PROTEÍNA POR BRADFORD

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA POR EL MÉTODO DE BRADFORD (Bradford, 1976)

Se basa en la unión del colorante Comassie Blue G a las proteínas. El colorante, en solución ácida,
existe en dos formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un
complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este
método es simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las
sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas

REACTIVO DE BRADFORD
Para 1 L Disolver:
 50 mg de Comassie Blue G
 50 mL de etanol al 96 %
 100 mL de ácido fosfórico (H3PO4) al 85 %
 Aforar con agua destilada fría
 Filtrar si es necesario
 Guardar en oscuridad y en refrigeración (la solución es estable de 2 – 3 meses)

RECOMENDACIONES
 Enfriar el etanol, el agua destilada y el H3PO4
 Preparar en cabina extractora de gases y humos
 Preparar el reactivo de Bradford en un beaker cubierto con papel aluminio, agitando
continuamente
 Cubrir el balón volumétrico con papel aluminio

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

REACTIVO DE BRADFORD
 Lavar los 50 mg del Comassie Blue G con el etanol en un beaker cubierto con papel aluminio,
agitando continuamente y en un baño de hielo
 Adicionar lentamente el H3PO4 frio en constante agitación
 Aforar el reactivo con el agua destilada fría en el balón volumétrico forrado con papel aluminio

SOLUCIÓN NaOH
Preparar una solución de NaOH 1 N

CURVA DE CALIBRACIÓN

ENSAYO DE BRADFORD
Este protocolo se emplea para concentraciones de proteína entre 0,05 mg/mL y 1,0 mg/mL

Preparar soluciones patrones de proteína de:

0,05 mg/mL 0,1 mg/mL 0,2 mg/mL 0,4 mg/mL 0,6 mg/mL 0,8 mg/mL 1,0 mg/mL, a partir
de una solución de 1 mg/mL de albúmina sérica bovina (ABS) (preparando 25 mL es suficiente).

Nota: cada vez que se preparen los reactivos, elaborar una nueva curva de calibración.

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 PROTEÍNA POR BRADFORD

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL ENSAYO DE BRADFORD

A 80 µL de muestra problema se le agregan 200 µL de NaOH 1N y 4 mL del reactivo de Bradford. Se agitan

inmediatamente en un vórtex y a los 5 min se toma la lectura de la absorbancia a una longitud de onda de
595 nm.

Nota: Lo último que se adiciona es la muestra

Al utilizar celdas de cuarzo es necesario purgarlas con metanol entre muestra y muestra, pues el colorante
se une a las paredes de la misma.
80 L de muestra
(se adiciona de último)

200 L NaOH 1N 4 mL del reactivo de

MEZCLAR Bradford

AGITAR
Inmediatamente en el vórtex

REACCIONAR
5 minutos

LEER
Absorbancia a 595 nm
frente al blanco

PREPARACIÓN DEL BLANCO

 El blanco de análisis simplemente es una muestra que no contienen el analito (mensurando) de
interés, o un análisis sin la muestra, es decir, realizar todos los pasos del procedimiento solo con los
reactivos y en lugar de la muestra adicionar 80 L de agua destilada
 El blanco se debe preparar al tiempo con las muestras para evitar errores experimentales adicionales.

MICROENSAYO DE BRADFORD
Para concentraciones de proteína entre 0,01 mg/mL y 0,20 mg/mL es necesario hacer una modificación del
ensayo. A 125 µL de muestra problema se le agregan 200 µL de NaOH 1N y 4 mL de reactivo colorante. Se
agitan inmediatamente en un vórtex y se toma la lectura de la absorbancia a una longitud de onda 595
nm al cumplirse 5 min de espera.

Los datos de la curva de calibración se ajustan a una ecuación cuadrática

Absorbancia = A + B* [ P ] + C * [ P ]2

Dónde:

A, B y C = coeficientes de la regresión

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[ P ]= concentración de proteína

REFERENCIA

Stoscheck, C.M. (1990): Quantitation of protein, in Methods in Enzymology, M.P. Deutscher, Editor. 1990, Academic Press:
San Diego, California. p. 50-68.

Bradford, M. M. (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of micro-gram quantities of protein utilizing the
principle of protein dye binding. Anal. Biochem., 72:248-254.