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Manual de Prácticas
BIOQUÍMICA II
MANUAL DE PRÁCTICAS
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GENERAL

TEMA: CARBOHIDRATOS

TÍTULO: DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR EL

MÉTODO DE BERTAND MODIFICADO

INTRODUCCIÓN.

Los azúcares reductores son aquellos que poseen un grupo carbonilo (C=O) libre capaz
de reducir a agentes metálicos. De esta manera, los monosacáridos pueden ser
oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves, como el íon cúprico
(Cu+2), donde el carbono del carbonilo es oxidado a un grupo carboxilo. Los
disacáridos, excepto la sacarosa también poseen el carácter reductor, por lo que se
pueden determinar cuantitativamente empleando reactantes a base de metales que
propicien la reacción. La lactosa es el disacárido presente en la leche de los
mamíferos, su contenido es variable según la mamífera de la que procedan,
encontrándose alrededor de 4% en la leche de vaca.

OBJETIVOS. Prof. William J. Zambrano Herrera

GENERAL:
Aux. Doc. Karla Quiñonez Mendoza
Aplicar el carácter reductor de los azúcares en la cuantificación de ciertos azúcares
TSU Luisa Matute
presentes en muestras de alimentos, empleando el método de Bertrand.

TSU Carlos Contreras

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MANUAL DE PRÁCTICAS
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA II

TEMA: CARBOHIDRATOS

TÍTULO: DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE LACTOSA EN UNA

MUESTRA DE LECHE FRESCA

INTRODUCCIÓN.

Los azúcares reductores son aquellos que poseen un grupo carbonilo (C=O) libre capaz
de reducir a agentes metálicos. De esta manera, los monosacáridos pueden ser
oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves, como el íon cúprico
(Cu+2), donde el carbono del carbonilo es oxidado a un grupo carboxilo. Los
disacáridos, excepto la sacarosa también poseen el carácter reductor, por lo que se
pueden determinar cuantitativamente empleando reactantes a base de metales que
propicien la reacción. La lactosa es el disacárido presente en la leche de los
mamíferos, su contenido es variable según la mamífera de la que procedan,
encontrándose alrededor de 4% en la leche de vaca.

OBJETIVOS.

GENERAL:

Aplicar el carácter reductor de los azúcares en la cuantificación de ciertos azúcares

presentes en muestras de alimentos, empleando el método de Bertrand.

ESPECÍFICOS:

1. Determinar el porcentaje de lactosa de una muestra de leche fresca

empleando el Método de Bertrand.
2. Observar el efecto de los azúcares reductores a una solución cupro-alcalina.

FUNDAMENTOS TEÓRICO-PRÁCTICOS.

METODO DE BERTRAND (Fernández et al., S/F)

Los métodos reductométricos determinan la totalidad de los azúcares reductores

presentes en una muestra. Estos métodos se basan en la capacidad reductora de los
distintos azúcares sobre disoluciones salinas de metales pesados (sobre todo cobre).
Todos los monosacáridos se encuentran en forma hemiacetálica, con su grupo
carbonilo libre. En disolución alcalina la estructura hemiacetálica se rompe y el grupo
carbonilo reductor se libera. Es decir, todos los monosacáridos tienen poder
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reductor. En el caso de oligosacáridos, no todos poseen poder reductor. En los

oligosacáridos, el enlace entre monosacáridos (enlace glicosídico), se forma entre el
grupo carbonilo de un monosacárido y un grupo –OH del otro. Si este grupo hidroxilo
corresponde al grupo carbonilo del segundo monosacárido, el disacárido resultante
carecería de poder reductor, por no tener ningún grupo carbonilo libre, como es el
caso de la sacarosa. Sin embargo, si el grupo carbonilo de, al menos uno de los
monosacáridos queda libre, el oligosacárido resultante sí que presentaría poder
reductor, como sucede en el caso de la maltosa. Para determinar los azúcares no
reductores, deben escindirse primero por hidrólisis ácida o enzimática, a sus
correspondientes monosacáridos, que sí son reductores.

Por tanto, mediante los métodos químicos basados en la reducción del cobre, se
pueden determinar solamente azúcares reductores. Si se quieren determinar
azúcares reductores y no reductores, es necesario someter a la muestra previamente
a un proceso de hidrólisis y, de esta forma, todos los azúcares presentes se
transformarán en azúcares reductores, pudiendo así determinar los azúcares totales
(Práctica # 3 de Bioquímica Aplicada). La reacción que se da en este tipo de métodos
es la que tiene lugar entre las disoluciones de azúcares y las disoluciones alcalinas de
sulfato cúprico a alta temperatura. Las disoluciones empleadas en estas
determinaciones contienen sulfato cúprico, un álcali y tartrato sódico potásico
(sustituido por ácido cítrico en algunos métodos). Es muy usual utilizar las
disoluciones de Fehling (Fehling A: disolución de CuSO4; Fehling B: disolución de
tartrato sódico potásico e hidróxido sódico).

Como se ha comentado anteriormente, en disolución alcalina la estructura

hemiacetálica de los azúcares se rompe y el grupo carbonilo reductor se libera. Éste
se oxida con el ión Cu2+ en disolución alcalina a temperatura de ebullición y en
condiciones de trabajo estrictamente controladas, reduciéndose el ión Cu 2+ a ión Cu+,
formándose finalmente un precipitado de óxido cuproso, tal y como se muestra a
continuación:

Azúcar
Oxidación: R-C=O + 2OH- R-C=O + H2O + 2e-

H OH
OH- / Calor 2OH- / Calor
Reducción: 2Cu+2 + 2e- 2Cu+ ↓Cu2O + H2O

El método de Bertrand se basa en la determinación de la cantidad de Cu 2O formado,

empleando una disolución ácida de Fe2(SO4)3 y posterior valoración con KMnO4, todo
ello gracias a la propiedad reductora de la lactosa, debido a sus funciones
aldehídicas libres. La leche, previa precipitación de las proteínas y grasas, se trata
con un reactivo cupro-alcalino.
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ETAPAS DEL MÉTODO DE BERTRAND (Fernández et al., S/F)

Los pasos principales de este método para determinar azúcares totales son los
siguientes:

1. Hidrólisis de la muestra en disolución para transformar azúcares no

reductores en azúcares reductores.
2. Eliminación de todas las materias reductoras distintas de los azúcares que
podrían interferir en el análisis por defecación.
3. Alcalinización.
4. Reacción entre la disolución de azúcares totales con una disolución de sal
cúprica a alta temperatura, formándose óxido cuproso.
5. Reacción entre el óxido cuproso y sulfato férrico en disolución ácida, con
formación de la sal ferrosa equivalente.
6. Valoración de la sal ferrosa formada con permanganato potásico de
normalidad conocida.

AZÚCARES REDUCTORES

Todos los monosacáridos son azúcares reductores. Todos los disacáridos también los
son, excepto la sacarosa que perdió ese carácter debido a la condensación del enlace
glucosídico entre los dos carbonos anomérico donde recaían su grupo carboxilo libre.
De modo que los monosacáridos de interés biológico como la glucosa, fructosa, ribosa,
arabinosa, xilosa, galactosa, son reductores, al igual que los disacáridos lactosa,
maltosa, azúcar invertido.

MATERIALES.

Instrumentos Reactivos/Insumos Equipos

 Balón aforado de  Solución de Ferrocianuro de potasio  Centrifugadora.

250 ml. al 15%.  Plancha de
 Pipetas graduadas  Solución de Acetato de Zinc al calentamiento
de 2 y 5 ml. 30%.
 Embudo y soporte  Sulfato Cúprico.
para embudo  Solución alcalina de Sal de
 Papel de filtro. Seignette.
 Beaker de 50 y 100  Solución de Sulfato Férrico,
ml. Fe2(SO4)3.9H20 caliente.
 Tubos de ensayo.  Solución de Permanganato de
 Bureta Potasio al 0,1 N.
 Cilindro graduado  Agua destilada.
 Muestras de alimentos (*): leche
cruda.
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(*): Debe traer alguna de las muestras especificadas el día de la práctica

PROCEDIMIENTO.

Tomar 25 ml de leche fresca y colocarlos en un balón aforado de 250 ml.

Se le agregan 2,5ml de ferrocianuro de potasio al 15% y 2,5ml de acetato de zinc al

30% para precipitar la muestra. Luego se completa con agua destilada hasta el aforo.

La muestra se agita y se deja en reposo durante 15 min., se filtra empleando un papel

de filtro Whatman # 4 procurando que el filtrado quede lo más transparente posible.

Se toman 25 ml del filtrado y se coloca en un vaso de precipitado de 500 ml, en

donde se le adicionan 25 ml de la solución de sulfato cúprico y 25 ml de la solución
alcalina (Saignette).

Llevar dentro de la campana y agregar un magneto al fondo de la mezcla, montarlo

sobre una plancha de calentamiento y sujetar el vaso de precipitado a un soporte
universal, encender la plancha colocando las perillas en stir (agitación) y en Heat
(calor), se deja hervir la mezcla por 5 minutos, se deja enfriar y se mantiene en
reposo hasta que se forme un precipitado rojo de óxido cuproso.

Distribuir uniformemente la mezcla anterior en varios tubos de ensayo para

centrifuga, introducirlos en la centrifugadora por 5 minutos cuidando de que ésta
quede perfectamente balanceada.

Al concluir la centrifugación, saque los tubos, descarte el sobrenadante y disuelva el

precipitado de Cu2O de cada tubo con una solución ácida de sulfato férrico caliente
(bajo campana). El precipitado disuelto agréguelo a una fiola de 250 ml de capacidad.

Titular la solución de color verde mar con la solución de KMnO4, (Permanganato de

potasio, 0,1N) hasta la aparición de un color rojo persistente por 10 segundos al
menos.
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CÁLCULOS.

Cálculo del % de azúcar reductor en la muestra:

Factor de equivalencia: 1 ml de KMnO4 equivalen a 6,32mg de Cobre.

1ml KMnO4 6,32 mg de Cu Resolver Regla

Volumen KMnO4 gastados en su Titulación (ml) “A” mg de Cu de 3 simples

“A” mg de Cu equivalentes a AR “B” mg de Azúcar

(Conocido, calculo anterior) (Ver e interpolar o extrapolar su valor en

Tabla 1)
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Tabla 1.- Azúcares Reductores en base al Cobre (Bertrand).

mg de Cu equivalentes a AR: mg de Cu equivalentes a AR: mg de Cu equivalentes a AR:
(A) (A) (A) mg de
mg de mg de Azúcar
Lactosa Lactosa
Azúcar Azúcar Lactosa (B)
(A) (A)
(B) (B)
14,4 10 55,4 40 94,1 70
15,8 11 56,7 41 95,4 71
17,2 12 58,9 42 96,9 72
18,6 13 59,3 43 98,0 73
20,8 14 60,6 44 99,1 74
21,4 15 61,9 45 100,4 75
22,8 16 63,3 46 101,7 76
24,2 17 64,6 47 102,9 77
25,6 18 65,9 48 104,2 78
27,6 19 67,2 49 105,4 79
28,4 20 68,5 50 106,7 80
29,8 21 68,8 51 107,9 81
31,1 22 71,1 52 109,2 82
32,5 23 72,4 53 110,4 83
33,9 24 73,7 54 111,7 84
35,2 25 74,9 55 112,9 85
36,6 26 76,2 56 114,1 86
38,8 27 77,5 57 115,4 87
39,4 28 78,8 58 116,6 88
40,7 29 80,1 59 117,9 89
42,1 30 81,4 60 119,1 90
43,4 31 82,7 61 120,3 91
44,8 32 83,9 62 121,0 92
46,1 33 85,2 63 122,8 93
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47,1 34 86,5 64 124,6 94

48,7 35 87,7 65 125,2 95
50,1 36 89,9 66 126,5 96
51,4 37 90,3 67 127,7 97
52,7 38 91,6 68 128,9 98
54,1 39 92,8 69 130,2 99
131,4 100
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El cálculo estará basado en un volumen de muestra de 2,5ml (25 ml de muestra aforados en un

balón de 250ml, se toman 25 ml del filtrado).

25 𝑚𝑙 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
× 25 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = 2,5 𝑚𝑙 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
250 𝑚𝑙 𝑆𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

2,5 ml muestra “B” grs Azúcar (lactosa)

(Conocido, es el mismo valor “B” encontrado en la Tabla 1

convertido a grs)

100 ml muestra grs AR en muestra

𝒈𝒓 𝑩 × 𝟏𝟎𝟎
𝑨𝑹 ( )=
𝟏𝟎𝟎𝒎𝒍) 𝟐, 𝟓

OBSERVACIÓN: Es posible que los valores “A” de la Tabla 1, vayan más allá del valor máximo
presentado en ésta (131,4 mg Cu), en ese caso, debe hacer una extrapolación empleando los
dos últimos valores mostrado y el 3º valor el resultado de su operación. En caso contrario,
cuando el valor “A” encontrado es menor al máximo mostrado en la Tabla, pero aún así no
concuerda con ninguno de los presentado en ella, debe hacer una interpolación, utilizando los
valores más próximos por exceso y por defecto al valor determinado en su operación. Consulte
con su profesor para hacer estas operaciones.
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HOJA DE REPORTE DE RESULTADOS.

FECHA PRÁCTICA Nº EQUIPO Nº INTEGRANTES

Muestra (Tipo de Leche):

Volumen KMnO4 gastado en la Titulación (ml)

POST-LABORATORIO
El Informe de Práctica en digital debe contener:

1. Portada.
2. Breve Introducción.
3. Hoja de reporte de resultados.
4. Análisis de resultado. Es importante basar su análisis en la composición de lactosa
teórica (según fuentes bibliográficas) que posee la leche utilizada y compararlo con el
resultado obtenido en el laboratorio.
5. Conclusiones: La cual debe reflejar el aprendizaje obtenido, la importancia de los
métodos y técnicas instrumentales aplicadas, y los resultados obtenidos.
6. Anexo: Responda a las siguientes preguntas:
6.1 Muestre la estructura de la lactosa en: a) Fórmula de proyección de Fisher, b)
fórmula cíclica de Hawort.
6.2 Investigue la reacción química REDOX que ocurre entre la lactosa y el sulfato
cúprico.

REFERENCIAS A CONSULTAR.

Bohinski, R. (1991) Bioquímica 5ª Edición. Pearson Educación. México.

Nelson, D. y Cox, M. (2014). Principios de Bioquímica de Lenhinger 6º Edición (versión

portuguesa). ARMET editora LDTA, Porto Alegre.

Murray, R., Bender, D., Botham, K., Kenelly, P., Rodwell, V. y Weil, P. Harper Bioquímica

Ilustrada. 29ª Edición . Mc Graw-Hill Interamericana Editores, México.

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MANUAL DE PRÁCTICAS
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA II

TEMA: AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS.

TÍTULO:

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE MUESTRAS

ANIMALES

INTRODUCCION.

Las proteínas son biopolímeros de alto peso molecular compuestas básicamente de cuatro
elementos: C-H-O-N. A su vez, ellas están compuestas por cadenas de residuos de veinte
aminoácidos (la mitad de ellos esenciales), con múltiples propiedades físico-químicas y
biológicas. Las proteínas cumplen funciones estructurales, de transporte, regulación,
locomotoras, catalizadoras, entre muchas otras, por ello se las encuentras ampliamente
diseminadas en los tejidos animales y vegetales: la piel, la sangre, las hormonas, las células,
entre otras.
Las reacciones químicas de los aminoácidos son numerosas debido a los diferentes grupos
reactivos presentes en la misma molécula. Los aminoácidos alifáticos, mono-amino, mono-
carboxílicos, dan todas las reacciones esperadas para los grupos carboxílicos y aminos. Otros
aminoácidos dan estas mismas reacciones, además de aquellas reacciones características
debidas a grupos adicionales que puedan estar presentes. Por ejemplo, la Tirosina da
reacciones características de grupos fenólicos, la Cisteína da reacciones de grupos sulfidrilo
(SH-), etc. Algunas de estas reacciones pueden ser detectadas colorimétricamente, ayudando
al reconocimiento de aminoácidos en forma libre o combinados y la determinación cuantitativa
de aminoácidos y proteínas.

OBJETIVOS.

OBJETIVO GENERAL
Aislar proteínas mediante técnicas de precipitación con sales, para identificar su composición
en aminoácidos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Obtener una solución de proteína a base de suero sanguíneo o de clara de huevo.
2. Separar y aislar proteínas mediante reacciones de precipitación.
3. Reconocer grupos de aminoácidos mediante distintas reacciones de coloración a las
proteínas aisladas.

FUNDAMENTOS TEÓRICO-PRÁCTICOS.
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PROTEÍNAS
Las proteínas son los componentes más importantes de las células de todos los tejidos
animales. Ellas desempeñan diferentes funciones en el organismo, actúan como material
estructural fundamental en la célula, catalizan todas las reacciones del metabolismo en los
tejidos (enzimas, hormonas), desempeñan el papel inmunitario (anticuerpos), junto con los
ácidos nucleicos participan en la transmisión de la información genética, producen energía al
oxidarse los aminoácidos, entre otras funciones.

De las células, tejidos y órganos de los animales, las plantas y los microorganismos fueron
aisladas muchas proteínas con diferente constitución estructural, propiedades físico-químicas
y biológicas.

MÉTODOS DE SEPARACIÓN Y AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS

Para separar las moléculas, el bioquímico aprovecha las diferencias que existen entre ellas,
tales diferencias pueden ser de solubilidad, tamaño, carga eléctrica o afinidad por otras
moléculas.

EFECTO DE LAS SALES EN LA SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS

La definición de una sal indica que es un electrolito fuerte, que se disocia fácilmente en agua
donde es altamente soluble, y que no cambia apreciablemente el pH de sus soluciones. Son dos
los efectos de añadir sales a una solución de proteínas: se producen interacciones
electrostáticas de las sales con los residuos de aminoácidos cargados que en general se
considera que estabilizan el plegamiento original de la molécula cuando se encuentran en bajas
concentraciones, lo cual es lógico si se considera que las enzimas y proteínas en los organismos
se encuentran rodeadas de un ambiente con concentración salina fisiológica. Cuando se trata
de concentraciones más altas (. 1M) el segundo efecto sobresale, y depende de la naturaleza
de la sal en cuestión, ya que de acuerdo con las series liotrópicas o caotrópicas de Hofmeister,
sales como Na2SO4 y NaF mejoran la estabilidad estructural de las proteínas mientras que
sales como NaSCN y NaClO4 la debilitan. El mecanismo consiste en que los diferentes iones
logran estructurar en mayor o en menor grado a las moléculas de agua a su alrededor,
causando una interacción indirecta con la proteína. Por lo tanto, la conformación
tridimensional. de las proteínas y su estabilidad se ve influida no sólo por la concentración,
sino por la clase de iones presentes y de hecho, son los aniones los que tienen una mayor
influencia que los cationes (Badui, 2006)

ALBÚMINAS Y GLOBULINAS

Las globulinas son un grupo de proteínas solubles en agua, solubles en disoluciones salinas, que
se encuentran en todos los animales y vegetales. Entre las globulinas más importantes
destacan las seroglobulinas (de la sangre), las lactoglobulinas (de la leche), las ovoglobulinas
(del huevo), la legúmina, el fibrinógeno, las inmunoglobulinas (anticuerpo) y numerosas
proteínas de las semillas.
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Por su parte, la albúmina es una proteína que se encuentra en gran proporción en el plasma
sanguíneo, siendo la principal proteína de la sangre, y una de las más abundantes en los
animales.

SANGRE: Distinción entre suero y plasma

La sangre representa un líquido no transparente de color rojo, con pH ligeramente alcalino
(7,3-7,5), densidad 1050-1060 gr/Lt, de olor metaloide y sabor un poco salado. En los animales
la cantidad de sangre constituye en promedio un 10% de la masa del cuerpo. La sangre se
compone del plasma (50-55%) y los elementos: eritrocitos, leucocitos y trombocitos (45-50%).
en la composición de la sangre entran proteínas, grasas, carbohidratos, diferentes productos
intermediarios y finales del metabolismo, hormonas, vitaminas y sales minerales. De los
animales grandes la sangre se toma, comúnmente, con aguja desde la vena yugular, de los
cerdos, desde la del rabo, de las aves desde la vena auxiliar, de los conejos desde la vena
auricular. Cuando se realiza un examen de bioquímica sanguínea a un animal, se extrae una
muestra de la cual se analizará la sangre completa como tal, el plasma o el suero.
El plasma es la fracción acelular de la sangre. Se obtiene al dejar a la sangre desprovista de
células como los glóbulos rojos y los glóbulos blancos. Está compuesto por un 90 % de agua, un
7 % de proteínas, y el 3 % restante por grasa, glucosa, vitaminas, hormonas, oxígeno, dióxido
de carbono y nitrógeno, además de productos de desecho del metabolismo como el ácido úrico

El suero sanguíneo o suero hemático es el componente de la sangre resultante tras permitir

la coagulación de ésta y eliminar el coágulo resultante. Es equivalente al plasma sanguíneo, pero
sin las proteínas involucradas en la coagulación (fibrinógeno en su mayor parte). El suero es
útil en la identificación de algunos analitos en los que no se requiere de la intervención de un
anticoagulante, ya que este podría interferir en el resultado alterándolo.

Suero

REACCION DE BIURET

El amoníaco y sus derivados, incluyendo los aminoácidos, forman iones complejos con Cu ++ y
otros iones metálicos. Además de los complejos de Cu++ con aminoácidos, existen complejos
más complicados a base de Cu++, péptidos y proteínas, en los cuales el Cu++ se une a varios
grupos del péptido.
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Estos complejos aparecen de manera especial en soluciones alcalinas, y muestran un color rojo
o violeta, muy distintos a los complejos azules simples de tipo amonio y Cobre.

REACCIONES DE AMINOACIDOS ESPECIFICOS.

Algunas de las reacciones de coloración dadas por aminoácidos particulares son usadas
comúnmente como instrumento analítico. Estas reacciones también las presentan la mayoría de
las proteínas y ayudan en su identificación y determinación.

a) Reacción de Sakaguchi: Guanadinas en solución alcalina dan un color rojo con el

reactivo que contiene Alfa-naftol e Hipoclorito de Sodio. Esta reacción da positiva
para Arginina y proteínas que contenga este aminoácido.

b) Reaccion de Erlich: La presencia de anillos aromáticos fenólicos o nitrogenados en

la cadena lateral de los Aminoácidos se puede identificar mediante la reacción con
ácido sulfanílico y nitrito de Sodio por formación de sales de Diazonio fuertemente
coloreadas permitiendo así detectar la presencia de Tirosina e Histidina libres o
formando péptidos y proteínas.

c) Reacción de Kovac o Hopkin-Cole: El Triptófano con ácido glioxílico en ácido

acético y después ácido sulfúrico concentrado dan un color violeta.

d) Reacción Xantoproteíca: Cuando se trata de una solución ácida de Tirosina con

ácido Nítrico concentrado, se forma un precipitado blanco que al calentarlo se
transforma en amarillo; la adición de álcalis intensifica apreciablemente el color.
La prueba es positiva para aquellos aminoácidos o proteínas que contengan en su
molécula, grupos fenilos, con la posición 3, 5, libre.

e) Reacción de Aminoácidos Azufrados: Para determinar la presencia del grupo tiol,

y por tanto, la identificación de un aminoácido azufrado, existen pruebas, por
ejemplo el tratamiento con álcalis y calor, para lograr la ruptura del enlace tiol
quedando libre el azufre, que se precipita al añadir una sal de plomo.

MATERIALES.

Instrumentos Reactivos Equipos

 Gradilla con  Suero de sangre animal o disolución  Manta o plancha

tubos de ensayo. de clara de huevo. (*) de
 Vasos de  Agua (*) calentamiento.
precipitado de  Cloro (*)
 Centrifugadora
50 ml.  Solución al 1% de aminoácidos y
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 Cilindro proteína: ácido

graduado 10 ml. Glutámico/Cisteína/Arginina/
 Embudo con Tripófano/Tirosina/Caseína/
papel de filtro. Albúmina.
 Gasas  Sulfato de amonio [(NH4)2SO4].
 Guantes de látex  Cloruro de sodio (NaCl).
 Cloruro de amonio (NH4Cl).
 Sulfato de sodio (Na2SO4).
 Cloruro de potasio (KCl)
 NaOH 2,5 M.
 NaOH al 20%.
 CuSO4 al 1%.
 HNO3 concentrado.
 Solución de fenol al 0,05%.
 H2SO4 concentrado.
 Acetato de Plomo al 5%.
 Hipoclorito al 0,5%.
 Reactivo de Kovac o Hopkin-Cole.
 Solución de Alfa-naftol al 0,04%
en etanol.
 Reactivo de Erlich: Acido
sulfanílico al 0,5%, Nitrito de
Sodio al 0,5%, Hidróxido de
Amonio al 10%.
(*): Cada equipo debe elegir las muestras a llevar: Si es sangre animal, esta debe ser
recolectada SIN ANTICOAGULANTE en un tubo de ensayo, y como se trata de un fluido
biológico, debe manipularlo con guantes durante la realización de la práctica. Por otra parte, si
va a trabajar con la clara de huevo, debe llevar adicional a esta aprox. 150 grs de sal común
doméstica y 1/2 de litro de agua potable y gasas para filtrar
(**): Debe llevar tirro para identificar todos los tubos de ensayo que va a emplear en la
práctica.
(***): Debe llevar cloro normal (no jabonoso) para lavar y desinfectar el material al cierre de
la práctica.

PROCEDIMIENTOS (Realice, a partir de los siguientes procedimientos, el flujograma

correspondiente).

I PARTE: OBTENCIÓN DE LA SOLUCIÓN DE PROTEÍNA A PARTIR DE UNA MUESTRA

ANIMAL:

Posibles Muestras: sangre animal, ó clara de huevo (Cada equipo debe seleccionar y llevar
cualquiera de estas dos muestras el día de la práctica)
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En caso de sangre: La sangre se toma en ayunas, en un tubo de ensayo seco y estéril SIN
ANITICOAGULANTE. Si es tomada el día antes de la práctica, almacene el tubo de ensayo en
refrigeración. Si es tomada el día de la práctica, llévela así a temperatura ambiente al
laboratorio.
Obtención del suero sanguíneo: Coloque el tubo de ensayo en la centrifugadora, luego
centrifugue el tubo de ensayo a máxima r.p.m por 5 minutos. Separe el suero del coágulo, por
simple decantación. Rotule como suero sanguíneo.

En caso de clara de huevo: Se emplean un (1) huevo de gallina. Obtenga la clara separándola
de la yema.
Preparación de la disolución de la clara: En un beaker de 500 ml mezclar la clara con 233 ml
de agua potable y agregar 100 ml de NaCl saturado. Luego monte un sistema de filtrado
empleando doble capa de gasa en el embudo. Rotule esta solución como solución diluida de
clara de huevo.
Preparación de la solución de NaCl saturado: Agregue 100 ml de agua potable en un beaker y
agregue sal común hasta que evidencie que ya no hay disolución al agregar la sal, en este punto
se obtiene la saturación de la solución.

II PARTE: AISLAMIENTO Y SEPARACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL SUERO

SANGUÍNEO O DE LA CLARA DEL HUEVO.

En un tubo de ensayo, vertir 2-3 ml del suero de sangre o de la solución diluida de la clara de
huevo preparada previamente como se indicó en la PARTE I

Añadir igual volumen de disolución saturada de la sal de precipitación [(NH4)2SO4, NaCl,

NH4Cl, Na2SO4, ó KCl]

Agitar

Dejar en reposo por 10 minutos, luego centrifugar el contenido de los tubos de ensayo

Observará que en el sobrenadante quedan las albúminas, y en el fondo del tubo, las globulinas

Precipite las albúminas de la siguiente manera:
Vierta el contenido del sobrenadante en un vaso
de precipitado de 50 ml
Agregar al sobrenadante unos cristales de
Sulfato de Amonio hasta que evidencie la
saturación completa, es decir, se forme un
precipitado no soluble en el fondo del vaso
Vierta la mezcla anterior en un tubo de ensayo
para centrifuga.
Centrifugar nuevamente a máxima velocidad por 5
minutos.
Nuevamente obtendrá: el sobrenadante y el
precipitado
Nuevamente obtendrá: el sobrenadante y el
precipitado
III PARTE: REACCIONES DE COLORACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS
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Diluya las globulinas de la siguiente manera:
Agregue 8 ml de solución de NaCl 0,5% p/v
Agitar
Filtrar y recoger el filtrado en otro tubo de
ensayo
Rotule como: Disolución de globulina
Realice todas las Reacciones de coloración de
aminoácidos y proteínas, descritas en la parte III
Sobrenadante: Con 2-3 ml del
de la práctica
sobrenadante realice la reacción de
Biuret. Si diera negativa indica que la
precipitación fue completa.
Precipitado: Agregue al precipitado 8 ml
de agua destilada
Agitar
Filtrar y recoger el filtrado en otro
tubo de ensayo
Rotule como: Disolución de Albúmina
Realice todas las Reacciones de
coloración de aminoácidos y proteínas,
descritas en la parte III de la
práctica
 10

a) Experimento 1: Reacción de Biuret (Diferencia aminoácidos de proteínas).

Tome dos tubos de ensayos e identifíquelos. Al primer tubo añada 1ml de la disolución
de albúmina, y al segundo tubo 1 ml la disolución de globulina, obtenidos previamente en
la PARTE II. A cada tubo se le agrega 5 gotas de NaOH 2,5 M más tres gotas de
CuSO4 al 1%.

Resultado: Una coloración violeta indica presencia de proteínas (+ para proteínas). Una
coloración azul indica presencia de aminoácidos (+ para aminoácidos).

b) Experimento 2: Reacción Xantoprotéica (Identifica Tirosina).

Tome dos tubos de ensayos e identifíquelos. Al primer tubo añada 1ml de la disolución
de albúmina, y al segundo tubo 1 ml de la disolución de globulina. A cada tubo se le
agrega 10 gotas de HNO3 conc. Mezcle bien. Caliente en baño de María los dos tubos
hasta ebullición. Sáquelos del baño de María y añada inmediatamente 4 ml de NaOH al
20%.
Resultado: La aparición de un color en amarillento indica presencia de Tirosina.

c) Experimento 3: Reacción de Kovac o Hopkin-Cole (Identifica Triptófano).

Tome dos tubos de ensayos e identifíquelos. Al primer tubo añada 1ml de la disolución
de albúmina, y al segundo tubo 1 ml de la disolución de globulina. A cada tubo se le
agregan 5 gotas de Reactivo de Kovac. Mezcle bien. Bajo campana, y empleando una
bureta, darle a los tubos de ensayo una inclinación de 45 grados y deje caer al fondo
por las paredes del tubo 2 ml de ácido sulfúrico concentrado. NO AGITE. Se busca la
formación de un anillo en la interfase.

Resultado: La formación de un anillo color violeta en la interfase indica la presencia de

Triptófano.

d) Experimento 4: Reacción de Aminoácidos Azufrados (Identifica cisteína y

metionina).Tome dos tubos de ensayos e identifíquelos. Al primer tubo añada 1ml de la
disolución de albúmina, y al segundo tubo 1 ml de la disolución de globulina. A cada tubo
se le agrega 2 ml de NaOH 2,5N. Mezcle bien. Coloque en Baño de María hirviente por
5 minutos. Sacar del Baño de María y Agregar 5 gotas de Acetato de Plomo (CH3-COO-
Pb). Caliente nuevamente en Baño de maría por otros 20 minutos.

Resultado: Un precipitado de color gris indica la presencia de un aminoácido azufrado

(cisteína y/o metionina).

e) Experimento 5: Reacción de Sakaguchi (Identifica Arginina)

Tome dos tubos de ensayos e identifíquelos. Al primer tubo añada 1ml de la disolución
de albúmina, y al segundo tubo 1 ml de la disolución de globulina. A cada tubo se le
agrega 5 gotas de NaOH 2,5N. Añada 4 gotas de alfa-naftol 0,04% y 1ml de la solución
de hipoclorito. Observe y anote.
 11

Resultado: La formación de un color rojo o rosado indica la presencia de arginina

(grupo guanidina).

f) Experimento 6: Reacción de Erlich (Identifica Tirosina e Histidina): Se toman dos

tubos de ensayo, rotulados como albúmina, y globulina. Agregue a cada tubo en el
siguiente orden: 1 ml de acido sulfanílico 0,5%, 1 ml de nitrito de sodio, mezcle bien y
deje en reposo 15 minutos, luego a cada tubo agregue 1ml de la solución
correspondiente al rotulo, mezcle y adicione a cada tubo 0,5ml de Hidróxido de
Amonio 10%, observe y anote.

Resultado: Cambio a color naranja indica la presencia de Tirosina e Histidina.

HOJA DE REPORTE DE RESULTADOS

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FECHA PRÁCTICA Nº EQUIPO Nº INTEGRANTES

I).- I PARTE: OBTENCIÓN DE LA SOLUCIÓN DE PROTEÍNA A PARTIR DE UNA

MUESTRA ANIMAL:
Indique la muestra de origen animal que utilizó:_______________________________

III).- REACCIONES DE COLORACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

Reacción Tubo 1 Tubo 2

Solución de + ó - Solución de + ó -
__________ __________

Biuret Color: Color:

Xantoproteíca

Erlich

Kovac o Hopkin Cole

Aminoácidos Azufrados

Sakaguchi

POST-LABORATORIO
El Informe de Práctica en digital debe contener:

7. Portada.
8. Breve Introducción.
9. Hoja de reporte de resultados.
10. Análisis de resultado por experimento. Es importante basar su análisis en la
composición de aminoácidos de las dos proteínas aisladas en su experimento.
11. Conclusiones: La cual debe reflejar el aprendizaje obtenido, la importancia de los
métodos y técnicas instrumentales aplicadas, y los resultados obtenidos.
12. Anexo (Opcional)

REFERENCIAS A CONSULTAR.

Bohinski, R. (1991) Bioquímica 5ª Edición. Pearson Educación. México.

 13

Nelson, D. y Cox, M. (2014). Principios de Bioquímica de Lenhinger 6º Edición (versión

portuguesa). ARMET editora LDTA, Porto Alegre.

Murray, R., Bender, D., Botham, K., Kenelly, P., Rodwell, V. y Weil, P. Harper Bioquímica
Ilustrada. 29ª Edición . Mc Graw-Hill Interamericana Editores, México.