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Navegación 7. Bradford Y DNS
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1. Bienvenida
2. Enzimas Al trabajar con enzimas, es importante saber lo que
3. Equilibrio realmente hay en la muestra con la que se esta trabajando,
químico
por eso es importante hacer algunas pruebas y comprobar
4. Centro
Activo que y cuanto es lo que tenemos en la muestra, a
5. Energía continuación hablaremos de un método para determinar
Libre azúcares reductores y otro para determinar proteínas.
6. Tipos de
catálisis
enzimáticas
6.1. Efectos de ·Bradford.
la
Temperatura
6.2. Efectos de Es muy importante determinar y cuantificar la
pH concentración total de proteínas, existen varios métodos
7. Bradford Y
para lograrlo pero aquí hablaremos del método
DNS
8.
de Bradford, ya que es uno de los más rápidos, sencillos,
Electroforesis baratos y pocas sustancias interfieren en su determinación,
8.1. Peso entre las sustancias que infieren están los detergentes y las
molécular soluciones básicas.
8.2. SDS
PAGE Ese método se basa en la unión no covalente del colorante
8.2.1.
Electrofore…
Azul de Coomassie G-250 y la proteína; el colorante en
en gel solución ácida presenta dos formas coloreadas, café y azul.
poliacrilami… El color café cambia a azul cuando el colorante se ha unido
8.2.2. Tipos de con la proteína, la formación de este complejo colorante-
monómeros
proteína toma aproximadamente 2 minutos y permaneces
9. Michaelis-
Menten estable por 1 hora.
9.1. Las muestras se leen en el espectofotometro a una
Parámetros absorbancia de 595 nm.
Cinéticos
9.2. Métodos El método de Bradford es sensible para los residuos de
de
linealización aminoácidos de arginina, triptófano, tirosina, histidina y
9.3. Cinética fenilalanina.
no
Michaeliana
9.4. Cinética
Enzimática La solución de Bradford se prepara con:
9.4.1     -10 mg de Azul de Comassie G-250
Práctica/M…     -5 mL de etanol al 95%
A. Referencias     -10 mL de ácido fosfórico al (5% (w/v)
B. Artículos
relacionados
Mapa del sitio La solución de diluye a volumen final de 100 mL.
El reactivo debe tener color café y se almacena en un
frasco ámbar bajo refrigeración. 

La curva patrón se realiza con albúmina, la cual queda de la

siguiente forma:

Figura 7.1. Curva estándar de Albumina de suero bovino

(BSA) por el método de Bradford.

Bradford, M. M., 1976. “A rapid and sensitive method for the

quantitation of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye binding”. Anal. Biochem. 72:248-
254.

·Ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS).

Tambien es importante determinar la concentración de

azúcares reductores totales en una muestra, y con esta
cuantificación se obtiene una curva de calibración
siguiendo el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS).

El método DNS determina la presencia de grupos

carbónicos libres (C=O) de los azucares reductores. El
procedimiento se basa en una reacción redox, que
ocurre en la utilización de ácido 3,5 dinitrosalicílico para
provocar la oxidación de los azucares y al mismo tiempo
su propia reducción endotermica. Un mol de azúcar
reacciona con un mol de ácido 3,5 dinitrosalicílico,
dando lugar a una reacción estequiométrica que
permite conocer la cantidad de azucares reductores
presentes en la muestra.

Después de esto se continua con la determinación,

haciendo lecturas de absorbancia en el
espectrofotometro a 540 nm.

OH +reducing OH +oxidised
sugar sugar

ON NO2 ON NH2

3,5-dinitrosalicylicacid 3-amino-5-nitrosalicylate(red,Anax540nm)

Figura 7.2. Reacción de oxidación de azúcares

reductores, método DNS.

La reacción es colorimétrica, el ácido 3.5 dinitrosalicílico

es de color amarillo, mientras que la aparición de ácido
3-amino, 5-nitrosalicílico provoca un viraje a pardo
oscuro, cuya intensidad será proporcional a la cantidad
de azucares reductores (E. Casablanca et al., 2009). Por
esta razón, el método no es recomendable para
muestras coloreadas, ya que pueden afectar en la
lectura que se realice en el espectrofotometro.

El reactivo del ácido 3,5 dinitrosalicílico se prepara con:

-Solución de 100 mL con 2g de NaOH disuelto

-Agregar 2g de ácido 3,5-dinitrosalicílico con agitación
constante
-Agregar 40 g de Tartrato de sodio-potasio tetrahidratado
-Agregar 0.4g de fenol
-Agregar 0.1 g de sulfito de sodio
-Aforar a 200 mL con agua destilada

El volumen final no debe ser mayor a 200 mL y se debe

guardar en oscuridad en frasco ámbar

Existen dos facetas de calibración en el análisis cualitativo,

la calibración instrumental y la calibración metodológica. La
calibración instrumental se realiza con estándares que no
contienen el analito y se utiliza para asegurar el
funcionamiento del instrumento empleado.

La calibración metodológica se realiza con estándares que

contienen el analito para establecer una relación entre las
características fisicoquímicas del analito y las señales del
instrumento. En un proceso analítico se relaciona la señal y
características del analito, de modo que la calibración se
realiza al obtener la señal de respuesta como función de la
concentración conocida del analito. Se representan los
datos obtenidos y se obtiene la gráfica de la señal corregida
frente a la concentración del analito. Lo normal es que la
gráfica tienda a una línea recta, donde a medida que
aumenta la concentración (Fig.1), la señal de respuesta es
mayor (pendiente positiva). En el modelo de curva de
calibración lineal, la pendiente vendrá dada por la ecuación
matemática:

y = mx + b 

Siendo m la pendiente, x la concentración e y la señal de

respuesta. La sensibilidad de calibración es la pendiente de
la curva de calibrado. Por tanto en una curva de calibrado
lineal la sensibilidad es siempre la misma y no va a
depender de la concentración, ya que para que se cumpla y
= mx + b, las concentraciones deben tener una
incertidumbre insignificante.

Exactitud

Es el grado de concordancia entre el resultado de una

determinación o la media de “n” resultados y el valor
“verdadero” del analito en la muestra en cuestión. Toda
medida tiene un fallo, por lo que el valor verdadero no lo
conocemos, pero nos podemos aproximar a él utilizando los
siguientes materiales:

• Material de referencia: material o sustancia, en el cual

una o más de sus propiedades están suficientemente bien
establecidas para que sea usado en la calibración, la
estimación de un método de medición o para asignar
valores a los materiales.

• Material de referencia certificado (MRC): material en el

que los valores de una o más de sus propiedades están
certificados por un procedimiento técnicamente validado.

Determinación de proteínas y azúcares reductores

Existen diversos métodos que permiten cuantificar la

concentración de proteína presente en las muestras
biológicas, basados en las propiedades que muestran las
proteínas en solución.

Los métodos más usuales son:

. Reacción de Biuret.

. Método de Lowry.

. Método de Bradford.

. Método del ácido Bicinconínico (BCA).

. Absorción en el ultravioleta.

. Métodos inmunológicos.

Siendo uno de los más utilizados el método Bradforf por ser

un método rápido, reproducible y sensible.

Para la determinación de azúcares según el método Miller,

los azúcares reductores pueden reducir al ácido 3,5-
dinitrosalicílico (DNS) bajo determinadas condiciones.
Cuando el ácido 3,5-dinitrosa- licílico es reducido en
presencia de calor, por los azúcares reductores que entran
en contacto con él, se desarrolla un cambio de color
parecido al café (con variaciones de amarillo hasta café). El
cambio de coloración puede entonces determinarse por
lecturas de densidad óptica, leídas por espectrofotometría
a una determinada longitud de onda. La concentración de
los azúcares reductores totales liberados en la muestra se
determina haciendo una interpolación en la curva patrón
del azúcar utilizado, graficando la absorbancia en función
de la concentración.

OBJETIVO GENERAL

Elaboración de diferentes curvas de calibración (azúcares

reductores y proteínas) y entender su importancia.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Obtener una curva de calibración para azúcares

reductores haciendo uso del método de Miller (DNS) usando
Glucosa como estándar.

• Obtener una curva de calibración para proteína por el

método Bradford usando Albúmina de huevo (AH) como
estándar.

MATERIALES Y EQUIPO

. Micropipetas de 1000, 200 y 20 µL

. Puntas para micropipeta azules y amarillas

. Tubos eppendorf de 1.5 mL

. Gradillas para eppendorf

. Vasos de pp de 1 litro

. Vasos de pp de 250 mL

. Reactivo DNS

. Reactivo Bradford

. Parrilla de calentamiento

. Recipiente con hielos.

. Espectrofotómetro con celdas

. Vortex

DESARROLLO EXPERIMENTAL Y TEÓRICA.

OBTENCIÓN DE LAS CURVAS DE CALIBRACIÓN.

a) Azúcares Reductores

1. Para la obtención de la curva de calibración de azúcares

reductores se utilizará como estándar la Glucosa para ello
se realiza la curva patrón de Glucosa (o el azúcar reductor
más adecuado en función de lo que se vaya a determinar)
en un rango de concentración de 0 a 2.0 g/L.

2. Las diluciones se prepararán, por duplicado, de acuerdo

a la Tabla 1, o bien, pueden realizarse diluciones seriadas
teniendo en cuenta la concentración que se tendrá en cada
una.

3. Una vez que se preparan las diluciones se debe realizar el

procedimiento para azúcares reductores.

*Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el

espectrofotómetro.

CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES

POR EL MÉTODO DE DNS

4. Agregar 100 µL de la solución problema (solución de

glucosa a 1 mg/mL o de sacarosa a 6 mg/mL ya digerida,
tabla 1).

5. Agregar 300 µL del reactivo de DNS preparado.

6. Ebullir 5 minutos y dejar enfriar (10 minutos

aproximadamente) en el recipiente con hielos.

7. Agregar 600 µL de agua destilada.

8. Agitar en vórtex a temperatura ambiente.

9. Leer la absorbancia registrada en el espectro de UV-

Visible a 540 nm (cuidar que no pase más de 30 min para
su lectura).

10. Elaborar la curva patrón en donde se grafique en el eje

de las ordenas (eje “y”) promedio de la absorbancia
determinada a 540 nm y en el eje de las abscisas (eje ”x”)
el promedio de la concentración de Glucosa determinada en
g/L.

11. Determina la ecuación de la línea recta que relaciona a

los dos parámetros:

y = mx + b

En donde “y” representa la absorbancia determinada a 540

nm. “x” representa la concentración de maltosa
determinada en g/L.

La curva patrón será correcta cuando se obtenga una R2

mayor o igual a 0.98, con lecturas de absorbancia entre 0 y
1.

b) Determinación de Proteína.

1. La determinación de proteína de una solución enzimática

con el método de Bradford, se determina por medio de una
curva tipo con albúmina de huevo (AH) y el reactivo de
Bradford.

2. Curva tipo: preparar diferentes concentraciones de AH

de 0 a 200 µg/mL, a partir de una solución de 200 µg/mL,
(Tabla 2).

3. Agregar en un tubo eppendorf limpio la cantidad de

solución de AH y agua que se indica para obtener un
volumen final de 0.25 mL de muestra.

4. Posteriormente adicionar 0.75 mL de reactivo de

Bradford, y dejar en reposo EXACTAMENTE 5 minutos,
inmediatamente después leer la absorbancia a 595 nm,
ajustando el equipo con el “blanco de reactivos” o agua (el
que no contiene proteína).

REFERENCIAS

• Bradford, M. M., 1976. “A rapid and sensitive method for

the quantitation of microgram quantities of protein utilizing
the principle of protein-dye binding”. Anal. Biochem.
72:248-254.

• Miller G., 1959. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for

Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 31: 426-428.

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Ċ REALIZACION DE CURVAS DE CALIBRACIÓN P… Ulises Carrillo, 30 may 2016, 18:53 v.1 ď

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