PRÁCTICA No 5

DETERMINACION DE LA VELOCIDAD DE FERMENTACION DE VARIOS

CARBOHIDRATOS

1. OBJETIVOS.
 Conceptualizar sobre los procesos de fermentación que ocurre en los organismos.
 Determinar la velocidad de fermentación de la levadura S. cereviciae con varios
carbohidratos.
 Realizar cálculos estequiométricos a partir del metabolismo fermentativo.

2. FUNDAMENTOS TEORICOS.

LA VIA GLUCOLITICA.

La vía glucolítica o simplemente glucólisis se puede definir como la ruptura

anaeróbica de la molécula de glucosa en piruvato, acompañada de una pequeña
producción de energía en forma de ATP y NADH. Es el proceso más importante del
metabolismo de los carbohidratos, y constituye la ruta universal que usan los
organismos (aerobios y anaerobios) para extraer la energía de aquellos. La ruta
comprende 10 compuestos intermedios y 10 reacciones químicas, cada una con una
enzima diferente, localizadas en el citoplasma celular. La reacción neta del proceso es
la siguiente:

H O
C
OH COO-
HO
+ 2ADP + 2Pi + 2NAD+ 2 C O + 2ATP + 2NADH + 2H+ + 2H2O
OH
OH CH3
CH2OH

GLUCOSA PIRUVATO
Desde el punto de vista energético, la vía glucolítica comprende dos etapas:

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a. Etapa de preparación, inversión o activación de la glucosa, en la cual se consume
la energía de 2 ATP para fraccionar a la glucosa en dos unidades de gliceraldehído –3 –
fosfato (una triosa), que es un metabolito activado (fosforilado). Esta etapa comprende
5 reacciones sumariadas así:

H O
C
OH O H
C
HO
+ 2ATP 2 OH + 2ADP
OH
OH CH2OP
CH2OH

GLUCOSA GLICERALDEHIDO-3-FOSFATO

b. Etapa productora de energía, en la cual el gliceraldehído–3 –fosfato se oxida hasta

piruvato, liberando energía suficiente para recuperar el ATP invertido en la primera
fase. Comprende otras 5 reacciones globalizadas así:

O H O O-
C C
2 OH + 4ADP + 2Pi + 2NAD +
2 C O + 4ATP + 2NADH + 2H+ + 2H2O
CH2OP
CH3

GLICERALDEHIDO-3-P PIRUVATO

DESTINO DEL PIRUVATO

El producto orgánico final de la glucólisis es el piruvato, que debido a su alta
reactividad, y dependiendo del organismo (animal, planta, microbios) y de sus
condiciones de crecimiento (aerobio o anaerobio), puede seguir participando en
diversos procesos:
a. La aminación, promovida por una enzima aminotransferasa, lo convierte en el
aminoácido alanina, precursor de proteínas en todos los organismos:

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 COO- COO-
+
C O + Glutamato H3N CH + - Cetoglutarato

CH3 CH3

PIRUVATO ALANINA
b. La carboxilación mediada por ATP y por la enzima piruvato carboxilasa, convierte
al piruvato en oxaloacetato, cuando se requiere resintetizar glucosa en el proceso
llamado gluconeogénesis en los animales:

COO-
-
COO
C O
C O + CO2
CH2
CH3
ATP ADP+Pi COO-

PIRUVATO OXALOACETATO

c. La carboxilación acompañada de una reducción, y en presencia de la enzima málica,

convierte al piruvato en L-malato, el cual se oxida luego a oxaloacetato. Esta es una de
las reacciones fijadoras de CO2 en el Ciclo de Krebs, cuando los intermediarios de éste
se agotan:

COO- COO-
C O + CO2 HO CH
CH3 CH2
NADH +
NAD
COO-
H+

PIRUVATO L-MALATO

d. La descarboxilacion acompañada de oxidación, y facilitada por el complejo piruvato

deshidrogenasa, convierte al piruvato en acetil CoA, que en condiciones aeróbicas, en la
mayoría de organismos, se enlaza con otros procesos (ciclo de Krebs, cadena
respiratoria, fosforilación oxidativa), para liberar la máxima cantidad de energía (ATP),
contenida en los azucares y en los lípidos:

3
 COO-

C O + CoA SH CH3 C SCoA + CO2

CH3 O
NAD+ NADH + H+

PIRUVATO ACETIL CoA

El acetil CoA, además, funciona como precursor de varias biomoléculas como los ácidos
grasos (lípidos), cuerpos cetónicos, tespenoides, policétidos, flavonoides.

e. La reducción del piruvato por la enzima lactato deshidrogenasa, en condiciones

anaeróbicas, y en cierto tipo de bacterias, produce el lactato, en un proceso conocido
como fermentación láctica:

COO- COO-

C O HO CH

CH3 CH3
NADH NAD+
H+
PIRUVATO LACTATO

f. La descarboxilación del piruvato por la enzima piruvato descarboxilasa (presente en

cierto tipo de levaduras), produce acetaldehído, que posteriormente se reduce hasta
etanol, en un proceso conocido como fermentación alcohólica:

COO-
O H
C O C + CO2

CH3 CH3

PIRUVATO ACETALDEHÍDO

PROCESO DE FERMENTACION.

El termino fermentación indica degradación anaeróbica de un sustrato, y

bioquímicamente se puede definir como el proceso que utilizan algunas células para

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 extraer energía de los carbohidratos cuando no existe O2 como aceptor de electrones
(es decir como agente oxidante). Ello suele ocurrir en los organismos anaerobios como
bacterias y levaduras, y en células aerobias cuando se ha agotado el O2, como en las
células musculares en ejercicio prolongado. De acuerdo al producto final generado, la
fermentación puede ocurrir por varias vías que normalmente son variantes o
derivaciones de la ruta glucolítica. Es así como se habla de fermentación butanólica,
isoproponólica, acetoláctica, propiónica, acética, pero sobre todo de fermentación
láctica y etanólica.

FERMENTACION LÁCTICA.

Ocurre en bacterias anaerobias como:

 Streptococcus lactis: usada en la producción de mantequilla a partir de la leche.

 Lactobacillus: empleadas en la producción de quesos, cuajos y yogurt a partir de la
leche.

También ocurre en el músculo animal cuando se agita el O2 debido al ejercicio

prolongado.

En ambos casos el producto final es el ácido láctico, que en la medida en que se produce,
se consigue, sobretodo, que la célula disponga del agente oxidante (NAD+) necesario
para seguir extrayendo de los carbohidratos, la energía requerida para sobrevivir (ver
reacción neta de la glucólisis).

El NAD+ se regenera en la siguiente reacción, catalizada por la enzima lactato

deshidrogenasa:

CH3 C COO- + NADH + H+ CH3 CH COO- + NAD+

O OH

PIRUVATO LACTATO

Al acoplar esta reacción con la reacción neta de la glucólisis (ver numeral 2.1), se
obtiene la reacción neta para la fermentación láctica de la glucosa:

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 Glucosa + 2ADP + 2Pi  2Lactato + 2 ATP + 2H2O

El lactato generado no se convierte en otras sustancias. En las bacterias anaeróbicas

constituye el producto final del metabolismo de los carbohidratos, pero en las células
musculares, y cuando el O2 se restituye, una parte se reoxida a piruvato, continuando
por la vía aerobia hasta terminar en CO2 y H2O. Otra parte del lactato es llevado por la
sangre hasta el hígado, donde se resintetiza a glucosa y luego a glucógeno.

FERMENTACION ETANOLICA.

Ocurre preferencialmente en células de levadura como Saccharomyces cerevisiae, que

se usan para fabricar bebidas como la cerveza. Esta fermentación no ocurre en células
animales y vegetales, porque no poseen la enzima piruvato descarboxilasa, necesaria
para descarboxilar el piruvato a acetaldehído:

2+
Mg
-
CH3 C COO CH3 C H + CO2
TPP
O O

PIRUVATO ACETALDEHÍDO

El proceso se complementa con la reacción que genera el producto final (etanol) y el

agente oxidante (NAD+), requerido por la levadura para continuar haciendo glucólisis
y disponer de ATP:

CH3 C H + NADH + H+ CH3 CH2 + NAD+

O OH

ACETALDEHÍDO ETANOL
Esta reacción es promovida por la enzima etanol deshidrogenasa, distribuida en todo
los organismos.

Al sumar la reacción neta de la glucólisis (numeral 2.1) con las dos reacciones dadas
aquí, se obtiene la reacción neta para la fermentación etanólica de la glucosa:

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 Glucosa + 2ADP + 2Pi  2Etanol + 2CO2 + 2ATP + 2H2O

El etanol es el producto final del metabolismo de los carbohidratos en las levaduras, y

aunque eventualmente podrían reoxidarlo a acetaldehído, y éste a ácido acético, en la
práctica no lo deberían hacer porque:

 Se consumirá el NAD+ necesario para seguir extrayendo energía en la glucólisis.

 No se dispone de O2 por ser organismos anaerobios.

Los humanos no producen etanol, sino que lo ingieren. Su metabolismo comprende la

reoxidación a acetaldehído y luego a ácido acético, que finalmente se oxida en el ciclo
de Krebs. El precio de ello es el “malgasto” del agente oxidante NAD+, necesario para la
degradación normal de los azucares en la glucólisis y en el ciclo de Krebs.

En la práctica de laboratorio se pretende observar y cuantificar la velocidad a la cual

cierto tipo de levadura es capaz de fermentar diferentes sustratos (mono, di y
polisacáridos), midiendo la cantidad de CO2 que se va generando en el tiempo:

d cant.CO 2 
V reaccion 
dt

El análisis de los resultados deberá tener en cuenta que, aunque los poli y los
disacáridos generarán mayor cantidad de CO2 que la glucosa (ver reacción neta de la
fermentación etanólica), la velocidad de generación no necesariamente tendrá que ser
en la misma proporción, ya que los poli y los disacáridos requieren procesos y enzimas
adicionales antes de entrar a la vía glucolítica.

3. MATERIALES Y REACTIVOS.

Carbohidratos: glucosa, fructosa, galactosa, sacarosa, lactosa y almidón, levadura seca

(levapan o fleischman), Buffer de acetato 0.2 M a pH=5.5, Baño termostatizado, Sonda
de medición de CO2 Vernier y Tableta de adquisición de datos LabQuest-2 Vernier,
frasco fermentador y equipo para medición de gases o Eudiometro.

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4. PROCEDIMIENTO.

4.1 MEDICION DE LA PRODUCCION DE CO2 EN UN PROCESO DE FERMENTACION.

4.1.1. Aliste el equipo de medición de gases, tal como se indica en la figura 1, la plancha
de calentamiento debe estar entre 37-39 °C. El eudiómetro debe ser llenado
completamente con agua, no deben quedar espacios de aire sobre este. Si queda un
volumen de aire, se inicia la lectura de volumen de CO2 desde la línea donde está el nivel
de agua, que equivale a un volumen (VCO2) igual a cero.

Figura 1. Montaje para Medición de CO2

4.1.2. Tomar 10 mL de solución buffer de acetato de pH=5.5 y 10 mL de agua destilada

que deben estar a 37 °C.

4.1.3. Pesar 1 g de levadura y 0.5 g del carbohidrato que le sea asignado (glucosa,
fructosa, sacarosa, galactosa, lactosa y/o almidón).

4.1.4 Transfiera el carbohidrato y la levadura al frasco fermentador y adicione la mezcla

de buffer y agua al erlenmeyer y tape inmediatamente. Coloque a funcionar el agitador
magnético suavemente a 400 rpm. Cuando aparezca la primera burbuja inicie el
cronómetro desde cero y comience a realizar las lecturas de VCO2 cada minuto y
durante 15 minutos. Anote los datos en la siguiente tabla.

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 Nota: El frasco fermentador no debe ser levantado ni movido durante el proceso de
fermentación. Antes de iniciar la medición del VCO2, verifique que no existan escapes
de aire del sistema.

Carbo- Volumen Tiempo (min)

hidratos CO2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Levadura Vco2
Glucosa Vco2
Fructosa Vco2
Galactosa Vco2
Sacarosa Vco2
Lactosa Vco2
Almidón Vco2

4.2. MEDICION DE LA PRODUCCION DE CO2 EN UN PROCESO DE FERMENTACION

USANDO UNA SONDA ELECTRÓNICA Y EQUIPO DE ADQUISICIÓN DE DATOS
LabQuest-2 Vernier.

4.2.1. En un frasco fermentador adicionar 1 g de levadura y 0,5 g del carbohidrato.

4.2.2. Adicionar 10 mL de la mezcla de buffer y agua a 37 °C y además adicionar un

agitador magnético.

4.2.3. En la boca del frasco fermentador inserte la sonda de CO2 Vernier de tal forma
que haga un sello y no se escape el aire.

4.2.4. Ajuste el agitador a 250 rpm, e inicie la toma de datos en la sonda LabQuest-2
Vernier durante 15 minutos.

4.2.5. Transcriba los datos en la siguiente tabla:

Carbo- Volumen Tiempo (min)
hidratos CO2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Glucosa Vco2
Fructosa Vco2

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Sacarosa Vco2

5. RESULTADOS Y PREGUNTAS.

5.1. De una explicación del tipo de fermentación ocurrida. Escriba la reacción neta
balanceada del proceso fermentativo a partir de glucosa.

5.2. Grafique las variables VCO2 en (mL) vs tiempo (en minutos), y determine su
pendiente (∆V/∆t). Las pendientes para cada uno de los carbohidratos incluyendo la
levadura sin carbohidrato deben graficarse en el mismo gráfico. Consigne los resultados
en esta tabla:

Muestra Velocidad de Fermentación (mL CO2/min)

Levadura sin carbohidrato
Glucosa
Fructosa
Galactosa
Sacarosa
Lactosa
Almidón

5.3. Según la experiencia realizada, ¿Cuál es el orden de velocidad de fermentación de

mayor a menor de acuerdo con la calificación que usted realizó para los carbohidratos
que fueron metabolizados? ¿Cómo se podría justificar?

5.4. ¿Qué resultado obtuvo para el experimento en el cual solo se empleó levadura, sin
presencia de carbohidratos, ¿qué explicación usted puede dar a los resultados de este
experimento?

5.5. Cuales carbohidratos fueron metabolizados por la levadura (Saccharomyces

cerevisiae) de acuerdo con los resultados obtenidos y de una descripción de cómo son
metabolizados.

5.6. Cuales carbohidratos no fueron metabolizados por la levadura (S. cerevisiae). De

una explicación de por qué la levadura no puede realizar estos procesos metabólicos.

10
 5.7. ¿Cuáles son los carbohidratos más favorables para realizar fermentación
empleando la levadura (S. cerevisiae)? ¿Qué función cumple la enzima invertasa
presente en esta levadura?

5.8. ¿Qué tratamientos previos deben realizarse en los carbohidratos que no fueron
metalizados, para que puedan ser empleadas en procesos fermentativos en la
producción industrial de etanol?

BIBLIOGRAFIA.

 QUIJANO, J. Práctica de Fermentación. Guía suelta.

 BOYER, R. Conceptos de Bioquímica. Thomson Editores. México. 2000.
 BOHINSKI, R, Bioquímica. Quinta edición. Prentice Hall. México. 1998.
 CONN, E. y otros. Bioquímica Fundamental. Editorial Limusa. México. 1996.

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 PREINFORME

Nombre:____________________________________________________________ C.C.________________________
Nombre:____________________________________________________________ C.C.________________________
Grupo:_______________________

RESULTADOS PRÁCTICA #5

Volumen de CO2 medido en el Eudiometro

Carbo- Volumen Tiempo (min)

hidratos CO2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Levadura Vco2
Glucosa Vco2
Fructosa Vco2
Galactosa Vco2
Sacarosa Vco2
Lactosa Vco2
Almidón Vco2

Volumen de CO2 medido en la sonda de CO2 del LabQuest-2 Vernier:

Carbo- Volumen Tiempo (min)

hidratos CO2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Glucosa Vco2
Fructosa Vco2
Sacarosa Vco2

Nota: Imprima esta hoja y entrégala al docente al finalizar la práctica.

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