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Maurya et al. Enfermedades Infecciosas de BMC (2020) 20: 677

https://doi.org/10.1186/s12879-020-05372-1

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN Acceso abierto

Un epítopo de células T múltiple que comprende

una vacuna de ADN aumenta la eficacia protectora
de Bacillus Calmette-Guérin (BCG) contra
Tuberculosis micobacteriana
Sudeep Kumar Maurya1, Mohammad Aqdas1, Deepjyoti Kumar Das1, Sanpreet Singh1, Sajid Nadeem1,
Gurpreet Kaur1 y Javed Naim Agrewala1,2 *

Abstracto

Fondo: Aproximadamente del 80% al 90% de las personas infectadas con latente Mycobacterium tuberculosis (Mtb)
permanezcan protegidos durante toda su vida. Se sabe que la liberación de antígenos únicos en fase latente tiene un papel
protector en la respuesta inmune contraMtb. Aunque la vacuna BCG se ha administrado durante nueve décadas para
proporcionar inmunidad contra Mtb, el número de casos de tuberculosis sigue aumentando, lo que genera dudas sobre la
eficacia de la vacuna BCG. Las deficiencias de BCG se han asociado con un procesamiento y presentación inadecuados de sus
antígenos, una incapacidad para activar de manera óptima las células T contraMtb, y generación de células T reguladoras.
Además, la vacunación con BCG carece de la capacidad de eliminarMtb infección. Con estos hechos en mente, seleccionamos
seis epítopos de células T CD4 y CD8 inmunodominantes deMtb expresada durante las etapas latente, aguda y crónica de la
infección y diseñó una vacuna de ADN basada en múltiples epítopos (C6).
Resultado: Los ratones BALB / c vacunados con la construcción C6 junto con una vacuna BCG exhibieron una expansión de
las poblaciones de memoria de células T CD4 y CD8 y una liberación de citocinas de IFN-γ y TNF-α aumentada. Además, se
observó una mejora de la activación de células dendríticas y macrófagos. En consecuencia, ilustrando la obtención de
inmunidad que ayuda en la protección contraMtb infección; que fue evidente por una reducción significativa en elMtb
carga en los pulmones y el bazo de los animales a los que se administró BCG C6 +.
Conclusión: En general, los resultados sugieren que un enfoque de vacunación C6 + BCG puede servir como una estrategia de
vacunación eficaz en los intentos futuros de controlar la tuberculosis.

Palabras clave: Células T, Epítopos, Vacuna de ADN, BCG, Tuberculosis

* Correspondencia: jagrewala@gmail.com
1CSIR-Instituto de Tecnología Microbiana, Chandigarh 160036, India

2Dirección actual: Instituto Indio de Tecnología, Rupnagar 140001, India

© El autor (es). 2020Acceso abierto Este artículo tiene la licencia de Creative Commons Attribution 4.0 International License, que permite el uso,
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Fondo
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) mata a 1,5 millones de
personas anualmente [1]. Además, la creciente frecuencia deMtb
Los casos que presentan farmacorresistencia justifican la
necesidad de desarrollar mejores vacunas o estrategias para la
prevención y el tratamiento de la tuberculosis [2]. La única vacuna
disponible para la tuberculosis es una forma atenuada de
Mycobacterium bovis nombrado como Bacilo de Calmette – Guérin
(BCG) [3]. La eficacia de BCG es baja en poblaciones con una alta
carga de TB [4]. BCG ha demostrado su eficacia contra la infancia,
pero no la manifestación de la enfermedad en la edad adulta, lo
que representa una incapacidad para generar células T de
memoria duraderas contraMtb. BCG ha perdido la región RD1 de
su genoma. Aunque RD1 proporciona virulencia enMtb, También
evoca una fuerte inmunidad protectora contra la bacteria, lo que
significa que BCG requiere suplementación con ciertos Mtb
proteínas para mejorar su eficacia protectora [5, 6]. En este
sentido, se realizaron varios estudios de refuerzo primario con
BCG, como vacunas de subunidades basadas en proteínas y
péptidos, vacunas vivas atenuadas y vectores virales con
resultados prometedores [7].
Recientemente, desarrollamos una vacuna de péptido
promiscuo lipidado que comprende los epítopos de células T CD4
y CD8 inmunodominantes de las proteínas Acr1 y TB10.4 deMtb
conjugado con el ligando Pam2Cys de TLR-2 [8, 9]. Estas
construcciones provocaron una respuesta duradera de las células
T de memoria y mostraron una mejor protección que BCG en
modelos de TB de ratón y cobaya. Varias ventajas están asociadas
con las vacunas de péptidos, tales como la selección de restos
inmunodominantes y la eliminación de porciones supresoras y
autorreactivas del antígeno. Sin embargo, existen ciertos
problemas asociados con las vacunas peptídicas debido a su
rentabilidad y síntesis para la inmunización masiva. Por lo tanto, la
expresión de los epítopos inmunodominantes dentro del huésped
podría ser un modo eficaz de eliminar los problemas. Un modo
eficaz de expresar los epítopos sería la estrategia de vacuna de
ADN. Una de las principales ventajas de las vacunas de ADN es que
son más sencillas de producir y almacenar en comparación con las
vacunas convencionales, lo que las hace menos costosas. Las
vacunas de ADN pueden provocar la generación de células CD4
Th1, Células T CD8 e inmunidad duradera; la respuesta inmune
que juega un papel fundamental en la protección contraMtb [10].
tabla 1 Epítopos de células T seleccionados
No Señor. Proteína
1 TB10.4(1–13)
2 TB10.4(78–94)
3 Rv0476(1–19)
4 CFP10(71–90)
5 Acr1(91-110)
6 Acr1(21–40)
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Esto nos animó a diseñar una vacuna de ADN que
comprenda seis epítopos de latencia, etapas activa y crónica
de células T CD4 y células T CD8. Mtb. Para comprobar la
eficacia de la vacuna, es importante utilizar un modelo animal
de TB y los ratones son muy útiles ya que su respuesta inmune
adaptativa es similar a la de los humanos. Por lo tanto,
inmunizamos ratones con la vacuna de ADN y observamos la
inducción de una respuesta inmune protectora que redujo
significativamente la frecuencia de bacterias en los animales
expuestos aMtb. Además, la vacuna mejoró
considerablemente la eficacia de BCG para proteger contra
Mtb. Esta vacuna puede tener implicaciones futuras para
proteger a las personas de la tuberculosis.
Resultados
Selección de epítopos de células T y construcción de su
secuencia.
Para aumentar la eficacia de BCG, se seleccionaron epítopos de
células T inmunodominantes de diferentes espectros de TB
latente, activa y crónica de la literatura publicada [11-14]. Los
epítopos eran promiscuos y mostraban el potencial de provocar
una respuesta de células T CD4 y células T CD8 contraMtb. Todos
los epítopos exhibieron la capacidad de unirse a diversas
moléculas de HLA. Los seis epítopos de células T más
inmunodominantes se seleccionaron de Acr1, TB10.4, CFP10 y
Rv0476Mtb antígenos (Tabla 1). Las secuencias se ordenaron por
duplicado para aumentar la dosis del antígeno (Fig.1a). Para
segregar péptidos durante el proceso de presentación de
antígenos, los péptidos elegidos se diseñaron para tener
enlazadores que pudieran ser escindidos específicamente por
proteasas presentes en células presentadoras de antígeno (APC).
Para lograr esto, se comprobó la sensibilidad de las secuencias de
péptidos a las proteasas mediante el software in silico PROSPER [
15]. Se descubrió que el péptido Rv0476 era más sensible a la
escisión enzimática y, por lo tanto, se usó como enlazador entre
los epítopos (Fig. Complementaria.1a). La secuencia de
aminoácidos AVYAFVH del epítopo Rv0476(1–19) se utilizó como
enlazador entre los epítopos. La secuencia inicial de dos
aminoácidos es variable debido a la presencia de una secuencia de
aminoácidos cargada de manera similar al final de los epítopos.
Para introducir una señal secretora en la proteína, agregamos un
Secuencia Espectro de TB Referencia
MSQIMYNYPAMLG Activo [12]
ANTMAMMARDTAEAAKW Activo [12]
MLVLLVAVLVTAVYAFVHA Activo y latente [13]
EISTNIRQAGVQYSRADEEQ Activo [14]
SEFAYGSFVRTVSLPVGADE Latente [11]
LFAAFPSFAGLRPTFDTRLM Latente [11]
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Figura 1 La construcción del gen C6. a Representación esquemática de la disposición de la secuencia C6. La adición de la propiedad secretora de C6 fue analizada
por Signal-p 4.1.B El gráfico generado por Signal-p 4.1 muestra la capacidad de secreción en el huésped y el sitio de escisión entre las posiciones 26 y 27. C PROSPER
resultado del análisis de secuencia obtenido después de la adición de la secuencia enlazadora (caja negra) entre los epítopos exhibió una mayor sensibilidad a las
proteasas. D Las seis secuencias de péptidos (azul) alineadas por duplicado se unieron mediante una secuencia enlazadora sensible a proteasa (negrita) con señal
secretora N terminal de la hormona del crecimiento humana (gris negrita)

N Secuencia terminal de la hormona del crecimiento humano (HGH),
como señal secretora [dieciséis]. La secuencia completa (denominada y
en lo sucesivo denominada C6) se ensayó adicionalmente para
determinar su capacidad secretora en células huésped de mamífero.
Para analizar su lanzamiento se utilizó el servidor Signal 4.1 [17]. El
servidor Signal 4.1 mostró la señal secretora N terminal con capacidad
de secreción de proteína y su sitio de escisión (Fig.1B). La secuencia de
aminoácidos completa se analizó nuevamente en PROSPER para
verificar la sensibilidad a la proteasa.
de los enlazadores. El resultado indicó una mayor sensibilidad de
los enlazadores en comparación con el resto de la secuencia (Fig.1
C). La secuencia de aminoácidos final de C6 se utilizó para la
síntesis de genes (Fig.1d, Fig. complementaria. 1B).
Análisis de expresión de la construcción genética basada en el epítopo de
células T seleccionado
Para utilizar el gen C6 como vacuna, se debe utilizar un vector
adecuado para su expresión. En consecuencia, el gen C6
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se clonó en pcDNA3.1 (-) para inmunización. Se generaron
variantes marcadas con fluorescencia amarilla para el análisis
de expresión (Fig.2a, Fig. complementaria. 2C.A).
Transfectamos el gen C6 en células CHO y posteriormente
verificamos su expresión. Las células C6 marcadas con YFP se
observaron bajo un microscopio de fluorescencia (Fig.2B). Las
células transfectadas se analizaron adicionalmente mediante
citometría de flujo. La disminución de la intensidad de la
fluorescencia indicó la expresión de la proteína adicional (C6)
con YFP (Fig. Complementaria.3a, b).
Además, el lisado celular total de células CHO transfectadas y el
precipitado de SN de cultivo se usó para transferencia Western.
Las células que expresan YFP con C6 se observaron como una
banda de 57 kDa de peso molecular (mwt) en la transferencia. El
YFP solo apareció a un peso molecular de 25 kDa. La expresión de
YFP unido a C6 indica la secreción de proteína en SN (Fig.2C).
Tanto la microscopía fluorescente como los resultados de la
transferencia Western confirmaron la expresión in vitro de C6.
Es importante que una vacuna de ADN se exprese en las células
huésped y posteriormente produzca antígenos y cebe las células
del sistema inmunológico. Para lograr esto, los ratones se
inmunizaron por vía intramuscular (im) con el plásmido C6YFP y el
vector de control. Los animales se dejaron reposar durante 3d y se
comprobó la expresión de YFP en los ganglios linfáticos.

Figura 2 El gen C6 construido expresa proteína quimérica. a Mapa de vectores de la vacuna de ADN donde se clona C6 entre los sitios BamHI y HindIII. B Las células CHO se
transfectaron con los plásmidos pcDNA3.1-C6, pEYFP de control y pEYFPC6. Después de 24 h, las células se analizaron con un microscopio fluorescente. Las células CHO transfectadas
con plásmidos se recogieron después de 24 h de transfección.C El C6 que expresa YFP se evaluó tanto en el lisado celular como en las SN de las células CHO transfectadas mediante
transferencia Western. Las bandas de proteínas en el recuadro significan un cambio de la banda YFP de 25 a 57 kDa.D Se inoculó C6 en la extremidad trasera de ratones. Tres días
más tarde, las células de los LN inguinales y los músculos de las extremidades traseras se recogieron y se controlaron mediante microscopía confocal para determinar la expresión
de YFP. Las células de los ganglios linfáticos y las células de las extremidades traseras mostraron expresión de YFP. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes
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y músculos de las extremidades posteriores mediante microscopía
confocal. Observamos la expresión de YFP en ambos tipos de células,
confirmando así la expresión de C6 in vivo (Fig.2D).
La inmunización con BCG + C6 aumenta la memoria de las células T
Después de la confirmación de la expresión de YFP, queríamos
comprobar la viabilidad de C6 como candidata a vacuna y su
capacidad para mejorar la eficacia de BCG. Por lo tanto,
inmunizamos ratones con BCG, C6 y controles (Negativo, control
de vector), posteriormente infectándolos con aerosol Mtb.
Después de 30 días evaluamos la respuesta inmune de cada grupo
(Fig.3a). La generación de células T de memoria persistente contra
un patógeno es esencial para cualquier vacuna exitosa. PPD es
una rica fuente deMtb antígenos y se utiliza para comprobar la
respuesta inmunitaria contra Mtb. Hemos utilizado 6 epítopos de
células T diferentes de Mtb en la vacuna de ADN para inducir una
respuesta inmune contra estos epítopos. Por lo tanto, también es
importante verificar la respuesta inmune contra estos epítopos.
Por lo tanto, examinamos la respuesta de memoria de las células T
después de la inmunización con C6. Los linfocitos derivados del
bazo y los ganglios linfáticos se estimularon in vitro con PPD o con
una mezcla de péptidos para controlar la expresión de los
marcadores de memoria CD44Hola y CD62LHola en células T CD4 y
CD8 (Fig. 3bg). Observamos un mayor porcentaje de CD62LHola
CD44Hola
que expresan células T CD4 de memoria (PPD: p < 0,05) y
células T CD8 (PPD: p < 0,05) en ratones inmunizados con C6,
en comparación con BCG en estimulación in vitro con PPD (Fig.
3bd). Sin embargo, la estimulación in vitro con péptidos C6
mostró un aumento no significativo en la frecuencia de las
células T CD4 y CD8 de memoria (Fig.3p.ej). Además,
observamos que C6 reforzó la generación de células T CD4 de
memoria (PPD:p < 0,05, péptidos: (p < 0,005) y células T CD8
(PPD: p < 0,05, péptidos: (p < 0,05) en el grupo que fue
vacunado con BCG (BCG + C6) en comparación con BCG solo.
Además, observamos una expansión en el grupo de células T
de memoria en los pulmones de los mismos animales (Fig.4
anuncio). Estos resultados indican el potencial de C6 no solo
para expandir las células T CD4 de memoria y las células T
CD8, sino también para impulsar la generación de células T de
memoria asociadas con BCG.
La administración combinatoria de BCG + C6 mejora la
secreción de IFN-γ, TNF-α e inhibe la liberación de IL-10
El desarrollo de una respuesta inmune Th1 es crucial para combatir
Mtb infección [18]. Tanto el IFN-γ como el TNF-α liberados por las
células Th1 cumplen una función importante enMtb infección mediante
la activación de células fagocíticas [19]. Por lo tanto, verificamos si la
inmunización con BCG + C6 puede mejorar la secreción de IFN-γ y TNF-
α mediante estimulación in vitro con PPD.

Fig. 3 La inmunización con BCG y C6 aumenta la respuesta de las células T CD4 de memoria y de las células T CD8. a Ratones inyectados con C6 y grupos de control con
BCG, C6 + BCG, BCG + Vector, plásmido y desafiados con Mtb. Treinta días después, se recolectaron linfocitos de bazo y ganglios linfáticos y se estimularon in vitro con
PPD (25 µg / ml) y péptidos C6. ser Las gráficas de contorno representan el porcentaje de población de CD62LHolaCD44Hola células T CD4 de memoria central y células T
CD8 sobre (a) PPD y (B) Estimulación de péptidos C6. Los diagramas de barras son representativos del porcentaje de población de células T CD4 y CD8 en (CD) PPD y (f,
g) estimulación de péptidos. El número en el recuadro significa el porcentaje de celdas. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. *pag ≤
0.05, ** pag ≤ 0,005
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y péptidos. Se encontró que la inmunización con BCG + C6
aumentó significativamente la producción de IFN-γ (PPD:p < 0,05,
péptidos: p < 0,05) y TNF-α (PPD: p < 0,05, péptidos: p < 0,005) en
comparación con un control de vectores. Encontramos que la
vacunación con BCG sola no mostró un aumento significativo en
dicha producción de citocinas (Fig.4a, b). C6 solo mostró aumentos
insignificantes en la liberación de IFN-γ y TNF-α.
Sorprendentemente, observamos un aumento en el nivel de IL-10.
(p < 0,05) en el grupo inmunizado con BCG en comparación con el
control del vector. En contraste, la producción de IL-10 en
animales inmunizados con BCG + C6 fue significativamente menor
(p < 0,05) tras la inmunización en comparación con el control de
BCG, lo que indica una capacidad para promover la respuesta Th1
(Fig. 4C). Estos resultados apoyan la generación de inmunidad Th1
contraMtbtras la inmunización con BCG + C6.
La inmunización con C6 promueve la activación de las células
presentadoras de antígenos
El sistema inmunológico responsable del aclaramiento de patógenos
son principalmente las células presentadoras de antígenos (APC), como
los macrófagos y las células dendríticas (DC) [20, 21].
Mtb se sabe que modula las APC para prevenir la activación y
expresión de MHC y moléculas coestimuladoras [20-22]. Por lo
tanto, queríamos examinar el estado inmunológico de las APC
en los pulmones tras la administración de C6 deMtb ratones
infectados. Se encontró que tras la estimulación con LPS, el
porcentaje de MHC-IIHola, CD86Holay CD40Hola La expresión de
CD aisladas de los pulmones fue mayor en las inoculaciones
de C6 y BCG + C6 en comparación con sus respectivos
controles (vector, BCG) (Fig. 5a, b). De manera similar, el
porcentaje de MHC-IIHola, CD86Holay CD40Hola Los macrófagos
que expresan también fueron más altos en los grupos C6 y
BCG + C6 que en los controles (Fig.5CD). Sin embargo, hubo
una disminución considerable en el porcentaje de población
de CD80Hola expresando DC y macrófagos. Se observaron
resultados similares con CD y macrófagos aislados del bazo y
los ganglios linfáticos (Fig. Complementaria.5ae).
Entre varias citocinas producidas por las CD activadas, la IL-6 y la
IL-12 son bastante cruciales, ya que desempeñan un papel
fundamental en la diferenciación de las células T CD4 vírgenes en
células Th1 [20, 21] Curiosamente, observamos que

Figura 4 La inmunización con C6 promueve la secreción de IFN-γ y TNF-α y disminuye la liberación de IL-10. Treinta días después de laMtb desafío, los linfocitos del
bazo y los ganglios linfáticos aislados de los animales inmunizados con BCG + C6 y de control se estimularon in vitro durante 72 h con PPD y péptidos.
Posteriormente, los SN de cultivo fueron recolectados y monitoreados por ELISA para la producción dea IFN-γ; B TNF-α; yC IL-10. Los datos mostrados como media ±
SEM son de pocillos por triplicado de dos experimentos independientes. *p < 0.05, ** p < 0,005, *** p < 0,0005, **** p < 0,0001
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Figura 5 Los animales inmunizados con C6 muestran una mejor activación de las CD y los macrófagos y aumentan la secreción de IL-6 e IL-12. Las células aisladas
de los pulmones de los ratones inmunizados con C6 y los grupos de control (vector, BCG, BCG + Vector C6 + BCG) se estimularon in vitro con LPS (1 μg / ml) durante
24 h.a, c histograma y sus respectivos (b, d) el diagrama de barras significa el porcentaje de población de MHC-IIHola, CD80Hola, CD86Hola, CD40Hola expresión en
(a) Países en desarrollo; (C) macrófagos. Los datos (medias ± SEM) se representan como porcentaje de células positivas de dos experimentos independientes.ef Los SN de cultivo se
obtuvieron de cultivos de linfocitos estimulados con LPS para estimar la secreción de mi IL-6; F IL-12; gramo IFN-γ; h TNF-α. Los datos mostrados como media ± SEM se obtienen de
pocillos por triplicado de dos experimentos independientes. *pag ≤ 0.05, ** pag ≤ 0,005, *** pag ≤ 0,0005
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en comparación con los grupos de control (vector, BCG), los
ratones inoculados con BCG + C6 exhibieron una producción
significativamente mayor de IL-6 (p < 0,05, p < 0.01) e IL-12 (p <
0,001) (Fig. 5e, f). Tras la activación, las células dendríticas y los
macrófagos producen citocinas proinflamatorias [23-26].
Monitoreamos IFN-γ y TNF-α en el sobrenadante de cultivo de
linfocitos estimulados con LPS y observamos IFN-γ elevado (p <
0,005) y TNF-α (p < 0,05) en el grupo BCG + C6 en comparación con
el vector. Los ratones tratados con BCG no provocaron la misma
respuesta (Fig.5g, h). Estos resultados significan el importante
papel de C6 en la generación de una respuesta inmune favorable
para aclararMtb infección.
La administración de BCG con C6 se redujo significativamente Mtb
carga y patología de la enfermedad
Además, evaluamos el papel protector de C6 en la reducción de la
carga de micobacterias pleurales en Mtb-animales infectados. Los
ratones inyectados con C6 se reforzaron dos veces con C6.
Después de 45 días, fueron desafiados en aerosol conMtb. MtbLa
carga en los pulmones y el bazo se evaluó 30 días después de la
infección. El análisis histopatológico reveló una reducción en la
patología de la enfermedad tanto en los pulmones como en el
bazo de los grupos C6 y BCG + C6, en comparación con los grupos
negativos y de vector. Hubo una menor infiltración de linfocitos
peribranquiales en los pulmones, así como una disminución del
número de folículos en el bazo de C6 y BCG + C6.
ratones vacunados (Fig. 6a, b). Además, los animales vacunados
con C6 mostraron una reducción significativa (p < 0,05) en Mtb
UFC, en comparación con los grupos de control negativos no
vacunados e inoculados con vector (Fig. 6C). Restricción en la
difusión deMtb al bazo fue observado y confirmado por una
reducción significativa en Mtb CFU (Fig. 6D). Fue sorprendente
observar que aunque C6 indujo una mejor respuesta inmune (Figs.
2, 3, 4 y 5) que los ratones vacunados con BCG, la disminución de
UFC fue similar a la de los ratones vacunados con BCG. Además,
los animales BCG + C6 mostraron una disminución
significativamente mejor en la carga bacteriana (p <0,05), en
comparación con los ratones vacunados con BCG, lo que indica un
efecto sinérgico entre ambas vacunas. Estos resultados indican
que la eficacia de la protección BCG puede reforzarse
considerablemente mediante la coadministración de la
construcción C6 que expresa los epítopos de células T
inmunodominantes deMtb.
Discusión
El bajo rendimiento de BCG en áreas endémicas de TB puede
justificarse con múltiples explicaciones. BCG protege la
manifestación infantil pero no adulta de la tuberculosis [27-30]. Lo
que significa que carece del repertorio antigénico que se requiere
para inducir células T protectoras de memoria de larga duración.
En consecuencia, complementandoMtb Los epítopos antigénicos
en BCG pueden reforzar su desempeño. Por lo tanto, en el

Figura 6 El refuerzo de cebado con C6 + BCG protege contra la infección por Mtb. Los ratones inyectados con BCG + C6 se reforzaron con C6 y los grupos de control
con vector solo o con PBS en un intervalo de 15 días. Después de 45 días, los ratones se infectaron conMtb. Treinta días después, el Mtb La carga en los pulmones y
el bazo se enumeró mediante UFC. Histopatología dela pulmón (10x) y B cortes de bazo (40x) teñidos con hematoxilina-eosina. CD El diagrama de barras significa las
UFC por gramo de tejido pulmonar y del bazo. La intensidad del color azul indica infiltración y consolidación. Los datos son representativos de 3 experimentos
independientes con 3 animales en cada grupo. Los resultados mostrados como diagrama de barras (media ± SEM) son datos agrupados de 3 experimentos
independientes. *pag ≤ 0.05, ** pag ≤ 0,005, **** pag ≤ 0,0001
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En el estudio actual, seleccionamos múltiples epítopos de las
etapas latente, activa y crónica de la TB y sintetizamos una vacuna
de ADN para verificar su eficacia, ya sea sola o en una combinación
de BCG.
Se ha informado anteriormente que la proteína Acr1 proporciona
una mayor eficacia protectora cuando se sobreexpresa en BCG [31]. Sin
embargo, Acr1 afecta la maduración y la funcionalidad de las CD y
apoya la supervivencia intracelular deMtb [22, 32]. De manera similar,
se ha demostrado que la proteína Rv2626c protege contraMtb, así
como modular la funcionalidad de los macrófagos y ayudar en el
escape de patógenos [33, 34]. Por lo tanto, la expresión de epítopos de
células T CD4 y células T CD8 en una vacuna de ADN con BCG puede ser
un mejor enfoque para combatir la TB. Los epítopos de células T
promiscuos tienen suficiente potencial para unirse a diversos alelos de
HLA y evocar la activación de las células T sin requerir un
procesamiento extenso de antígenos por APC [8, 35]. Sin embargo, las
vacunas de péptidos son inmunógenos débiles y, por lo tanto,
requieren adyuvantes para provocar una activación óptima de las
células T.
Por lo tanto, seleccionamos y expresamos múltiples epítopos de
células T de las etapas latente, activa y crónica de la TB en el vector
de ADN para superar los límites asociados con BCG. Las vacunas
de ADN pueden inducir respuestas tanto de células T CD4 como de
células T CD8 contra los antígenos que se expresan [10]. Esta
capacidad ha llevado al desarrollo de muchas vacunas veterinarias
y ensayos clínicos en humanos que involucran Zika, VIH, dengue y
enfermedades cancerosas [36-40]. En relación con la tuberculosis,
las vacunas de ADN han demostrado tener potencial para
combatir la infección [41-46]. En este sentido, seleccionamos seis
epítopos promiscuos de células T CD4 y células T CD8 de los
diferentesMtb proteínas [11-14] y los clonó en el plásmido
pcDNA3.1 (-). La novedad de la construcción C6 es que tiene 2
copias de cada epítopo enlazadas con secuencias de aminoácidos
sensibles a proteasas. Esto permite la escisión de la proteasa
mediada por APC y la liberación final de las células que expresan
C6 con la ayuda de una señal secretora (Fig.1). Además, el uso de
un vector de plásmido ayuda a provocar la respuesta de las células
T CD8 [47]. Generamos el constructo informador YFP con C6
clonándolo en el plásmido pcDNA3.1 (-) y pEYFP para evaluar su
expresión y secreción. Confirmamos la expresión de C6 junto con
YFP in vitro en las células CHO mediante imágenes de
fluorescencia, así como mediante transferencia Western (Fig.2).
Además, era importante que la construcción se expresara in vivo
para provocar una respuesta inmune. Inmunizamos animales con
C6 y observamos células que expresan YFP en los ratones,
confirmando así la expresión de C6. Además, examinamos si la
vacuna C6 podría mejorar la eficacia de BCG. Evaluamos la
capacidad de refuerzo de C6 en ratones vacunados con BCG.
Observamos los siguientes resultados importantes en la
vacunación C6: (1) generación de células T CD4 de memoria y
células T CD8; (2) mejora en las respuestas Th1, como lo
demuestra la secreción predominante de IFN-γ y TNF-α; (3)
promoción
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de la activación de APC; (4) refuerzo de la eficacia
protectora de BCG contraMtb.
La memoria inmunológica es una característica indispensable de
la inmunidad adaptativa que protege a los organismos de
infecciones posteriores [48]. Además, es una característica
fundamental de una vacuna exitosa [49]. La generación de células
T de memoria a corto plazo es una de las razones por las que el
BCG no imparte protección contraMtb en la población adulta
vacunada [50]. Sorprendentemente, BCG genera una mejor
respuesta de las células T CD4 de memoria y de las células T CD8
con la adición de la respuesta de memoria de C6 (Fig.3). La mejora
en la respuesta de la memoria se pudo observar debido a la
respuesta inmune específica del epítopo de generación. Se ha
informado que la población de células T en reposo con fenotipo no
tratado, es decir, CD62LHola/ CD44lo puede conferir protección
contra Mtb [51, 52]. El aumento de la población en reposo tras la
administración de C6 denota la mejora en la generación de
población en reposo, que es importante para la respuesta de
recuerdo. Curiosamente, C6 potenció la capacidad de BCG para
aumentar CD62LHola/ CD44lo. Disminuyó el porcentaje de CD44Hola/
CD62Llo
células en C6 y BCG + C6 indica la capacidad de las células
efectoras para transitar hacia la célula de memoria que está
pobremente asociada con BCG y explica su falla en
persistencia Mtb infecciones [53-55].
Los subconjuntos de células T CD4 expresan distintas
citocinas y factores de transcripción, respondiendo así a
diferentes patógenos. Las células Th1 protegen contraMtb
secretando IFN-γ y TNF-α y estimulando macrófagos para
matar patógenos intracelulares [56, 57]. La importancia de
IFN-γ se ilustra ya que su ausencia mejoraMtb susceptibilidad,
mortalidad y defectos en la activación de macrófagos [58].
Para iniciar y mantener la defensa contraMtb,El TNF-α juega
un papel crucial en la reactivación de la tuberculosis latente de
los pacientes con artritis reumatoide durante la neutralización
por el anticuerpo anti-TNF [59]. Por lo tanto, la generación de
inmunidad Th1 por una vacuna es crucial para proteger contra
la TB. La obtención de un mayor rendimiento de IFN-γ y TNF-α
por BCG + C6 denota su potencial para generar una respuesta
Th1 (Fig.4). La IL-10 es producida por las células Th2 y puede
regular recíprocamente la generación de células Th1, así como
los macrófagos y las CD para activar las células Th1 [60, 61].
Además, se ha demostrado que las células dendríticas
infectadas con BCG generan células T productoras de IL-10 [62
]. observamos una expresión elevada de IL-10 en el grupo
inmunizado con BCG. Por el contrario, C6 solo y junto con la
inmunización con BCG disminuyó la secreción de IL-10, lo que
indica su capacidad para promover las células Th1.
La importancia de las células presentadoras de antígenos
(APC), como las CD y los macrófagos, en la protección contra la
tuberculosis está bien aclarada [21]. Además de fagocitar y
matar a los patógenos, estas células procesan y presentan
simultáneamente los componentes patógenos para activar y
Maurya et al. Enfermedades Infecciosas de BMC (2020) 20: 677
diferenciar las células T en células T efectoras y de memoria. Estas
células T activadas ayudan a reforzar la función de las APC para
liberar citocinas como IFN-γ y TNF-α [49, 56, 57].
Mtb puede modular las APC para restringir la generación de
inmunidad adaptativa. Mtb inhibe la maduración de las APC al
prevenir la presentación de antígenos a través de MHC junto
con moléculas coestimuladoras como CD86, CD40 y CD80
enmascara la capacidad de activar células T específicas de
antígeno [63, 64]. Curiosamente, las vacunas de ADN pueden
activar APC interactuando con TLR9 [sesenta y cinco]. Cabe
mencionar aquí que la activación de CD y macrófagos en
animales inmunizados con BCG + C6 fue mayor, como lo
demuestra el mayor porcentaje de MHC-IIHola, CD86Hola, y CD40
Hola moléculas coestimuladoras que expresan células (Fig. 5).
CD80 interactúa preferiblemente con la molécula CTLA-4 de
células T y débilmente con CD28 y está relacionada con la
generación de células T anergéticas y tolerogénicas [66]. La
reducción de CD80Hola El porcentaje de población de CD y
macrófagos en BCG + C6 apoya la generación de células T
patógenas en lugar de tolerancia. Para activar las células T y
generar células T efectoras y de memoria, las CD y los
macrófagos producen IL-6 e IL-12. Por lo tanto, la activación y
secreción de IL-6 e IL-12 son cruciales para las APC [18]. El
aumento de la producción de IL-6 e IL-12 en el grupo BCG + C6
indica la capacidad mejorada de las CD y los macrófagos para
activar las células T. De manera similar, el papel de IFN-γ y
TNF-α se ha correlacionado con la funcionalidad de las CD y
los macrófagos [67, 68]. Por tanto, la producción de IFN-γ y
TNF-α indica la activación de DC y macrófagos.
Aparte de la generación de una activación óptima del sistema
inmunológico, una característica fundamental de una vacuna es
restringir la infección. Durante la progresión de la TB, la
infiltración de células mononucleares inflamatorias conduce al
desarrollo de granulomas; un nicho habitable paraMtb [69].
Además, la bronconeumonía aguda y los granulomas
necrotizantes se han correlacionado con la patología de la
tuberculosis pulmonar [70]. Sorprendentemente, observamos una
disminución en laMtb carga y patología de la enfermedad de los
pulmones del grupo al que se administró C6 y aumentó la
potencia de BCG (Fig. 6). C6 impidió la difusión deMtb, como se
muestra por una disminución de la carga bacteriana en el bazo. La
carga bacteriana reducida en el grupo vacunado indica la eficacia
protectora de C6 con BCG.
La vacuna C6 junto con BCG ha mejorado la protección
contra Mtb en el modelo de TB de ratones. Su eficacia
protectora se ha logrado mediante la generación de células T
de memoria contra Mtb. Estas células T pueden activar DC y
macrófagos con la ayuda de IFN- y TNF-. Además, las CD y los
macrófagos en animales inmunizados no se vieron afectados
por la capacidad supresora deMtby podría producir IL-6 e
IL-12 para activar aún más las células T. Todos estos juntos
declinaron elMtb carga en el grupo de animales vacunados en
comparación con los controles.
Página 10 de 14
Conclusión
La tuberculosis se ha clasificado como una de las enfermedades más
mortales del mundo. Las engorrosas estrategias terapéuticas, las cepas
resistentes a los fármacos y los fallos de la vacuna BCG común
aumentan la necesidad de desarrollar una vacuna eficaz. Las vacunas
de subunidades han proporcionado un beneficio sobre las vacunas
basadas en células completas [8, 9, 71]. En general, nuestros estudios
indican que una vacuna de ADN basada en epítopos de células T
múltiples mejora sustancialmente la inmunidad y protección de BCG
contraMtb. Estos resultados afirman la viabilidad potencial de C6 como
vacuna candidata en el esfuerzo por controlar la TB.
Métodos
Ratones
Se obtuvieron ratones hembra BALB / cy C57BL / 6 (6-8
semanas, 16-18 g) de Animal House Facility, CSIR-Institute of
Microbial Technology, Chandigarh (IMTE CH) y se mantuvieron
en el laboratorio de nivel 3 de bioseguridad en CSIR- Instituto
de Tecnología Microbiana, Chandigarh (IMTE CH) para
procedimientos experimentales.
Bacterias y líneas celulares
los Escherichia coli (E. coli) La cepa DH5α se cultivó en medio
LB y se usó en este estudio para la clonación y purificación de
plásmidos. Cepa danesa BCG (Serum Institute of India PVT.
LTD., India) utilizada para la inmunización.MtbLa cepa H37Rv
se cultivó en 7H9 + OADC al 10% y se conservó como reserva
de glicerol al 10% a -80ºC para su uso para la infección,
respectivamente. Se utilizó la línea celular CHO para los
estudios de transfección.
Reactivos
Todos los reactivos y cebadores se compraron de Sigma
(St. Louis, MO) y los anticuerpos de eBiosciences (San
Diego, CA), las enzimas de restricción y ligasa fueron de
New England Biolabs (Ipswich, MA), además, a menos que
se mencione lo contrario. Los medios bacterianos se
adquirieron en Himedia (Mumbai, India).
Selección, clonación y expresión de epítopos de células T
La selección del epítopo de células T promiscuas se basó en la
unión a múltiples alelos HLA. Seleccionamos 6 células T CD4
promiscuas y péptidos epítopos de células T CD8 de la
bibliografía. Las secuencias de péptidos se organizaron por
duplicado y se unieron con una secuencia de aminoácidos
sensible a proteasa (AVYAFVH). Una señal secretora de la
hormona del crecimiento humano (HGH) N-terminal se vinculó
para la secreción de la proteína de las células huésped. Se
sintetizó el gen de la quimera (C6) para la proteína (GenScript,
Piscataway, NJ). Para usar el gen C6 como vacuna, se debe
usar un vector adecuado para la expresión. En consecuencia,
para utilizarlo como vacuna de ADN, se utilizó el vector
pcDNA3.1-. El gen sintetizado se clonó en el vector pcDNA3.1-
en el sitio de BamHI y
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HindIII y transformado en E. coli DH5α para la
multiplicación y purificación del plásmido. La presencia del
gen C6 en el plásmido se confirmó mediante PCR de
colonias y electroforesis en gel de agarosa.
Posteriormente, se clonó C6 en el vector pEYFP-N1 en el
sitio del sitio NheI y HindIII para generar una proteína
etiquetada con YFP para la confirmación de la expresión
del gen en las células huésped. pEYFP-C6 se transformó en
E. coliy las colonias resistentes a kanamicina se
seleccionaron mediante PCR de colonias y electroforesis
en gel de agarosa. Para confirmar aún más la expresión de
C6 en el vector pcDNA3.1-, el gen C6YFP se amplificó y
clonó en el sitio NheI y NotI de pcDNA3.1- y se transformó
enE. coli y las colonias positivas se seleccionaron mediante
PCR y electroforesis en gel de agarosa. Todos los
plásmidos para el uso de inmunización y transfecciones se
aislaron mediante el método Triton X-114 [72].
La línea celular CHO se transfectó con plásmidos usando
lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se siguió el
protocolo estándar del fabricante para la transfección. Las
células transfectadas se utilizaron para observación directa
bajo un microscopio fluorescente, transferencia de
Western y análisis FACS.
Western blot
El lisado de células CHO transfectadas se preparó mediante
recolección, lavado y lisis en tampón de lisis (tampón RIPA,
cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa). Los sobrenadantes
de cultivo (SN) se precipitaron mediante precipitación con
acetona. Brevemente, se añadió cinco veces un volumen de
acetona fría al 80% al SN y se incubó durante la noche a
- 20 ° C. Posteriormente, se sedimentó SN a 10000 g durante 15
min a 4 ° C. Los gránulos se lavaron dos veces con acetona
enfriada al 80% y se secaron al aire durante 45 min a TA. Los
sedimentos se disolvieron en PBS. Se estimaron las SN del lisado
celular y las SN de cultivo y se sometió a una concentración igual a
SDS-PAGE. Después de transferirlas a una membrana de
nitrocelulosa y bloquearlas, se inmunotransfirieron las
membranas con Abs contra YFP. Las transferencias se
desarrollaron usando un kit de quimioluminiscencia (Thermo
Scientific, Waltham, MA). La quimioluminiscencia fue detectada
por Image-Quant LAS 4000 (GE life sciences, Reino Unido).
Inmunización animal
Para estudiar la expresión in vivo de C6, se vacunaron ratones
C57BL / 6 con 100 µg de C6YFP, y se aislaron los LN inguinales y las
extremidades traseras 3d más tarde para comprobar las células
que expresan YFP. Para los estudios inmunológicos, se
inmunizaron ratones BALB / c por vía subcutánea (sc) en la base de
la cola con BCG (106 CFU / animal) junto con intramuscularmente
(im) en la extremidad trasera con 100 μg / animal de C6 y
controles (pcDNA3.1-, C6, BCG y negativo) en PBS como 3 ratones
en un grupo. Dos dosis de refuerzo de ADN
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la vacuna se administró en el intervalo de 2 semanas. Más tarde, los ratones fueron
sacrificados para el análisis de órganos.
Infección por aerosoles y carga bacteriana en los pulmones y el
bazo.
Los ratones inmunizados se dejaron en reposo durante 30 días y
se expusieron a aerosol con 100 UFC de Mtb por Inhalation
Exposure System (GlasCol, LLC, Terre Haute, IN). Treinta días
después de la infección, se sacrificaron los animales y se
determinó la carga bacteriana en los pulmones y el bazo mediante
la inoculación de homogeneizados de tejido en placas 7H11. Las
secciones de pulmones y bazo también se conservaron en
formalina al 1% en PBS para el análisis histopatológico mediante
tinción con hematoxilina y eosina.
Cultivo de linfocitos de bazo y pulmón
El bazo, los ganglios linfáticos (LN) y las células pulmonares se
prepararon triturando los tejidos seguido de lisis de glóbulos
rojos. Linfocitos (2 × 105/ pocillo) aislados de bazos / LN o
pulmones se cultivaron en placas de fondo en U de 96 pocillos y se
estimularon con PPD (25 μg / ml) y 5 péptidos C6 (5 μg / ml cada
uno) como Rv0476(1–19) fue incapaz de sintetizar. Para los estudios
de estado de activación de DC y macrófagos, las células se
estimularon con LPS (1 μg / ml) durante 24 h.
Citometría de flujo
Para el análisis fenotípico de las células T, el PPD y los
péptidos estimulados por los pulmones y las células del bazo /
LN se analizaron mediante citometría de flujo. Se recolectaron
cultivos de linfocitos y se tiñeron con anti-CD4-PE, CD8-
APCCy7, CD62L-FITC, CD44-PerCPCy5.5, CD11c-
PECy7, F4 / 80-APC, CD86-PE, CD80-FITC, CD40-PECy5 y MHC-
II-PerCPCy5.5abs (BD Biosciences, San José, CA). Brevemente,
los linfocitos se recolectaron en tubos y se lavaron con
tampón FACS (PBS + FCS al 2%). Las células se bloquearon con
Fc usando Ab anti-CD16 / CD32 de ratón. Posteriormente,
teñido con Abs marcado con fluorocromo. Después de la
tinción, las células se fijaron utilizando paraformaldehído al
1% en tampón FACS. Las células se adquirieron en BD-FACS
Aria III y BD-FACS Accuri (BD, Franklin Lakes, NJ). El análisis se
realizó utilizando el software BD-FACS DIVA, BD-C6 y Flowjo
(BD, Franklin Lakes, NJ).
ELISA de citoquinas
La expresión de diferentes citocinas en los sobrenadantes de cultivo de
PPD y cultivos de linfocitos estimulados por péptidos se controló
mediante ELISA sándwich. Brevemente, se revistieron anticuerpos
primarios anti-citocina en placas de 96 pocillos a 4 ° C durante la noche.
A continuación, se bloquearon los pocillos con solución de BSA al 2%
durante 2 hy se incubaron durante la noche a 4 ° C con los
sobrenadantes del cultivo. Posteriormente, las placas se incubaron 2 h
con anticuerpos secundarios biotinilados y 45 min con conjugados
estreptavidina-HRP. OPD-H2O2 los sustratos fueron
Maurya et al. Enfermedades Infecciosas de BMC (2020) 20: 677 Página 12 de 14

se utiliza para determinar la concentración de citocinas junto con las células positivas son de dos experimentos independientes. *pag ≤ 0.05, **pag ≤ 0,005,
los estándares obteniendo una lectura a 595 nm. * * *pag ≤ 0,0005, ****pag ≤ 0,0001.

Herramientas bioinformáticas Abreviatura

Para el análisis bioinformático Calculadora de ligadura (http: //
www.insilico.uni-duesseldorf.de/Lig_Input.html), PROS-PER (
https://prosper.erc.monash.edu.au/), Servidor SignalP 4.1 (
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) y PlasMapper (http://
wishart.biology.ualberta.ca/PlasMapper/) se utilizaron
herramientas.
Estadísticas
Todo el análisis estadístico se realizó como ANOVA de una
C6: pcDNA3.1- con múltiples epítopos de células T de Mtb
Expresiones de gratitud
Agradecemos al Dr. BN Dutta por el análisis histopatológico de los tejidos.
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Contribuciones de los autores
JNA y SKM diseñaron el estudio y redactaron el manuscrito. SKM, MA, DKD, GK, SN
y SS realizaron los experimentos. Todos los autores leyeron y aprobaron el
manuscrito final.

vía con la prueba de Tukey en Graph Pad Prism (Graph-Pad

Fondos
Software, La Jolla, CA). El diseño del estudio, la recopilación de datos y el análisis se llevaron a cabo con el
apoyo financiero del Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR), India.
SKM y GK recibieron becas de CSIR, DKD y SN de DBT, MA de DST y SS de ICMR,
Información suplementaria Nueva Delhi.
Información suplementaria acompaña este documento en https://doi.org/10.
1186 / s12879-020-05372-1.
Disponibilidad de datos y materiales
Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo
Archivo adicional 1: Figura complementaria 1. Construcción del gen C6. (a) (y sus archivos de información complementaria). Todos los conjuntos de datos utilizados
Todas las secuencias de péptidos fueron analizadas por el software PROSPER y analizados están disponibles a solicitud razonable del autor correspondiente.
para comprobar su sensibilidad a las proteasas. Los diferentes colores indican
diferentes proteasas. "Color rojo" designa la secuencia de Rv0476, que resultó Aprobación ética y consentimiento para participar
ser la más sensible a la degradación por proteasa. (b) Se muestra la secuencia Los usos de animales fueron permitidos por los Comités Institucionales de Ética Animal
génica completa de C6 (963 pb) que se utilizó para la síntesis de la vacuna de (IAEC) de IMTECH, Chandigarh. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las
ADN.Figura complementaria 2. C6 se clonó con éxito en el plásmido. (a) El gen Directrices reglamentarias nacionales emitidas por el Comité para el propósito de control
C6 se clonó en pcDNA3.1- y se transformó en E. coli. La electroforesis en gel de y supervisión de experimentos con animales (No. 55/1999 / CPCSEA), Ministerio de Medio
agarosa confirma la presencia del gen C6 con el tamaño adicional del sitio de Ambiente y Bosques, Gob. de la India.
restricción y los pares de bases extra utilizados para la digestión de restricción.
C6: control positivo, carril 1-8: diferente
E. coli clones. El mapa de vector de pcDNA3.1-C6 con el sitio se utilizó para la Consentimiento para la publicación
clonación. (b) El gen C6 se clonó en un plásmido pEYFP-N1 y se transformó enE. coli. La Todos los autores dan su consentimiento para la publicación de este artículo.
electroforesis en gel de agarosa confirma positivo E. coli colonias con el gen C6. El
carril 1-10 indica las diferentesE. colicolonias y C indica el control positivo del gen C6. El
Conflicto de intereses
mapa vectorial de pEYFP-C6 se utilizó para la clonación y como marco de lectura
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
abierto. (c) El gen C6YFP se clonó en el plásmido pcDNA3.1- y se transformó enE. coli.
La electroforesis en gel de agarosa confirma positivo E. coli colonias con el gen C6. Los
Recibido: 28 de enero de 2020 Aceptado: 25 de agosto de 2020
carriles 1 a 6 indican las diferentesE. coli colonias. Se utilizó el vector pEYFP-C6 como
control positivo. El mapa de vector de pcDNA3.1-C6YFP con el sitio se utilizó para la
clonación y como marco de lectura abierto.Figura complementaria 3. Expresión de C6-
Referencias
YFP en células CHO. (a) Las células CHO transfectadas con C6-YFP se analizaron
1. Cardona PJ. Lo que hemos aprendido y lo que hemos pasado por alto en la
mediante citometría de flujo para determinar su intensidad de fluorescencia (YFP) y se
fisiopatología de la tuberculosis para un nuevo diseño de vacuna: la búsqueda
representaron como gráficos de histograma. Los datos en el recuadro representan la
del “cisne rosa”. Front Immunol. 2017; 8: 556.
intensidad de fluorescencia media (MFI). (b) El diagrama de barras representa la
2. Schaible UE, Linnemann L, Redinger N, Patin EC, Dallenga T. Estrategias para mejorar la
intensidad de fluorescencia media integrada (iMFI) de las células transfectadas;
eficacia de la vacuna contra la tuberculosis dirigiéndose a la inmunidad innata.
además, confirme la presencia de C6. Los datos expresados como media ± SEM son
Front Immunol. 2017; 8: 1755.
representativos de 2 experimentos independientes. *pag ≤ 0,05. Figura
3. Kaufmann SH. Futuras estrategias de vacunación contra la tuberculosis: ideas
complementaria 4. La inmunización conjunta de BCG con C6 aumenta la respuesta de
innovadoras. Inmunidad. 2010; 33 (4): 567–77.
las células T de memoria. Se aislaron linfocitos de los pulmones de los animales de
4. Russell DG, Barry CE 3º, Flynn JL. Tuberculosis: lo que no sabemos puede hacernos
control y de los animales inyectados con BCG + C6. Los linfocitos se estimularon in
daño, y lo hace. Ciencias. 2010; 328 (5980): 852–6.
vitro con PPD y péptidos. (a, c) Las gráficas de contorno muestran el porcentaje de
5. Pym AS, Brodin P, Brosch R, Huerre M, Cole ST. La pérdida de RD1 contribuyó a la
población de CD62LHolaCD44Hola células T CD4 de memoria central y células T CD8,
atenuación de las vacunas antituberculosas vivasMycobacterium bovis BCG y
estimuladas con (a) PPD y (c) péptidos y representadas como (b, d) diagramas de
Mycobacterium microti. Mol Microbiol. 2002; 46 (3): 709–17.
barras. Los datos proceden de dos experimentos independientes y se representan
6. Chatterjee S, Dwivedi VP, Singh Y, Siddiqui I, Sharma P, Van Kaer L, Chattopadhyay D, Das G.
como media ± SEM.Figura complementaria 5. El refuerzo de cebado con BCG y C6
Antígeno de secreción temprana ESAT-6 de Tuberculosis micobacteriana promueve las
mejora la activación de DC y macrófagos. Se aislaron linfocitos del bazo y LN de los
respuestas protectoras de las células T auxiliares 17 de una manera dependiente del
animales inmunizados con BCG + C6 y de control. Las células se estimularon in vitro
receptor 2 de tipo toll. PLoS Pathog. 2011; 7 (11): e1002378.
con LPS (1 μg / ml) durante 24 h. (a) Estrategia de activación utilizada para países en
7. Kaufmann SH, Weiner J, von Reyn CF. Enfoques novedosos para el desarrollo de vacunas
desarrollo y células de macrófagos. (b, c) el histograma y su respectivo diagrama de
contra la tuberculosis. Int J Infect Dis. 2017; 56: 263–7.
barras (d, e) significan el porcentaje de población de CD86Hola, CD40Hola, MHC-IIHolay
8. Gowthaman U, Singh V, Zeng W, Jain S, Siddiqui KF, Chodisetti SB, Gurram RK, Parihar P,
CD80Hola que expresan (b) DC y (c) macrófagos. Datos (medias ± SEM) representados
Gupta P, Gupta UD, et al. El péptido promiscuo de antígeno de 16 kDa unido a
como porcentaje
Pam2Cys protege contraTuberculosis micobacteriana evocando una respuesta
duradera de las células T de memoria. J Infect Dis. 2011; 204 (9): 1328–38.
Maurya et al. Enfermedades Infecciosas de BMC (2020) 20: 677
9. Rai PK, Chodisetti SB, Maurya SK, Nadeem S, Zeng W, Janmeja AK, Jackson DC,
Agrewala JN. Una vacuna biepítopo lipidada que comprende péptidos aglutinantes
de MHC-I y MHC-II provoca inmunidad de células T CD4 protectoras y células T
CD8 contraTuberculosis micobacteriana. J Transl Med. 2018; 16 (1): 279.
10. Kutzler MA, Weiner DB. Vacunas de ADN: ¿listas para el horario de máxima audiencia? Nat Rev Genet.
2008; 9 (10): 776–88.
11. Agrewala JN, Wilkinson RJ. Regulación diferencial de las células Th1 y Th2 por los
péptidos p91-110 y p21-40 del antígeno alfa-cristalino de 16 kD deTuberculosis
micobacteriana. Clin Exp Immunol. 1998; 114 (3): 392–7.
12. Axelsson-Robertson R, Weichold F, Sizemore D, Wulf M, Skeiky YA, Sadoff J, Maeurer
MJ. Amplio complejo mayor de histocompatibilidad clase I promiscuidad vinculante
paraTuberculosis micobacteriana Péptidos TB10.4 y dominancia inmune del
antígeno leucocitario humano (HLA) -B * 0702 y alelos HLA-B * 0801 en respuestas
de células T TB10.4 CD8. Inmunología. 2010; 129 (4): 496–505.
13. Kovjazin R, Volovitz I, Daon Y, Vider-Shalit T, Azran R, Tsaban L, Carmon L, Louzoun Y.
Los péptidos señal y las regiones transmembrana son ampliamente inmunogénicas
y tienen una alta densidad de epítopos de células T CD8 +: implicaciones para la
vacuna desarrollo. Mol Immunol. 2011; 48 (8): 1009–18.
14. Shams H, Klucar P, Weis SE, Lalvani A, Moonan PK, Safi H, Wizel B, Ewer K, Nepom GT,
Lewinsohn DM y col. Caracterización de unTuberculosis micobacteriana péptido que
es reconocido por células T humanas CD4 + y CD8 + en el contexto de múltiples
alelos HLA. J Immunol. 2004; 173 (3): 1966–77.
15. Song J, Tan H, Perry AJ, Akutsu T, Webb GI, Whisstock JC, Pike RN. PROSPER: una herramienta
integrada basada en características para predecir los sitios de escisión del sustrato de
proteasa. Más uno. 2012; 7 (11): e50300.
16. Hall J, Hazlewood GP, Surani MA, Hirst BH, Gilbert HJ. Los péptidos señal eucarióticos y
procarióticos dirigen la secreción de una endoglucanasa bacteriana por células de
mamíferos. J Biol Chem. 1990; 265 (32): 19996–9.
17. Nielsen H. Predicción de proteínas secretoras con SignalP. Métodos Mol Biol.
1611; 2017: 59–73.
18. Lyadova IV, Panteleev AV. Células Th1 y Th17 en tuberculosis: protección,
patología y biomarcadores. Mediat Inflamm. 2015; 2015: 854507.
19. Lewinsohn DA, Gold MC, Lewinsohn DM. Vistas de la inmunología: células T
efectoras. Immunol Rev.2011; 240 (1): 25–39.
20. Mihret A. El papel de las células dendríticas en Tuberculosis micobacteriana infección.
Virulencia. 2012; 3 (7): 654–9.
21. Guirado E, Schlesinger LS, Kaplan G. Macrófagos en la tuberculosis: amigo o
enemigo. Semin Immunopathol. 2013; 35 (5): 563–83.
22. Amir M, Aqdas M, Nadeem S, Siddiqui KF, Khan N, Sheikh JA, Agrewala JN. Papel diamétrico de
la proteína Acr1 asociada a la latencia deTuberculosis micobacteriana en la modulación de
la funcionalidad de las etapas previas y posteriores a la maduración de las células
dendríticas. Front Immunol. 2017; 8: 624.
23. Martinez FO, Gordon S. El paradigma M1 y M2 de la activación de
macrófagos: tiempo de reevaluación. F1000prime Rep.2014; 6:13.
24. Jin P, Han TH, Ren J, Saunders S, Wang E, Marincola FM, Stroncek DF. Firmas moleculares de
células dendríticas en maduración: implicaciones para probar la calidad de las terapias con
células dendríticas. J Transl Med. 2010; 8: 4.
25. Pan J, Zhang M, Wang J, Wang Q, Xia D, Sun W, Zhang L, Yu H, Liu Y, Cao
X. El interferón-gamma es un mediador autocrino para la maduración de las células
dendríticas. Immunol Lett. 2004; 94 (1–2): 141–51.
26. Vremec D, O'Keeffe M, Hochrein H, Fuchsberger M, Caminschi I, Lahoud M, Shortman K. Producción de
interferones por células dendríticas, células plasmocitoides, células asesinas naturales y células
dendríticas asesinas productoras de interferón. Sangre. 2007; 109 (3): 1165–73.
27. Young SL, Slobbe L, Wilson R, Buddle BM, de Lisle GW, Buchan GS. Cepas
ambientales deMycobacterium avium interferir con las respuestas inmunes
asociadas con Mycobacterium bovis Vacunación BCG. Infect Immun. 2007; 75
(6): 2833–40.
28. Sakhno LV, Shevela EY, Tikhonova MA, Nikonov SD, Ostanin AA, Chernykh ER.
Deficiencias de las células presentadoras de antígenos en la tuberculosis
pulmonar. J Immunol Res. 2015; 2015: 793292.
29. Lang R, Schick J. Revisión: impacto de la infección por helmintos en la inmunidad
antimicobacteriana: un enfoque en los macrófagos. Front Immunol. 2017; 8: 1864.
30. Luca S, Mihaescu T. Historia de la vacuna BCG. Maedica. 2013; 8 (1): 53–8.
31. Dey B, Jain R, Khera A, Gupta UD, Katoch VM, Ramanathan VD, Tyagi AK. La vacunación
basada en el antígeno de latencia alfa-cristalina imparte una sólida protección
contra la TB al modular la dinámica de las citocinas pulmonares. Más uno. 2011; 6
(4): e18773.
32. Yuan Y, Crane DD, Simpson RM, Zhu YQ, Hickey MJ, Sherman DR, Barry CE 3rd. La
proteína alfa-cristalina (Acr) de 16 kDa deTuberculosis micobacterianaes necesario
para el crecimiento en macrófagos. Proc Natl Acad Sci US A. 1998; 95 (16): 9578–83.
Página 13 de 14
33. Bashir N, Kounsar F, Mukhopadhyay S, Hasnain SE. Tuberculosis micobacteriana La
proteína hipotética conservada rRv2626c modula las funciones efectoras de los
macrófagos. Inmunología. 2010; 130 (1): 34–45.
34. Danelishvili L, Everman J, Bermudez LE. Tuberculosis micobacteriana Los genes PPE68 y
Rv2626c contribuyen a la necrosis de la célula huésped y al escape bacteriano de los
macrófagos. Virulencia. 2016; 7 (1): 23–32.
35. Feng G, Jiang Q, Xia M, Lu Y, Qiu W, Zhao D, Lu L, Peng G, Wang Y. Respuesta inmune
mejorada y efectos protectores de la vacuna de ADN basada en nanoquitosano que
codifica los epítopos de células T de Esat- 6 y FL en contraTuberculosis
micobacteriana infección. Más uno. 2013; 8 (4): e61135.
36. Danko JR, Kochel T, Teneza-Mora N, Luke TC, Raviprakash K, Sun P, Simmons M, Moon JE, De La
Barrera R, Martinez LJ, et al. Seguridad e inmunogenicidad de una vacuna tetravalente de
ADN contra el dengue administrada con un adyuvante catiónico a base de lípidos en un
ensayo clínico de fase 1. Am J Trop Med Hyg. 2018; 98 (3): 849–56.
37. Kumaragurubaran K, Kaliaperumal K. Vacuna de ADN: el milagro en miniatura. Vet
World. 2013; 6 (4): 228–32.
38. Li SS, Kochar NK, Elizaga M, Hay CM, Wilson GJ, Cohen KW, De Rosa SC, Xu
R, Ota-Setlik A, Morris D, et al. El cebado del ADN aumenta la frecuencia de las respuestas de las
células T a una vacuna contra el VIH con el virus de la estomatitis vesicular con un aumento
específico de las respuestas de las células T CD8 (+) mediante el ADN del plásmido de
interleucina-12. Clin Vaccine Immunol. 2017; 24 (11): e00263-17.
39. Li X, Pushko P, Tretyakova I. Hemaglutinina recombinante y vacunas de partículas similares a
virus para el virus de la influenza H7N9. J Vacunas Vacunación. 2015; 6 (3).
40. Las vacunas de ADN de Morrison C. contra el virus del Zika se aceleran en los ensayos clínicos. Nat
Rev Drug Discov. 2016; 15 (8): 521–2.
41. Delogu G, Howard A, Collins FM, Morris SL. Vacunación con ADN contra la tuberculosis: la
expresión de una proteína de la tuberculosis conjugada con ubiquitina mejora la
inmunidad antimicobacteriana. Infect Immun. 2000; 68 (6): 3097–102.
42. Huygen K, Content J, Denis O, Montgomery DL, Yawman AM, Deck RR, DeWitt CM,
Orme IM, Baldwin S, D'Souza C, et al. Inmunogenicidad y eficacia protectora de una
vacuna de ADN contra la tuberculosis. Nat Med. 1996; 2 (8): 893–8.
43. Oksanen KE, Myllymaki H, Ahava MJ, Makinen L, Parikka M, Ramet M. La vacunación
con ADN aumenta la protección de Bacillus Calmette-Guerin contra
Infección por micobacterias en el pez cebra. Dev Comp Immunol. 2016; 54 (1): 89–96.
44. Skeiky YA, Alderson MR, Ovendale PJ, Guderian JA, Brandt L, Dillon DC, Campos-Neto A,
Lobet Y, Dalemans W, Orme IM, et al. Respuestas inmunes diferenciales y eficacia
protectora inducidas por componentes de una vacuna de poliproteína de
tuberculosis, Mtb72F, administrada como ADN desnudo o proteína recombinante. J
Immunol. 2004; 172 (12): 7618–28.
45. Wang Q, Lei C, Wan H, Liu Q. Mejora de la respuesta inmune celular provocada por una
vacuna de ADN fusionado con ubiquitina contra Tuberculosis micobacteriana. DNA Cell
Biol. 2012; 31 (4): 489–95.
46. Wozniak TM, Ryan AA, Triccas JA, Britton WJ. El plásmido interleucina-23 (IL-23), pero
no el plásmido IL-27, mejora la eficacia protectora de una vacuna de ADN contra
Tuberculosis micobacteriana infección. Infect Immun. 2006; 74 (1): 557–65.
47. Zhou J, Cheung AK, Tan Z, Wang H, Yu W, Du Y, Kang Y, Lu X, Liu L, Yuen KY, et al. La vacuna de
ADN basada en PD1 amplifica las células T CD8 + específicas de GAG del VIH-1 en ratones. J
Clin Invest. 2013; 123 (6): 2629–42.
48. MacLeod MK, Kappler JW, Marrack P. Células T CD4 de memoria: generación,
reactivación y reasignación. Inmunología. 2010; 130 (1): 10–5.
49. Cooper AM. Respuestas inmunitarias mediadas por células en la tuberculosis. Annu Rev
Immunol. 2009; 27: 393–422.
50. Lindenstrom T, Knudsen NP, Agger EM, Andersen P. Control de crónicas
Tuberculosis micobacteriana Infección por células de memoria central secretoras
de CD4 KLRG1-IL-2. J Immunol. 2013; 190 (12): 6311–9.
51. Kipnis A, Irwin S, Izzo AA, Basaraba RJ, Orme IM. Linfocitos T de memoria generados por
Mycobacterium bovis La vacuna BCG reside dentro de una población de ligando CD4
CD44lo CD62 (hi). Infect Immun. 2005; 73 (11): 7759–64.
52. Hengel RL, Thaker V, Pavlick MV, Metcalf JA, Dennis G Jr, Yang J, Lempicki RA, Sereti I, Lane HC.
Vanguardia: la expresión de L-selectina (CD62L) distingue las pequeñas células T CD4 + de
memoria en reposo que responden preferentemente al antígeno de memoria. J Immunol.
2003; 170 (1): 28–32.
53. Cha SB, Kim WS, Kim JS, Kim H, Kwon KW, Han SJ, Eum SY, Cho SN, Shin SJ. Impulso
repetido en aerosol con radiación irradiada con rayos gamma.Mycobacterium bovis
BCG confiere una protección pulmonar mejorada contra el hipervirulento
Tuberculosis micobacteriana cepa HN878 en ratones. Más uno. 2015; 10 (10):
e0141577.
54. Henao-Tamayo MI, Ordway DJ, Irwin SM, Shang S, Shanley C, Orme IM. Definición
fenotípica de subconjuntos de linfocitos T efectores y de memoria en ratones
infectados crónicamente conTuberculosis micobacteriana. Clin Vaccine
Immunol. 2010; 17 (4): 618–25.
Maurya et al. Enfermedades Infecciosas de BMC (2020) 20: 677 Página 14 de 14

55. McKinstry KK, Strutt TM, Swain SL. El efector a la transición de memoria de las células T
CD4. Immunol Res. 2008; 40 (2): 114–27.
56. Sharpe S, White A, Sarfas C, Sibley L, Gleeson F, McIntyre A, Basaraba R, Clark S, Hall G,
Rayner E, et al. Las estrategias alternativas de administración de BCG mejoran la
protección contraTuberculosis micobacteriana en primates no humanos: protección
asociada con poblaciones de células T de memoria efectora CD4 específicas de antígeno
micobacteriano. Tuberculosis. 2016; 101: 174–90.
57. Cooper AM, Dalton DK, Stewart TA, Griffin JP, Russell DG, Orme IM. Tuberculosis
diseminada en ratones con alteración del gen del interferón gamma. J Exp Med.
1993; 178 (6): 2243–7.
58. Flynn JL, Chan J, Triebold KJ, Dalton DK, Stewart TA, Bloom BR. Un papel esencial del
interferón gamma en la resistencia aTuberculosis micobacterianainfección. J Exp
Med. 1993; 178 (6): 2249–54.
59. Flynn JL, Goldstein MM, Chan J, Triebold KJ, Pfeffer K, Lowenstein CJ, Schreiber R, Mak
TW, Bloom BR. El factor de necrosis tumoral alfa es necesario en la respuesta
inmunitaria protectora contraTuberculosis micobacteriana en ratones. Inmunidad.
1995; 2 (6): 561–72.
60. Fiorentino DF, Bond MW, Mosmann TR. Dos tipos de células auxiliares T de ratón.
IV. Los clones Th2 secretan un factor que inhibe la producción de citocinas por los
clones Th1. J Exp Med. 1989; 170 (6): 2081–95.
61. Moore KW, de Waal MR, Coffman RL, O'Garra A. La interleucina-10 y el receptor
de interleucina-10. Annu Rev Immunol. 2001; 19: 683–765.
62. Madura Larsen J, Benn CS, Fillie Y, van der Kleij D, Aaby P, Yazdanbakhsh M. Las células
dendríticas estimuladas con BCG inducen una población de células T productoras de
interleucina-10 sin sesgo de T helper 1 o T helper 2 in vitro. Inmunología. 2007; 121 (2): 276–
82.
63. van Haarst JM, Hoogsteden HC, de Wit HJ, Verhoeven GT, Havenith CE, Drexhage HA.
Células dendríticas y sus precursores aislados del lavado broncoalveolar humano:
propiedades inmunocitológicas y funcionales. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994; 11
(3): 344–50.
64. Giacomini E, Iona E, Ferroni L, Miettinen M, Fattorini L, Orefici G, Julkunen I, Coccia
EM. Infección de macrófagos humanos y células dendríticas conTuberculosis
micobacteriana induce una expresión génica diferencial de citocinas que modula la
respuesta de las células T. J Immunol. 2001; 166 (12): 7033–41.
65. Kumagai Y, Takeuchi O, Akira S. TLR9 como receptor clave para el reconocimiento de
ADN. Adv Drug Deliv Rev. 2008; 60 (7): 795–804.
66. Vandenborre K, Van Gool SW, Kasran A, Ceuppens JL, Boogaerts MA, Vandenberghe P.
La interacción de CTLA-4 (CD152) con CD80 o CD86 inhibe la activación de células T
humanas. Inmunología. 1999; 98 (3): 413–21.
67. Lu L, Bonham CA, Chambers FG, Watkins SC, Hoffman RA, Simmons RL, Thomson AW.
Inducción de óxido nítrico sintasa en células dendríticas de ratón por IFN-gamma,
endotoxina e interacción con células T alogénicas: la producción de óxido nítrico
está asociada con la apoptosis de células dendríticas. J Immunol. 1996; 157 (8):
3577–86.
68. Redford PS, Murray PJ, O'Garra A. El papel de IL-10 en la regulación inmune
durante M. tuberculosis infección. Immunol de las mucosas. 2011; 4 (3): 261–70.
69. Ehlers S, Schaible UE. El granuloma en la tuberculosis: dinámica de una colusión
huésped-patógeno. Front Immunol. 2012; 3: 411.
70. Gupta M, Lobo FD, Adiga DS, Gupta A. Un análisis del patrón histomorfológico de
tuberculosis pulmonar en autopsias pulmonares y muestras resecadas
quirúrgicamente. Pathol Res Int. 2016; 2016: 8132741.
71. Rai PK, Chodisetti SB, Zeng W, Nadeem S, Maurya SK, Pahari S, Janmeja AK, Jackson
DC, Agrewala JN. Un péptido lipidado deTuberculosis micobacterianaresucita la
eficacia protectora de la vacuna BCG al evocar la inmunidad de las células T de
memoria. J Transl Med. 2017; 15 (1): 201.
72. Ma R, Zhao J, Du HC, Tian S, Li LW. Eliminación de endotoxina de muestras de plásmido
mediante extracción isotérmica con tritón X-114. Anal Biochem. 2012; 424 (2): 124–6.

Nota del editor

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