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BIOTECNOLOGA DE LOS PAI UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

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LABORATORIO 03. MTODO DE TURBIDIMETRA Y AZUCARES REDUCTORES
LABORATORIO 03.
DETERMINACIN DE BIOMASA POR MTODOS DE TURBIDIMETRA
Y POR MTODO DE AZCARES REDUCTORES (MTODO DNS)

I. OBJETIVOS
1.1. Objetivo General
Mediante el mtodo de turbidimetra, construir una Curva Patrn y hallar la ecuacin
para determinar la cantidad de biomasa en una solucin de levadura.
Mediante el Mtodo de colorimetra DNS, determinar la cantidad de Azcares
Reductores de una solucin de levadura.

1.2. Objetivos Especficos
Conocer el uso del espectrofotmetro para determinar los valores de absorbancia de
distintas muestras.
Conocer las diferencias entre transmitancia y absorbancia.

II. FUNDAMENTO TERICO

2.1. Biomasa
Se refiere de manera general a los microorganismos presentes en un sistema. A la vez tambin se
puede referir como la cantidad de clulas, de personas, o masa de seres vivos. El objetivo de la
biomasa es la reproduccin de las clulas.
La determinacin de la biomasa es una de las variedades ms importantes de un bioproceso ya
que su determinacin nos lleva a la comprensin de la eficiencia del mismo. Se trata de una
variable clave para establecer las tasas de produccin, de consumo de nutrientes y el clculo de
los balances de masa de cualquier proceso biolgico. Los mtodos clsicos de determinacin de
biomasa son mtodos directos que se basan en el nmero de clulas o en el peso celular. Para
determinar la biomasa es necesario calcular el nmero de clulas en una determinada muestra.
2.2. Turbidimetria
La turbidimetra mide la disminucin de la luz transmitida a travs de una suspensin de partculas
utilizando para ello un espectrofotmetro (detector en la misma direccin del haz de luz, se mide
Absorbancia o Transmitancia). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que haya una
buena disminucin de la luz transmitida). La turbidimetra tiene una gran variedad de aplicaciones
y permite trabajar con muestras gaseosas, liquidas e incluso con slidos transparentes.

La formacin de precipitados difciles de filtrar, como por ejemplo los gelatinosos o los de tamao
de partcula muy pequeo, suelen proporcionar suspensiones ideales para la aplicacin de tcnicas
basadas en la dispersin de la luz que sustituye a las tcnicas gravimtricas. Este tipo de
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aplicaciones son frecuentes en laboratorios analticos, laboratorios clnicos y en plantas de
procesos.

Cuando un haz de luz paralelo golpea una partcula en suspensin, parte de la luz es reflejada,
parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. A diferencia de la Nefelometra, la
cual mide la luz dispersada por una solucin de partculas, la Turbidimetra mide la luz dispersada
como un decrecimiento de la luz transmitida a travs de la solucin. Los mtodos de dispersin de
la luz son las tcnicas ms utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos.

2.3. Transmitancia y Absorbancia
La transmitancia se define como la cantidad de energa que atraviesa un cuerpo en determinada
cantidad de tiempo.

La absorbancia sucede cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslcido, una parte de esta
luz es absorbida por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo. A mayor cantidad
de luz absorbida, mayor ser la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz ser transmitida
por dicho cuerpo. Como se ve, la absorbancia y la transmitancia son dos aspectos del mismo
fenmeno.

2.4. Azcares Reductores
Azcares reductores son aquellos que, como la glucosa, fructosa, lactosa y maltosa presentan un
carbono libre en su estructura y pueden reducir, en determinadas condiciones, a las sales cpricas.

Azcares reductores: Los monosacridos y muchos disacridos, (excepto Sacarosa y Trehalosa).
Monosacridos: Ej. Glucosa, Fructosa
Disacridos reductores Ej.: Lactosa, Maltosa, Isomaltosa, Celobiosa, etc.

Azcares no reductores: Oligosacridos y Polisacridos.
Oligosacridos: molculas formadas por 2 a 10 monosacridos.
Polisacridos molculas formadas por ms de 10 monosacridos. Ej. Almidn, Celulosa,
Glucgeno, Ac. Hialurnico.
Para la determinacin de azcares reductores se aplic el mtodo de colorimetra DNS (Acido 3,5
dinitrosalislico) usando el espectrofotmetro, se realiz la cuantificacin de los azcares
presentes en cada una de las cuatro muestras, para lo cual se cre una curva de calibracin a
partir de una solucin de glucosa.

2.5. Mtodo DNS
Uno de los mtodos ms acordes y con mejor resultados en la determinacin de los azucares con
carcter reductor, es el mtodo DNS (Acido 3,5 dinitrosaliclico), mtodo que ha sufrido varias
modificaciones a travs de los aos para adecuarse al anlisis de diferentes materiales y
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su principal ventaja radica en su alta sensibilidad y productividad debido a que es un mtodo
espectrofotomtrico.

El procedimiento se basa en una reaccin redox que ocurre entre el DNS y los azcares reductores
presentes en la muestra. En tubos de ensayo se adicionan 0.5 ml de muestra y 0.5 del reactivo de
DNS. Los tubos se colocan en bao de agua a 100C por 5 minutos, luego agregamos 5 ml de agua
destilada. Realizamos por ltimo la lectura de la absorbancia en el espectrofotmetro.

El mtodo DNS es una tcnica colorimtrica que emplea 3,5-cidodinitrosaliclico para la hidrlisis
de polisacridos presentes en una muestra, seguido de la determinacin espectrofotomtrica a
540nm de los azcares reductores.
Esta tcnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una fermentacin o
para cuantificar los productos de una reaccin enzimtica. Por lo tanto, se aplicar esta
tcnica para la construccin de una curva patrn de glucosa que ser una referencia para
prximos experimentos

2.6. Cmara de Neubauer
Se trata de una gruesa placa de cristal con forma de portaobjetos, de unos 30 x 70 mm y unos 4
mm de grosor.
En una cmara simple, la porcin central, que es donde se realiza el conteo, est dividida en 3
partes. En la parte central se encuentra grabada una retcula cuadrangular. En el caso de cmara
doble, que son las ms comunes, existen 2 zonas de conteo, una superior y otra inferior al eje
longitudinal de la cmara. La retcula completa mide 3 mm x 3 mm de lado. Subdividida a su vez en
9 cuadrados de 1mm de lado cada uno.
El cuadrado central se divide en 25 cuadrados medianos de 0,2 mm de lado, y cada uno de estos
cuadros se subdivide a su vez en 16 cuadrados pequeos.
2.7. Fase Lag
Es un perodo de adaptacin, cuando un cultivo de microorganismos es llevado de un ambiente a
otro. Los microorganismos sufren una reorganizacin tanto en su velocidad de crecimiento como
en sus constituyentes macromoleculares. Durante esta etapa la masa celular puede cambiar sin
cambiar el nmero de clulas.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
3.1. Materiales
20 tubos de ensayo
01 Rejilla para tubos de ensayo
01 g de levadura
250 ml de Agua destilada
01 Jeringa estril
01 Cmara de Neubauer
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02 Laminillas cubreobjetos estriles
01 Pipeta de 5 ml
01 Pipeta de 1 ml
01 Papel toalla.

3.2. Equipos
Balanza Analtica modelo Sartorius CPA224S
Estufa modelo Memmert
Microscopio de luz
Computador con programa instalado Motic Images 2.0
Espectrofotmetro SQ-4802

3.3. Reactivos
2 ml de DNS (Acido 3,5 dinitrosalislico)

IV. METODOLOGA
4.1. Elaboracin de Curva Patrn
Tomamos 10 tubos vacos, los lavamos y colocamos a la estufa a secar.
Preparamos una solucin de levadura de 1% p/v (1g/100ml)
A partir de la solucin preparada de levadura, preparamos 9 diluciones de 0.8%, 0.6%,
0.4%, 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 0.005% y 0.001% adems de una dcima dilucin al
0.0% que vendra a ser la muestra en blanco (agua destilada)
Tomamos una de stas diluciones (0.4%) para realizar el Conteo de clulas en Cmara
de Neubauer, y calculamos los restantes 9 conteos por proporcionalidad.
Llevamos las 10 diluciones al espectrofotmetro y anotamos el valor de absorbancia
de las muestras a una longitud de onda de 520 nm.
Con los valores de las absorbancias y los valores del conteo de clulas, construimos la
Curva Patrn.

4.2. Mtodo DNS para determinacin de Azcares Reductores
Tomamos 9 tubos vacos, los lavamos y colocamos a la estufa a secar.
Preparamos una solucin de sacarosa a 10Bx (10 g azcar/100 ml agua).
Tomamos primeramente 5 tubos limpios y secos, y colocamos 10 ml de la solucin de
sacarosa de 10Bx en cada tubo.
Aadimos en 4 tubos, 1 ml de la solucin de levadura 1% p/v preparada
anteriormente y el quinto tubo lo dejamos slo con la solucin de sacarosa 10Bx.
Tomamos otros 4 tubos, y en cada uno colocamos 0.5 ml de las muestras que se
encuentran en los 4 primeros tubos, y luego aadimos 0.5 ml de DNS.
Sumergir los tubos por un periodo de 5 minutos en un bao de agua a ebullicin.
Diluimos cada uno de estos tubos con 5 ml de agua destilada.
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Levamos las 5 diluciones al espectrofotmetro y anotamos el valor de absorbancia de
las muestras a una longitud de onda de 540 nm.
Con los valores de las absorbancias, determinamos los g
glucosa
/L/min/g
levadura
.

V. RESULTADOS Y DISCUSIONES
5.1. Elaboracin de Curva Patrn
Tabla 01. Valores de absorbancia y concentraciones de clulas/ml para la construccin de la Curva
de Calibracin.
Dilucin %
Absorbancia
=520 nm
Neubauer
(cel./ml)
Transmitancia (%)
0.8 2.41 6.52 x10
7
0.39
0.6 2.369 4.89 x10
7
0.43
0.4 1.937 3.26 x10
7
1.16
0.2 1.305 1.63 x10
7
4.95
0.1 0.916 8.15 x10
6
12.13
0.05 0.787 4.07 x10
6
16.33
0.01 0.128 8.15 x10
5
74.47
0.005 0.172 4.07 x10
5
67.30
0.001 0.094 8.15 x10
4
80.54
0 0 0 100.00

Para este primer paso, habamos elegido el tubo N03 que contena la dilucin 0.4% y
determinamos la concentracin de clulas/ml en sta dilucin, siendo la cantidad de 3.26x10
7
, lo
cual es correcto para proceder a tomar valores de absorbancia en el espectrofotmetro.
La dispersin es proporcional a la concentracin del cultivo y slo es vlido para concentraciones
mayores a 10
7
clulas/ml, donde la proporcionalidad de la absorbancia y la masa bacteriana se
conservan. As, utilizamos el espectrofotmetro, que mide la absorbancia. (MACU, 1975)
Con estos datos tomados durante la prctica se construye la curva de calibracin, que relaciona las
concentraciones de las diferentes diluciones y la absorbancia medida en cada una de ellas. La
Figura 01 muestra a Curva de Calibracin para determinar la concentracin de clulas presentes
en un mililitro de solucin, a partir del valor de la absorbancia.

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Figura 01. Curva de Calibracin: Absorbancia vs. [Cel. /ml]
Tabla 02. Anlisis de Varianza

Grados de
libertad
Suma de
cuadrados
Promedio de
cuadrados
F
Valor crtico
de F
Regresin 1 8.43 x10
14
8.43 x10
14
62.40 0.000218231
Residuos 6 8.11 x10
13
1.35 x10
13

Total 7 9.24 x10
14


Tabla 03. Valores de los coeficientes de la ecuacin de Curva de Calibracin.
Coeficientes
Intercepcin -2701875.23
absorbancia 15735547

En la Figura 1, se muestra la Curva de Calibracin, la que, considerando los valores de absorbancia
a diferentes concentraciones de clulas/ml, obtenemos una ecuacin (Ecuacin 1), de la cual
podemos registrar la medida de la concentracin de clulas con tan solo tener el valor de la
absorbancia de la muestra.
Obtuvimos adems un valor de correlacin no muy alto (91.23%) en la determinacin de la Curva
de Calibracin, quiere decir que un cambio en la medida de la absorbancia se traduce en un
cambio aproximadamente proporcional en la concentracin de clulas/ml.
Ecuacin 1: cc (cel /ml) = 15735547*Abs 2701875.23

y = 2E+07x - 3E+06
R = 0.9123
-5000000
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
0 1 2 3
c
e
l
/
m
l

Absorbancia
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Figura 02. Curva Logartmica de Absorbancia y Transmitancia para muestras diluidas de solucin
de levadura 1% p/v
5.2. Mtodo DNS para determinacin de Azcares Reductores
Cuando buscamos informacin acerca de cmo realizar la determinacin de azcares reductores,
nos encontramos con prcticas ya hechas, en las que se habla de hidrolisis acida, para este
laboratorio, utilizamos el cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS). Adems, es muy empleado en la
determinacin de azucares reductores como una tcnica colorimtrica, ya que proporciona un
color medionaraja a la muestra, la que cambia de tonalidad segn la cantidad de sustrato (azcar)
que se encuentre en la muestra.

Ecuacin 2.: cc (g/l) = 1.9211*Abs. 0.2009
Tabla 04. Valores de concentracin de glucosa resultante tomadas cada 5 minutos
tiempo
(min)
Absorbancia
=540 nm
Concentracin (g/L) g
glucosa
/L/min/g
levadura

1 ml
solucin
levadura
0.1 ml
solucin
levadura
1 ml
solucin
levadura
0.1 ml
solucin
levadura
1 ml
solucin
levadura
0.1 ml
solucin
levadura
5 1.438 0.932 2.562 1.590 0.512 3.179
10 1.590 0.829 2.854 1.392 0.285 1.392
15 1.678 1.135 3.023 1.980 0.202 1.320
20 2.765 1.721 5.111 3.105 0.256 1.553

En la Tabla 04 notamos el comportamiento de la concentracin final de glucosa en muestras de
soluciones de levadura a travs del tiempo (parmetros de 5 minutos), y vemos cmo estos
y = -0.434ln(x) + 2
R = 1
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Transmitancia (%)
Absorbancia
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valores descienden. Esto se traduce en simple explicacin, que los azcares son el sustrato que las
levaduras van consumiendo.
Los azucares reductores son monosacridos que poseen grupos carbonilos libres, que se obtienen
de la hidrlisis cida y trmica de los polisacridos. El mtodo DNS es una tcnica colorimtrica
que emplea cido 3,5 dinitrosaliclico para la hidrlisis de polisacridos presentes en una muestra.
Determina las absorbancias por medio de un espectrofotmetro a 540nm. Esta tcnica sirve para
cuantificar los azucares reductores producidos durante una fermentacin o para cuantificar los
productos de una reaccin enzimtica. (Carrascal, et.al, 2003)
El DNS reacciona nicamente con los azcares reductores. La sacarosa es un disacrido no
reductor, pero tras su hidrlisis en medio cido se liberan glucosa y fructosa que s son reductores
y reaccionan con el DNS generando un producto coloreado. La intensidad del color, que se puede
medir por mtodos espectrofotomtricos es proporcional a la concentracin de sacarosa.
(Carrascal, et.al, 2003)

Figura 03. Comportamiento de la Absorbancia en el tiempo.
La absorbancia es inversamente proporcional a la cantidad de sustrato que queda en el cultivo. La
composicin qumica del medio de cultivo est cambiando debido a que los nutrientes se estn
consumiendo y productos metablicos son producidos. (Ting, 1956)

Observamos en la Figura 03 el comportamiento de los valores de absorbancia en las muestras
finales de levadura y DNS, y notamos que los valores de la absorbancia tomados en el
espectrofotmetro, en los primeros 15 minutos, varan 1.438 y 1.678 para la muestra de 1 ml de
solucin de levadura, y a partir de los 15 minutos, ste valor aumenta exponencialmente, y
notamos que a los 20 minutos, toma un valor de 2.765.
En los primeros 15 minutos, nos encontramos en la Fase Lag, donde existe un aparente reposo en
el que las clulas sintetizan las enzimas necesarias para la actividad metablica que deben llevar
adelante. Cuando se hacen mediciones del nmero de clulas en distintos tiempos dentro de esta
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 5 10 15 20 25
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

tiempo (min)
1 ml solucin
levadura
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fase, el valor no cambia sustancialmente. En cambio, interiormente las clulas trabajan
activamente adaptando el equipo enzimtico al medio de cultivo. La levadura se prepara para
hacer uso de los nutrientes que este medio le aporta, por lo tanto es la fase de adaptacin al
medio, con aumento de la masa celular pero no del nmero de clulas. Pasado este perodo, el
cultivo entra en la denominada fase de crecimiento exponencial (Fase Log), donde la velocidad de
crecimiento es mxima. La velocidad de crecimiento que alcanza un cultivo, depende de diversos
factores ambientales como son la temperatura, el pH, oxigenacin, etc. (Bello, et.al, 2006)

Figura 04. Comportamiento de la concentracin de glucosa en el tiempo.
En los tubos conteniendo las muestras y el DNS, notamos que los resultados de absorbancia a 540
nm van incrementndose desde el tubo 1 al tubo 4 a medida que pasan los minutos, pues, como
menciona Ramos y Prez ( 2004) a mayor tiempo transcurrido habr mayor hidrlisis de sacarosa y
por tanto mayor nmero de grupos reductores que reaccionan con el DNS y se convierten en 3-
amino-5-dinitrosaliclico, compuesto anaranjado que tiene su mximo de absorbancia a 540 nm.
Este aumento debe ser proporcional, aunque puede perderse en los ltimos minutos si ya se ha
conseguido hidrolizar prcticamente toda la glucosa de la muestra, estaramos hablando de las
fases de Desaceleracin y Estacionario del crecimiento de Levaduras.
VI. CONCLUSIONES

Aplicando proporcionalidad, determinamos las concentraciones de cel/ml en cada
dilucin, y con sus respectivos valores de absorbancia, construimos la Curva Patrn, la
que, al linealizar, resulta la ecuacin: cc (cel /ml) = 15735547*Abs 2701875.23
Por el mtodo DNS logramos determinar la cantidad de Azcares Reductores y la
concentracin de glucosa en muestras tomadas cada 5 minutos.
El grupo de alumnos del IX ciclo, en el curso de Biotecnologa de los PAI, asesorados
por el Ingeniero, logramos obtener el conocimiento para el uso del
espectrofotmetro y poder as determinar los valores de absorbancia para distintas
muestras.
y = 0.1563x + 1.433
R = 0.7506
y = 0.1027x + 0.7328
R = 0.7493
0.000
1.000
2.000
3.000
4.000
5.000
6.000
0 10 20 30
c
c

(
g

g
l
u
c
o
s
a
/
L
)

t (min)
1 ml solucin
levadura
0.1 ml
solucin
levadura
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VII. RECOMENDACIONES

Asegurarse tener los materiales completos y limpios antes de empezar la prctica.
Calibrar bien el microscopio con la finalidad de observar de manera buena las
levaduras y as facilitar el conteo.
Es mejor usar una jeringa en vez de pipeta, por el tamao de gota y por la facilidad de
manejo.
Mediante el programa Motic Images 2.0 tenemos un fcil acceso para contabilizar las
clulas ene l computador, pero es preferible tomar fotos a las cuadrillas para ganar
tiempo.
Utilizar los tubos estriles, para evitar una contaminacin en las muestras, para ellos,
se lava, desinfecta y colocamos en la estufa para secar antes de usar.
Al momento de hacer las diluciones, hacer un buen clculo para las medidas exactas
en las diluciones, y no tener problemas al pasar las muestras en el espectrofotmetro.

VIII. BIBLIOGRAFA

Ramos, M.; Prez, M. 2004. Manual de Prcticas de Laboratorio de Microbiologa
General. Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa. Mxico.
Departamento de Biotecnologa. 116 p.

Carrascal, A.; Pez, A. y Burbano, M. 2003. Manual de Laboratorio: Microbiologa de
Alimentos. Pontifica Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias, Departamento de
Microbiologa. Bogot. 171 p.

Ting, S.V. 1956. Rapid Colorimetric Methods for Simultaneous Determination of Total
Reducing Sugars and Fructose in Citrus Juices. Agric. Food Chem. Vol. 4(3) 263-266.

Bello, D.; Carrera, E. y Daz, Y. 2006. Determinacin de azcares reductores totales en
jugos mezclados de caa de azcar utilizando el mtodo del cido 3,5 dinitrosaliclico.
Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caa de Azcar. Cuba. pp
45 50.

Manual analtico para el Control Unificado (MACU) de alcohol y levadura
Sacharomyces. Control analtico Parte 1, Cuba, 1975.


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ANEXOS

ANEXO 01. Conteo de clulas en 9 cuadrculas de 0.2 mm x 0.2 mm en la dilucin de 0.4%


Cuadrantes de 0.05 x 0.05 mm
2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
C
u
a
d
r
i
c
u
l
a
s

d
e


0
.
2

x

0
.
2

m
m
2

1 8 9 10 2 11 7 8 8 7 18 8 3 2 14 21 6
3 11 21 14 10 7 17 11 13 5 9 5 13 5 8 8 5
5 5 6 5 8 14 12 14 10 4 14 8 3 2 5 8 2
11 6 2 6 8 5 10 9 6 5 10 10 8 4 5 6 6
13 7 11 12 6 8 9 9 12 7 7 9 12 7 5 5 6
15 2 8 17 5 13 18 5 8 10 11 7 7 3 10 4 3
21 5 7 8 6 15 12 10 3 3 4 2 9 7 18 10 11
23 6 4 3 7 3 7 4 12 3 11 10 6 4 11 4 3
25 12 8 11 2 14 15 8 9 8 9 17 10 8 6 6 9

ANEXO 02. Clculos estadsticos y conteo de clulas en las cuadrculas de 0.2 mm x 0.2 mm


Cuadriculas de 0.2 mm x 0.2 mm
1 3 5 11 13 15 21 23 25
Sumatoria 142 162 120 106 132 131 130 98 152
Promedio 130.33/0.4 = 325.8
Concentracin
de clulas
mL clulas x
mL
mm
x
mm x x
clulas
cc / 10 4 . 6
1
10
) 1 . 0 2 . 0 2 . 0 (
8 . 254
7
3 3
3


Desv. Est. 51.204
C. V. 15.71%

ANEXO 03. Curva Patrn de concentracin de glucosa/L vs Absorbancia


Ecuacin: C(g/l) = 1.9211*Abs 0.2009
y = 1.9211x - 0.2009
R = 0.991
0
0.25
0.5
0.75
1
1.25
1.5
1.75
2
2.25
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Curva Patrn g/l Glu vs Abs
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ANEXO 04. Diluciones de 0.8; 0.6; 0.4; 0.2; 0.1; 0.05; 0.01; 0.005; 0.001 y blanco, para
determinacin de Curva Patrn.

ANEXO 05. Muestras preparadas con solucin de Glucosa a 10Bx para determinacin de
azucares reductores.

ANEXO 06. Muestras con DNS para determinacin de Azcares Reductores.



BIOTECNOLOGA DE LOS PAI UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
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LABORATORIO 03. MTODO DE TURBIDIMETRA Y AZUCARES REDUCTORES
ANEXO 07. Espectrofotmetro.

ANEXO 08. Fotografas tomadas en el computador a las 9 cuadriculas para el conteo de
clulas.