada. A
este respecto, se requiere una investigación in vivo. La estimulación de las
La secuencia que codifica el nanocuerpo anti-CD3 según las secuencias
células T condujo a la activación, proliferación, producción de linfoquinas e
publicadas (PATENTE WO2010037838A2 (Kufer y Raum, 2011),con una secuencia
inducción de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno y no específicos.
de codificación del péptido señal stII y una secuencia de codificación de etiquetas
Urba et al., 1992).
de seis histidinas constitutivas en los extremos 3' y 5' respectivamente fue
Una de las principales causas del crecimiento de tumores malignos es la incapacidad
sintetizada luego por sbs bio (Cinnagen, Irán). Para clonar anti-CD3 en los sitios
del sistema inmunitario para actuar adecuadamente en respuesta al tumor (Yoshizawa et
LIC apropiados del vector pET-32 LIC, se introdujeron secuencias complementarias
al., 1991). Así, es de interés la activación de la respuesta antitumoral del huésped, que es
superpuestas en los extremos 3' y 5' usando los cebadores que se muestran en
el principal objetivo de la inmunoterapia. Uno de los enfoques prometedores es la
tabla 1. Las condiciones de PCR fueron 30 ciclos de 95 °C por 1 min, 50 °C por 30 s,
utilización de mAb para estimular las células T con el fin de aumentar la capacidad de
72 °C por 30 s y un final de 72 °C por 10 min. En consecuencia, después de la
iniciar respuestas antitumorales (Yoshizawa et al., 1991). Debido a las propiedades
purificación y concentración usando un kit de extracción en gel (Qiagen,
estimulantes de las dosis más bajas de anti-CD3, como se mencionó anteriormente,
Alemania), el anti-CD3 amplificado por PCR resultante se clonó en el sitio LIC
podría desempeñar un papel importante en el tratamiento del cáncer (Urba et al., 1992).
apropiado del vector pET-32 LIC de acuerdo con las instrucciones del fabricante
(Novagen). Después de la transformación en la competenciaNovaBlue GigaSingles
Uno de los principales desafíos con respecto a la administración de mAb
™ (Novagen, Estados Unidos).,los clones recombinantes fueron seleccionados y
anti-CD3 es la activación de la tormenta de citoquinas. Para evitar esto, los
sometidos a PCR y secuenciación.
mAbs anti-CD3ε que no se unen a FcγR, como F (ab)2,Se generaron
anticuerpos anti-CD3 mutados con scFv o Fc. Se ha demostrado que debido
2.3. Expresión y purificación de nanocuerpos anti-CD3
a su incapacidad para unirse a FcγR, no son capaces de inducir la
proliferación de células T (Dépis et al., 2013). Entre los anticuerpos que no se
ÉlE. coliSe utilizó BL21 DE3 (EMD-Millipore, EE. UU.) para la expresión de
unen a FcγR, Nanobody (VHH) se considera la próxima generación de
nuestro nanocuerpo. Las bacterias se transformaron con los plásmidos
anticuerpos terapéuticos (Kolkman y Law, 2010). Se derivan de anticuerpos
recombinantes que contenían la secuencia anti-CD3 y se cultivaron en placas de
funcionales de cadena pesada que carecen de cadenas ligeras con un peso
agar LB. Se inoculó un solo clon en 5 ml de caldo LB que contenía 50 mg/ml de
molecular de aproximadamente 15 kDa. Las propiedades biofísicas y
ampicilina y se incubó a 37 °C mientras se agitaba a 150 rpm hasta que la A600 del
farmacológicas óptimas de los nanocuerpos resultan de su pequeño tamaño
cultivo alcanzó 0,4-0,6. Luego, se indujo la expresión agregando IPTG (isopropil-1-
y dominio único (Saerens et al., 2008). Además, sus propiedades deseables
tio-(3-D-galactósido) a una concentración final de 0,5 mM a 25, 28 y 37 °C para
adicionales incluyen un procedimiento de fabricación de bajo costo, facilidad
comprobar la temperatura óptima de expresión durante 4 h mientras se agita a
de clonación, estabilidad y afinidad de unión específica adecuada para el
150 rpm. Después de la centrifugación a 12.000 rpm durante 10 min, el sedimento
antígeno deseado. En este sentido, los nanocuerpos se han propuesto como
se volvió a suspender en tampón de lisis (NaCl 20 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0) y
alternativas a los mAbs y candidatos atractivos para la terapia del cáncer (
luego se lisó mediante sonicación. A continuación, la suspensión se centrifugó a
Harmsen y De Haard, 2007).
12.000 rpm durante 20 min y el sobrenadante que contenía el anticuerpo
Por lo tanto, en el presente estudio, se construyó un nanocuerpo Anti-CD3ε y se
expresado soluble se recogió para purificarlo mediante cromatografía de afinidad
estudió su efecto estimulante sobre el sistema inmunitario mediante la evaluación de la
con metales inmovilizados (IMAC) utilizando una columna Ni-NTA-Agarosa
tasa de supervivencia, la supresión del crecimiento tumoral y los cambios en el perfil de
(Qiagen, Alemania), según las instrucciones del fabricante.
secreción de citoquinas.

2. Materiales y métodos 2.4. Caracterización de nanocuerpos anti-CD3 purificados

2.1. Modelado de nanocuerpos anti-CD3 recombinantes y acoplamiento proteína- 2.4.1. SDS-PAGE, transferencia Western

proteína Después de la expresión y la purificación mediante cromatografía de afinidad

Se empleó el servidor web ABodyBuilder para predecir la estructura 3D del
nanocuerpo épsilon anti-CD3. ABodyBuilder se utiliza ampliamente para el
modelado automatizado de anticuerpos y nanocuerpos que pueden producir
rápidamente modelos estructurales a partir de una secuencia de entrada (Leem et
al., 2016). Además, la secuencia de aminoácidos primaria del épsilon CD3 humano
se recuperó de la base de datos UniProt (UniProt ID: P07766), y MODELLER generó
la estructura 3D de su dominio extracelular (posiciones 23–126) (Webb y Sali, 2014)
software que usa 1XIW (estructura cristalina de CD3-e humano) como plantilla. Los
modelos mejor clasificados se refinaron posteriormente utilizando el servidor web
GalaxyRefine (Heo et al., 2013), y luego de evaluar las cualidades estereoquímicas,
finalmente se seleccionó el mejor modelo para los estudios de acoplamiento. Los
estudios de acoplamiento molecular se realizaron con la herramienta web ClusPro,
que puede proporcionar el modo de acoplamiento anticuerpo-antígeno (Comeau
et al., 2004). Los resultados del acoplamiento fueron visualizados por Pymol (De
Lano, 2002) y analizado usando LigPlot+programa (Laskowski y Swindells, 2011).
con metales inmovilizados (IMAC), el nanocuerpo anti-CD3 purificado se analizó
mediante SDS-PAGE y tinción con azul brillante de Coomassie. Se utilizó Western
Blot para confirmar la presencia de∼Nanocuerpo de 17 kDa. Brevemente, después
de la electroforesis en gel, las bandas de proteína se transfirieron a una
membrana de nitrocelulosa y se bloquearon durante 16 h a 4 °C con leche
desnatada al 3 %, seguido de tres lavados de 10 min en PBST al 0,5 % (v/v Tween
20 en PBS). A continuación, la membrana se trató con mAb anti-His tag conjugado
con HRP de ratón (Qiagen, Alemania) diluido 1:2000 en PBS durante 1 hora a
temperatura ambiente para detectar el nanocuerpo. Posteriormente, la
membrana se reveló con 3, 3-diaminobencidina (DAB) (Sigma, Alemania) después
de tres lavados como se describió anteriormente.
2.4.2. Unión celular por análisis de citometría de flujo
Aunque la fuerte unión del anticuerpo anti-CD3 ε a Nterminal de CD3 ε
humano maduro se informó en patentes (Kufer y Raum, 2011), la capacidad de
unión al antígeno de la superficie celular del anti-CD3 purificado se evaluó
mediante análisis de citometría de flujo. Jurkat como CD3+línea celular

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S. Moradi-Kalbolandi, et al.
(Instituto Pasteur de Irán, Teherán, Irán) se cultivó en medio RPMI suplementado
con suero bovino fetal al 10 %, a 37 °C. Brevemente, 5 × 105las células se
suspendieron en tampón de tinción (PBS, 4 % FBS v/v). El anticuerpo preparado a
una concentración de 500 μg/ml se incubó durante 1 hora a 4 °C con células en
comparación con las células tratadas con PBS como control negativo. A
continuación, las células se lavaron tres veces con tampón de lavado enfriado con
hielo (PBS, FBS al 4 % v/v) mediante una centrífuga a 300 xg. Después de la
resuspensión del sedimento celular en 500 μl de tampón de lavado enfriado con
hielo, se incubaron con anticuerpo anti-his conjugado con FITC (Abcam, Reino
Unido) 1:500 (v/v) durante 1 hora a 4 °C. Posteriormente, las células se lavaron dos
veces en las mismas condiciones descritas anteriormente y la intensidad de
fluorescencia de las muestras se midió con FACS Calibur (Partec, Alemania).
2.4.3. Ensayo de proliferación celular
Proliferación de CD3+células después de la adición de nanocuerpo anti-CD3
purificado, se midió en un ensayo MTT estándar (Mosman, 1983). Los ensayos se
realizaron por triplicado. Brevemente, se aislaron células mononucleares de
sangre periférica humana (PBMC) de la fracción de capa leucocitaria de
voluntarios sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad. Todas las
células se sembraron a las 106células/ml en placas de 96 pocillos con FBS al 10 %
que contenía CO2 al 5 % y se incubaron durante la noche a 37 °C. Al día siguiente,
se añadió a cada pocillo una concentración diferente de nanocuerpo anti-CD3
purificado. Después de 24 y 48 h de incubación, se analizó la viabilidad o
proliferación de células en respuesta al nanocuerpo anti-CD3 utilizando [3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolio bromuro] (MTT). Después de la
incubación durante 3 h a 37 °C y usando DMSO, se leyó la absorbancia a 570 nm
en un lector de microplacas (BioRad, EE. UU.).
2.5. Estudios de modelo de ratón de xenoinjerto para la evaluación de la eficacia
terapéutica
Para evaluar la actividad antitumoral in vivo del nanocuerpo anti-CD3
purificado, se compraron ratones hembra balb/C de 3 a 4 semanas de edad con un
peso corporal de 20 a 32 g del Instituto Pasteur (Teherán, Irán). Después de la
llegada, los animales se mantuvieron durante 1 semana para adaptarse al nuevo
entorno. Las muestras de tumor mamario espontáneo de ratón (SMMT) con un
tamaño de 100 mm3 se injertaron (trasplantaron SC) en el flanco derecho de los
ratones.En vivomodelo de tumor de cáncer de mama se desarrolló sobre la base
de un método previamente establecido por Noori et al. (Noori y Hassan, 2011). 13
días después del injerto, cuando el tamaño del tumor alcanzaba los 150-200 mm3,
se inyectó sistemáticamente nanocuerpo anti-CD3 en concentraciones de 3 μg/g a
los ratones. Las inyecciones se repitieron cada 4 días durante un período de 24
días y los animales se controlaron diariamente en cuanto a síntomas clínicos y
detección de cualquier reacción inesperada. La eficacia del retardo del crecimiento
tumoral del nanocuerpo antiCD3 se evaluó midiendo los volúmenes tumorales a
intervalos de tiempo predeterminados de acuerdo con la siguiente fórmula:
V (mm3) = 1/6 π × un × segundo × c.
Donde a, b y c representan alto, ancho y largo (mm) del tumor
respectivamente. Luego se compararon los resultados con el grupo receptor
de PBS. Al final del tratamiento, las tasas de supervivencia también se
analizaron estadísticamente utilizando el análisis de supervivencia de
Kaplan-Meyer y el método de análisis de prueba Log-Rank (mantel-Cox) (dF=
1, x2= 8.690, Pvalor= 0,0032).
2.5.1. Análisis de liberación de citoquinas
Para evaluar la potencia del nanocuerpo recombinante en la polarización
de las células T colaboradoras, se evaluó la alteración en la expresión de
citocinas específicas de Th1, incluidas IL-2 e IFNγ, así como citocinas
específicas de Th2, incluidas IL-4, IL-6 e IL-10. muestra de sangre de ratones
usando kits ELISA multiplex disponibles comercialmente (Cat No. MEM-004A,
Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
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Inmunología molecular 118 (2020) 174–181
2.5.2. Análisis inmunohistoquímico (IHC) y tinción H&E
Se usaron secciones teñidas con H&E para evaluar el porcentaje de TIL en el
microambiente tumoral de acuerdo con las pautas establecidas previamente. El
número de TIL CD8+ y CD4+ también se evaluó mediante análisis IHC de acuerdo
con los métodos descritos anteriormente (Micke et al., 2014). Brevemente, los
ratones se sacrificaron 18 h después de la última inyección de nanocuerpo anti-
CD3. Secciones de tejido tumoral de aproximadamente 3 mm de tumores de
xenoinjerto se fijaron en PFA al 4 % (paraformaldehído) durante la noche y se
incluyeron en parafina. Después del corte con Microtome (Leica) y el montaje en
portaobjetos de vidrio, se realizó la desparafinación y la recuperación de
antígenos con calor. Luego, las células se inmunoteñeron para CD4 y CD8 de
manera que primero se incubaron con un anticuerpo primario de conejo anti-CD4
y CD8 (Abcam), seguido de una incubación con anticuerpo secundario anti-conejo
conjugado con HRP, las reacciones se visualizaron por 3,3′-diaminobencidina
(DAB). Posteriormente, las secciones se contrastaron con hematoxilina y eosina
(Sigma Aldrich) y los portaobjetos se escanearon con el microscopio (Leica
Biosystems). Dos patólogos analizaron los portaobjetos de tumores teñidos con
H&E.
3. Resultados
3.1. Modelado de nanocuerpos anti-CD3 recombinantes y acoplamiento proteína-
proteína
La estructura tridimensional del nanocuerpo epsilon anti-CD3 se
determinó utilizando ABodyBuilder, y las tres regiones CDR se identificaron y
modelaron mediante el modelado de bucle CDR (Figura 1-UN).
Paralelamente, MODELLER generó la estructura proteica del dominio
extracelular CD3-e y se seleccionó el modelo mejor refinado en función de
las propiedades estereoquímicas. Esta estructura contiene la secuencia
QDGNEEMGGITQTPY-KVSISGTTVILT que es reconocida por el nanocuerpo
diseñado. El análisis de los resultados del acoplamiento molecular reveló
que el nanocuerpo diseñado podría interactuar con éxito con el epítopo
objetivo en CD3-e. Se estudiaron varios complejos acoplados y se
determinaron los residuos más prominentes, involucrados en la interacción.
De acuerdo con estos resultados, Gln1, Asp2, Glu5, Glu6, Gly8, Ile10, Thr11,
Gln12, Thr13, Tyr15 y Lys16 formaron con frecuencia enlaces de hidrógeno
con las regiones CDR del nanocuerpo. Además, Thr29, Asp36, Tyr37, Ser57,
Trp58, Asn59, Ser64, Gly108, Gly111, Gly113, y Asn115 fueron los residuos
formadores de enlaces H más frecuentes del nanocuerpo. Uno de los modos
de interacción más posibles del CD3-e y el nanocuerpo diseñado junto con la
posición de estos residuos se ilustran enFigura 1-B y C. Además, el escaneo
computacional de alanina se realizó con la herramienta web Robetta
(Kortemme, T., Kim, DE, Baker, D. Computational Alanine Scanning of
Protein-Protein Interfaces. Sci. STKE 2004) para determinar el impacto de la
mutación. residuos cruciales en la afinidad de unión. Los residuos de puntos
calientes pueden ser reconocidos por este método. La mutación en estos
residuos cambiará notablemente la energía libre de unión. En este sentido,
se encontró que los residuos Gln1, Asp2, Met7, Thr13 y Tyr15 del CD3-e, y los
residuos Asp36, Trp58, Asn59 y Gly113 del nanocuerpo son fundamentales
para la formación del complejo CD3-nanocuerpo.
3.2. Construcción, expresión y purificación del nanocuerpo anti-CD3
Nuestro nanocuerpo anti-CD3 con voladizos deseados como producto de PCR
de∼500 pb presentaron una sola banda en gel de agarosa al 2 % (Figura 2UN). La
transformación correcta de las bacterias se confirmó mediante PCR de colonias (
Figura 2B) y secuenciación. Después de la inducción de la expresión de proteínas
mediante la introducción de IPTG en los medios de crecimiento, se observó que la
mejor temperatura para obtener el mayor rendimiento de producción era de 28
°C. Después de la purificación del nanocuerpo anti-CD3, la presencia de una sola
banda a 17 KDa, el tamaño previsto del nanocuerpo, en SDS-PAGE confirmó la
expresión correcta de la proteína deseada (Figura 2C). El análisis de transferencia
Western confirmó además la identidad correcta del nanocuerpo anti-CD3
expresado (Figura 2D). Además, las secuencias de aminoácidos del nanocuerpo
anti-CD3 se mostraron enTabla 2.
S. Moradi-Kalbolandi, et al. Inmunología molecular 118 (2020) 174–181

Figura 1.Estructura 3D del nanocuerpo diseñado y su

modo de interacción con CD3-e. A) Estructura 3D del
nanocuerpo anti-CD3-e generado por ABodyBuilder.
Las regiones CDR están coloreadas en rojo. B)
Representación superficial del complejo nanocuerpo/
CD3-e obtenido de ClusPro. CD3-e y el nanocuerpo
están coloreados en cian y verde, respectivamente.
El epítopo diana de CD3-e se representa en amarillo.
Los residuos más prominentes involucrados en la
interacción están etiquetados e ilustrados en
representación de barras en la vista de primer plano
(C) (Para la interpretación de las referencias al color
en la leyenda de esta figura, se remite al lector a la
versión web de este artículo). .

Figura 2.Construcción, expresión y purificación de nanocuerpos anti-CD3. A) Producto de PCR de la secuencia anti-CD3 que contiene la secuencia de clonación adecuada. un∼La banda de 450 pb
confirmó la inserción del enlazador. B) PCR de colonias después del procedimiento de clonación. Él∼La banda de 476 pb indica la inserción del nanocuerpo al vector. C) Nanocuerpo purificado. Carril M,
escalera de proteína preteñida con Page Ruler (vivantis technologies, MALASIA). Carril 1, nanocuerpo purificado. D) Western blot de nanocuerpo, mediante anticuerpo monoclonal anti-His y conjugado
HRP cabra-anti-ratón. Lane M, escalera de proteína preteñida Page Ruler (vivantis technologies, MALASIA). Lane1, nanocuerpo purificado.

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S. Moradi-Kalbolandi, et al. Inmunología molecular 118 (2020) 174–181

Tabla 2
Las secuencias de aminoácidos del nanocuerpo anti-CD3.

FR1 CDR1 FR2 CDR2

Secuencia de aminoácidos de nanocuerpo EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFDDYGMS WVRQAPGKWLEWVSD ISWNGGSTYYAD

FR3 CDR3 FR4
SVKGRFTISRDNAENTLYLQMNSLKPDDTAVYYC AKMGEGGWGANDY WGQGTQVTVSS

Fig. 3.Actividad de unión celular en la línea celular CD3+ jurkat. A) Citometría de flujo de nanocuerpo purificado en la línea celular CD3+ jurkat. B) Citometría de flujo de la línea celular CD3+ jurkat tratada
con PBS. C) Citometría de flujo del anticuerpo secundario conjugado con FITC en la línea celular CD3+ jurkat. D) Citometría de flujo de nanocuerpo de control no específico (desarrollado en nuestro
laboratorio) en línea celular de línea celular jurkat CD3+. Como muestra el cambio en el valor de la fluorescencia, nuestro nanocuerpo se une preferentemente a la línea celular CD3+ jurkat en
comparación con el PBS, el anticuerpo FITC secundario y el nanocuerpo de control no específico.

3.3. Ensayo de unión de nanocuerpos anti-CD3

La capacidad de unión específica del nanocuerpo anti-CD3 a su antígeno de

superficie celular correspondiente se evaluó mediante citometría de flujo. como se
muestra enFig. 3A, células Jurkat CD3-positivas teñidas positivamente con
nanocuerpo anti-CD3 mientras que líneas celulares MCF-7 CD3-negativas,
anticuerpo conjugado con PBS/FITC secundario y nanocuerpo de control no
específico (desarrollado en nuestro laboratorio) en línea celular CD3+ jurkat línea
celular respectivamente, demostró una tasa de unión insignificante (Fig. 3BD) en
comparación con tinción positiva con nanocuerpo anti-CD3 (Fig. 3UN). Estos
hallazgos demuestran aún más la unión específica del nanocuerpo purificado y
confirmaron su potencial de unión a CD3 biológicamente funcional y específico.

3.4. Ensayo de proliferación celular (MTT) Figura 4.Ensayo de proliferación celular. Proliferación de células CD3+ (PBMC) después de la
adición de anticuerpo anti-CD3 purificado en comparación con la línea celular Jurkat en un ensayo
Para investigar el potencial de proliferación del nanocuerpo anti-CD3 en células que MTT estándar. Ensayo de proliferación de células T (MTT) que demuestra el incremento de la

expresan CD3, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y la línea celular proliferación en comparación con el tratamiento con PBS.

Jurkat se trataron con nanocuerpo anti-CD3 durante 24 h y 48 h. Según los resultados del
ensayo MTT, las concentraciones crecientes de nanocuerpos anti-CD3 podrían aumentar disminuido (Figura 6). Por el contrario, los grupos de control tratados con PBS no
la proliferación de PBMC in vitro de forma dependiente de la dosis. No se observó un produjeron ninguna de las citocinas evaluadas.
aumento significativo en la proliferación de PBMC con el tratamiento con PBS (Figura 4)

3.7. Análisis de TIL (linfocitos infiltrantes de tumores)

3.5. eficacia in vivo del nanocuerpo anti-CD3 purificado
Se evaluó la eficacia supresora del crecimiento tumoral del nanocuerpo anti-CD3
expresado a concentraciones de 3 mg/kg en ratones que tenían un tumor de mama que
se desarrolló mediante trasplante de tumor mamario espontáneo (SMT). Como se ilustra
enFigura 5, el tratamiento con nanocuerpos anti-CD3 podría suprimir eficazmente el
crecimiento tumoral y retrasar la fase de crecimiento tumoral logarítmico. Las diferencias
en el tamaño del tumor se volvieron significativas a partir del día 8 después de la
inyección y al final del período de tratamiento, los pesos medios de los tumores se
redujeron significativamente. Según el análisis de Kaplan-Meyer, la tasa de supervivencia
aumentó significativamente en los grupos que recibieron 3 μg/g de nanocuerpos en
comparación con los que recibieron PBS (Figura 5)
3.6. Análisis de liberación de citoquinas
El análisis de los niveles de citoquinas por ELISA reveló que nuestro nanocuerpo
indujo una fuerte liberación de IL-2 IFN-g mientras que IL-4, IL-6 e IL-10 lo fueron.
Se examinó el tejido tumoral de ratones de todos los grupos para detectar la
presencia de células T. El patólogo definió el porcentaje de TIL después de la
inmunomarcación de células con anti-CD8 en los portaobjetos de tumores teñidos con
H&E. Según los resultados de IHC, la administración de nanocuerpos anti-CD3 con una
concentración de 3 μg/g podría aumentar significativamente el número de TIL tanto
CD4+ como CD8+ en el microambiente tumoral, pero curiosamente, la proporción de CD4
+/CD8+Las células T disminuyeron en el grupo que recibió anti-CD3 en comparación con el
grupo de control (Figura 7).
4. Discusión
Generalmente se requieren dos señales de activación para las células T.
Uno por la interacción del TCR con moléculas MHC asociadas a péptido
antigénico y el otro por la interacción de moléculas coestimuladoras como
CD80, CD86 o CD28 (Liao et al., 2000). Sin embargo, se ha demostrado que la
interacción de anti-CD3 con células T pre efectoras proporciona señales
cruciales para su maduración en células funcionales en un

178
S. Moradi-Kalbolandi, et al.
Figura 5.Crecimiento tumoral en respuesta al tratamiento anti-CD3. Como se muestra, se observó
inhibición del crecimiento tumoral a una dosis de 3 µg/g. B. Según el análisis de Kaplan-Meyer, la tasa de
supervivencia aumentó significativamente en los grupos que recibieron 3 μg/g de nanocuerpos en
comparación con los que recibieron PBS.
Figura 6.Análisis de liberación de citoquinas después del tratamiento anti-CD3. El análisis de los
niveles de citoquinas por ELISA reveló que nuestro nanocuerpo indujo una fuerte liberación de
IL-2 IFN-g mientras que IL-4, IL-6 e IL-10 disminuyeron en comparación con el grupo tratado con
PBS.
manera independiente del antígeno (Yoshizawa et al., 1991;Wu y Cheung,
2017). Además, un amplio espectro de informes de varios laboratorios ha
demostrado que los mAbs contra el CD3 dan como resultado tanto la
activación como la supresión de las células T (Yoshizawa et al., 1991;Urba et
al., 1992;Gallinger et al., 1990;Ellenhorn et al., 1988,1990). Por lo tanto, el
resultado del tratamiento con mAb anti-CD3 depende principalmente de la
dosis (Hirsch et al., 1989;Mehta et al., 2010). Estos interesantes hallazgos nos
impulsaron a explorar este fenómeno con nanocuerpos anti-CD3. Aquí, para
evaluar los posibles efectos de activación o supresión del nanocuerpo anti-
CD3, se administró una dosis de 3 μg/g a los ratones que tenían tumores de
mama. Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio es evaluar la eficacia
de la dosis óptima de anti-CD3 (3 μg/g) para inducir la proliferación celular y
la activación de las células T efectoras simultáneamente.
179
Inmunología molecular 118 (2020) 174–181
Yoshizawa et al. informaron que, de manera similar a los antígenos
específicos, el mAb anti-CD3 podría inducir la activación de las células T pre
efectoras comprometidas inmunológicamente (Van Wauwe et al., 1980).
Principalmente, la interacción anti-CD3/linfocitos T da como resultado la
proliferación, secreción de varias citocinas, regulación positiva de la expresión de
IL-2R y/o la generación de células efectoras citotóxicas.Van Wauwe et al., 1980).
Dentro del régimen de dosis aplicado en nuestro estudio, se observó un
crecimiento tumoral reducido en comparación con el tratamiento con PBS (Figura
5). A medida que se aumentaba la dosis de anti-CD3 se disminuía la eficacia como
se ha establecido previamente en la literatura (Mehta et al., 2010) que son
consistentes con nuestros hallazgos. Ellenhorn et al., también demostraron queen
vivola activación de las células T por anti-CD3 condujo a la mejora de una
respuesta antitumoral solo en ratones tratados con dosis bajas de anticuerpos (
Ellenhorn et al., 1988). Además, en su estudio no se notificó ningún efecto de los
fragmentos anti-CD3 F (ab') 2 sobre el crecimiento tumoral. Por lo tanto,
concluyeron que los fragmentos anti-CD3-F (ab') 2 se consideran agentes
inmunosupresores (Ellenhorn et al., 1988). De acuerdo con Ellenhorn et al, Mehta
et al. informó que la dosis más baja de anti-CD3 F (ab)2regímenes en ratones, da
como resultado la reducción de los recuentos de células T CD4+, CD8+ y la
liberación de citocinas en sangre periférica, lo que confirmó sus propiedades
inmunosupresoras (Mehta et al., 2010). Al respecto, los resultados de Depis et al.
El estudio indica que la interacción Fc-FcγR de los anticuerpos anti-CD3 es
significativamente necesaria en la activación de las células T, la inducción y la
posterior liberación de citocinas, mientras que no contribuye a los efectos
inmunosupresores (Dépis et al., 2013). A pesar de todo esto, no hay evidencia de
un mayor crecimiento tumoral en nuestro estudio después de la administración de
nanocuerpos anti-CD3. Por lo tanto, se podría concluir que nuestros nanocuerpos
anti-CD3 purificados no son inmunosupresores a las dosis aplicadas en este
estudio, aunque los nanocuerpos no mantienen las regiones Fc.
Durante mucho tiempo se ha reconocido que las propiedades inmunoactivadoras de
anti-CD3 aparentemente se deben al aumento del número de células T, la actividad de las
células asesinas activadas por linfoquinas o la inducción de citoquinas antitumorales.
Ellenhorn et al., 1988;Hellström et al., 2001). A este respecto, se analizaron los niveles de
citoquinas relevantes en las muestras de suero de los ratones tratados de todos los
grupos. Los resultados demuestran un mayor nivel de IFNγ en el suero de los grupos
tratados con anti-CD3 pero no en los de control. Mientras que el nivel de IL-10, 6 y 4 se
redujo. Por tanto, el IFNγ podría considerarse como el principal mediador de los efectos
antitumorales. Además, al igual que el IFNγ, las células asesinas naturales y los
monocitos juegan un papel crucial en la terapia anti-CD3. Porque se ha demostrado que
la estimulación de CD3 y la coestimulación a través de CD28 o CD40 conducen a la
producción de linfoquinas que, en última instancia, da como resultado la activación de
células asesinas naturales y monocitos (Ellenhorn et al., 1990). Según varios informes, la
progresión del cáncer se asocia con la interrupción del equilibrio Th1/Th2, el fenómeno
denominado "cambio de equilibrio" (Van Wauwe et al., 1980;Hellström et al., 2001; Gao et
al., 2007). Por lo tanto, investigamos si la aplicación de nanocuerpos anti-CD3 podría
afectar este equilibrio mediante la medición del perfil de citoquinas específico para cada
subtipo de ayudante T en sangre periférica mediante ELISA. como se muestra enFigura 6,
la administración de nanocuerpo a 3 μg/g podría aumentar significativamente la
expresión de citocinas específicas de Th1, incluidas INFγ e IL-2, al tiempo que reduce las
citocinas específicas de Th2, como IL-10. No se observaron cambios con respecto a la
expresión de IL-4 en todas las dosis administradas de nanocuerpo en comparación con el
grupo que recibió PBS. Estos resultados sugieren además que la administración de
nanocuerpos anti-CD3 es capaz de cambiar el equilibrio de los auxiliares T hacia Th1, lo
cual es una circunstancia favorable en el tratamiento del cáncer.
La mayoría de las respuestas inmunitarias antitumorales del huésped están
mediadas por la inmunidad adquirida a través de la cual la activación adecuada de CD4+y
CD8+Los linfocitos T son necesarios. En esta perspectiva, la infiltración de TIL CD8+ es
altamente deseable mientras que los TIL CD4+ también son necesarios, ya que son
cruciales para el funcionamiento óptimo de las células CD8+. Por lo tanto, la proporción
de CD4+/CD8+Las células T son el principal determinante de la función adecuada de TIL.
De hecho, múltiples estudios han demostrado que un nivel alto de CD4+/CD8+La
proporción de células T está junto con una tasa más alta de metástasis en los ganglios
linfáticos y una tasa de supervivencia reducida en pacientes con cáncer de mama. Por
tanto, un tratamiento capaz de invertir el ratio de CD4+/CD8+Las células T son
S. Moradi-Kalbolandi, et al.
Figura 7.Análisis de TIL (linfocitos infiltrantes de tumores) por IHC. Se determinó el porcentaje de TIL después de la inmunomarcación de células con portaobjetos de tumores teñidos
con anti-CD8/CD4 y H&E.
junto con resultados deseables en pacientes con cáncer de mama. Según los
resultados de IHC, la administración de nanocuerpos anti-CD3 con una
concentración de 3 μg/g podría aumentar significativamente el número de TIL
tanto CD4+ como CD8+ en el microambiente tumoral, pero, curiosamente, la
proporción de CD4+/CD8+Las células T se revirtieron en el grupo que recibió anti-
CD3 en comparación con el grupo de control.
Los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) se consideran el principal marcador
de la inmunidad antitumoral.Demaría et al., 2010;Zhang et al., 2003). Se ha
demostrado que la supervivencia prolongada o el pronóstico favorable se asocia
con CTL (Ruffini et al., 2009). El otro factor que es más crítico que la presencia de
CTL es la proporción de CD8+Células T a CD4+células (de efector a TIL reguladores)
(Walser et al., 2018). En nuestros estudios esta relación fue 37/18∼2. Esto indica
que CD8+las células son aproximadamente dos veces más que las CD4+células.
Aunque CD8+las células se consideran células efectoras, CD4+Las células T
auxiliares también son un determinante crucial de las respuestas inmunitarias
antitumorales efectivas.Walser et al., 2018). Gao, Q., et al. y Sato, E., et al. en dos
estudios independientes muestran que en pacientes con cáncer hepatocelular y
de ovario, aunque la proporción de CD8+TIL a T regs podría considerarse como un
factor pronóstico, no hay valor predictivo al determinar el número de T regs o CD8
+ TIL individualmente (Gao et al., 2007;Sato et al., 2005). Además, ha quedado
claro que CD4+Las células T auxiliares no solo podrían inducir respuestas
inmunitarias antitumorales, sino que también podrían inhibir la inmunidad
antitumoral. Este fenómeno ocurrió porque CD4 ingenuo+Las células T podrían
diferenciarse a células T auxiliares (Th) que incluyen los subconjuntos Th1, Th2,
Th17 y T regs (Schattner et al., 1996;Thomas y Hersey, 1998). Por lo tanto, los
subconjuntos más altos determinaron la respuesta. Por ejemplo, Th1 condujo a
efectos antitumorales a través de la activación de CTL, células dendríticas y
macrófagos, mientras que T regs condujo a una respuesta tolerogénica. Por lo
tanto, las estrategias de inmunoterapia actuales se basan en la infiltración y
activación de ambos CTL.
180
Inmunología molecular 118 (2020) 174–181
y T auxiliar CD4+ para mejorar la inmunidad antitumoral (Walser et al., 2018). Nuestros
resultados mostraron que tanto (CD4+) o las células T CD8+ se infiltran en los sitios
tumorales en comparación con los grupos de control, lo que confirma el potencial de
nuestro nanocuerpo para estimular tanto a los CTL como a los T auxiliares CD4+ para
inducir la respuesta antitumoral.
Nakajima et al. informaron que los mAbs anti-CD3 solos no podían prolongar
significativamente la supervivencia de los ratones con tumores, mientras que se
observó una supervivencia prolongada cuando se aplicaron mAb anti-CD3 más
IL-2 (Nakajima et al., 1994). Del mismo modo, Yang et al. informó que la
combinación de anti-CD3, interleucina 2 y factor de necrosis tumoral α en conjunto
condujo a una consecuencia antitumoral in vivo, mientras que no lo hizo en
ninguno de ellos solo (Yang et al., 1990). Sin embargo, nuestros resultados
muestran que las dosis optimizadas de nanocuerpo anti-CD3 solo dan como
resultado la activación de las células T, lo que se confirmó mediante la regresión
del tumor. Esto es consistente con Urba et al. y Ellenhorn et al. en la mejora de las
respuestas inmunitarias sin inmunosupresión a dosis bajas de mAb anti-CD3 (Urba
et al., 1992; Ellenhorn et al., 1990).
En conclusión, nuestros resultados confirman que el tratamiento de ratones
portadores de tumores con una dosis optimizada de anti-CD3 resultó en la regresión del
tumor. Por lo tanto, puede considerarse como buenos candidatos para evaluar su
capacidad en otros modelos de tumores también. La investigación adicional a este
respecto es esencial y sigue siendo el objetivo de nuestro trabajo futuro.
Declaración de interés en competencia
El manuscrito no ha sido enviado para su publicación en otro lugar y no
presenta ningún tipo de conflicto de intereses. Reconocimiento de todos los
autores de que todos los autores han contribuido significativamente y que
todos los autores están de acuerdo con el contenido del manuscrito.
S. Moradi-Kalbolandi, et al.
Apéndice A. Datos complementarios
El material complementario relacionado con este artículo se puede encontrar,
en la versión en línea, en doi:https://doi.org/10.1016/j.molimm.2019.12.017.
Referencias
Bacac, M., et al., 2016. Un nuevo anticuerpo biespecífico de células T de antígeno carcinoembrionario (CEA
TCB) para el tratamiento de tumores sólidos. clin. Cáncer Res pág. clincanres. 1696.2015.
Bisikirska, BC, Herold, KC, 2004. Uso de anticuerpos monoclonales anti-CD3 para inducir
Regulación inmune en diabetes tipo 1. Ana. Academia de Nueva York. ciencia 1037, 1–9. Comeau, SR,
et al., 2004. ClusPro: un método automatizado de acoplamiento y discriminación para
la predicción de complejos proteicos. Bioinformática 20 (1), 45–50.
DeLano, WL, 2002. Pymol: una herramienta de gráficos moleculares de código abierto. Boletín CCP4 en
Cristalografía de proteínas 40, 82–92.
Demaria, S., et al., 2010. Cáncer e inflamación: promesa para la terapia biológica. j
Inmunoterapia (Hagerstown, Md.: 1997) 33 (4), 335.
Dépis, F., et al., 2013. Caracterización de un anticuerpo murino sustituto del modelo anti-
terapias de CD3 humano. MAb. taylor y francisco.
Ellenhorn, JD, et al., 1988. La administración in vivo de anti-CD3 previene la
crecimiento del tumor progresor. Ciencia 242 (4878), 569–571.
Ellenhorn, J., Schreiber, H., Bluestone, J., 1990. Mecanismo de rechazo tumoral en anti-
Ratones tratados con anticuerpos monoclonales CD3. J. Immunol. 144 (7), 2840–2846.
Gallinger, S., et al., 1990. Comparación de inmunoterapias celulares y anti-CD3 en el
tratamiento de metástasis hepáticas experimentales MCA-38-LD en ratones C57BL/6. Cáncer
Res. 50 (8), 2476–2480.
Gao, Q., et al., 2007. El equilibrio intratumoral de las células T reguladoras y citotóxicas está asociado
con pronóstico de carcinoma hepatocelular después de la resección. J. Clin. oncol. 25 (18),
2586–2593.
Harmsen, M., De Haard, H., 2007. Propiedades, producción y aplicaciones de los camélidos
fragmentos de anticuerpos de un solo dominio. aplicación Microbiol. Biotecnología. 77 (1), 13–22.
Hellström, I., et al., 2001. Activación mediada por CD3 de linfocitos reactivos a tumores de
pacientes con cáncer avanzado. proc. Nat. Academia ciencia EE. UU. 98 (12), 6783–6788. Heo, L., Park,
H., Seok, C., 2013. GalaxyRefine: refinamiento de la estructura de proteínas impulsado por
reempaquetado de cadena lateral. Ácidos Nucleicos Res. 41 (W1), W384–W388.
Hirsch, R., et al., 1989. Efectos de la administración in vivo del anticuerpo monoclonal anti-CD3
sobre la función de las células T en ratones. II. Activación in vivo de células T. J. Immunol. 142 (3),
737–743.
Kolkman, JA, Law, DA, 2010. Nanocuerpos: de llamas a proteínas terapéuticas. Droga
Descubrir Hoy Tecnología. 7 (2), e139–e146.
Kufer, P., Raum, T., 2011. Cadena única biespecífica de dominio único específica de especies cruzadas
Anticuerpo. Patentes de Google.
Laskowski, RA, Swindells, MB, 2011. LigPlot+: Interacción entre múltiples ligandos y proteínas
Diagramas para el descubrimiento de fármacos. Publicaciones de la AEC.
Le Gall, F., et al., 2004. Propiedades inmunosupresoras de Fv de cadena sencilla anti-CD3 y
diacuerpo J. Immunol. Métodos 285 (1), 111–127.
Leem, J., et al., 2016. ABodyBuilder: predicción automatizada de estructuras de anticuerpos con datos
estimación de precisión impulsada. mAbs 8 (7), 1259–1268.
181
Inmunología molecular 118 (2020) 174–181
Liao, K., Lo, Y., Roffler, S., 2000. Activación de linfocitos por anti-CD3 monocatenario
dímeros de anticuerpos expresados en la membrana plasmática de las células tumorales. Gene Ther. 7 (4), 339.
Mehta, DS, et al., 2010. Modulación parcial y transitoria del receptor de células T CD3
complejo, provocado por regímenes de dosis bajas de anti-CD3 monoclonal, es suficiente para
inducir la remisión de la enfermedad en ratones diabéticos no obesos. Inmunología 130 (1), 103–113.
Micke, P., et al., 2014. Claudina 6 y 18.2 activadas de forma aberrante como terapia potencial
dianas en el cáncer de pulmón de células no pequeñas. En t. J. Cáncer 135 (9), 2206–2214. Mosmann,
T., 1983. Ensayo colorimétrico rápido para el crecimiento y la supervivencia celular: aplicación
a ensayos de proliferación y citotoxicidad. J. Immunol. Métodos 65 (1-2), 55–63.
Nakajima, F., et al., 1994. Inmunoterapia con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y
interleucina 2 recombinante: estimulación de programas moleculares de células asesinas
citotóxicas e inducción de regresión tumoral. proc. Nat. Academia ciencia EE. UU. 91 (17),
7889–7893. Noori, S., Hassan, ZM, 2011. La dihidroartemisinina cambia la respuesta inmune hacia
Th1, inhibe el crecimiento tumoral in vitro e in vivo. Celúla. inmunol. 271 (1), 67–72. Quezada,
SA, et al., 2010. Las células T CD4+ reactivas a tumores desarrollan actividad citotóxica y
erradicar el melanoma grande establecido después de la transferencia a huéspedes linfopénicos. Exp. J.
Medicina. 207 (3), 637–650.
Ruffini, E., et al., 2009. Importancia clínica de los linfocitos infiltrantes de tumores en el pulmón
neoplasias Ana. toraco Cirugía 87 (2), 365–372.
Saerens, D., Ghassabeh, GH, Muyldermans, S., 2008. Anticuerpos de dominio único como
bloques de construcción para nuevas terapias. actual Opinión Farmacol. 8 (5), 600–608.
Sato, E., et al., 2005. Linfocitos infiltrantes de tumores CD8+ intraepiteliales y una alta
La relación CD8+/células T reguladoras se asocia con un pronóstico favorable en el cáncer de
ovario. proc. Nat. Academia ciencia EE. UU. 102 (51), 18538–18543.
Schattner, EJ, et al., 1996. Inducción de células T CD4+ de apoptosis mediada por Fas en la enfermedad de Burkitt.
células B del linfoma. Sangre 88 (4), 1375–1382.
Thomas, WD, Hersey, P., 1998. El ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL) induce
apoptosis en células de melanoma resistentes al ligando Fas y media la destrucción de células diana
por células T CD4. J. Immunol. 161 (5), 2195–2200.
Urba, WJ, et al., 1992. Tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-CD3 de pacientes con CD3-
tumores negativos: un estudio de fase IA/B. Cáncer Res. 52 (9), 2394–2401.
Van Wauwe, JP, De Mey, JR, Goossens, JG, 1980. OKT3: una T monoclonal antihumana
Anticuerpo linfocitario con potentes propiedades mitogénicas. J. Immunol. 124 (6),
2708–2713.
Walser, TC, et al., 2018. Microenvironment and Lung Cancer, en IASLC Thoracic
Oncología. Elsevier, págs. 121–128 e4.
Webb, B., Sali, A., 2014. Modelado comparativo de estructuras de proteínas utilizando MODELLER. actual
Protocolo Bioinformática 47 (1) p. 5.6. 1-5.6. 32.
Wu, Z., Cheung, N., 2017. Anticuerpo biespecífico que interacciona con células T (T-BsAb): de la tecnología
a la terapéutica. Farmacol. El r.
Xie, Y., et al., 2010. Células T CD4+ específicas de tumores ingenuos diferenciadas in vivo para erradicar
melanoma establecido. Exp. J. Medicina. 207 (3), 651–667.
Yang, SC, et al., 1990. Inmunoterapia combinada exitosa para la generación in vivo
de actividad antitumoral con anti-CD3, interleucina 2 y factor de necrosis tumoral α. Arco.
Cirugía 125 (2), 220–225.
Yoshizawa, H., et al., 1991. Activación por anti-CD3 de células de ganglios linfáticos que drenan tumores
para la inmunoterapia adoptiva específica. Celúla. inmunol. 134 (2), 473–479.
Zhang, L., et al., 2003. Células T intratumorales, recurrencia y supervivencia en ovario epitelial
cáncer. N. ingl. J.Med. 348 (3), 203–213.