UNIVERSIDAD ANDINA DEL CUSCO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

Escuela Profesional de Medicina Humana
LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
Dr. Juvenal Hernán Paiva Palomino

GUÍA DE PRÁCTICAS
LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

CUSCO-PERU
2023
 UNIVERSIDAD ANDINA DEL CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
Escuela Profesional de Medicina Humana
LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
Dr. Juvenal Hernán Paiva Palomino

PREFACIO

La Biología Molecular es una disciplina que desentraña los secretos de la vida a nivel molecular;
como un fascinante viaje hacia el corazón mismo de la vida y se erige como un pilar fundamental
en la preparación académica de los futuros profesionales de la salud.

En el ámbito de la medicina, el conocimiento de la biología molecular es esencial para

comprender las bases moleculares de diversas patologías y para desarrollar tratamientos más
precisos y eficaces. A través de las prácticas detalladas en esta guía, los estudiantes tendrán la
oportunidad de aplicar conceptos teóricos en un entorno práctico, fortaleciendo así su capacidad
para abordar los desafíos médicos de este siglo.

Esta guía de práctica no solo es un recurso educativo, sino también una carta de bienvenida a
una comunidad universitaria comprometida con la excelencia académica y el avance de la
medicina. A medida que los estudiantes se sumergen en las actividades experimentales aquí
presentadas, no solo enriquecerán sus propias mentes, sino que también contribuirán al
enriquecimiento colectivo de nuestro entorno educativo y, en última instancia, a la sociedad en
general.

Nuestra esperanza es que esta guía no solo sea una herramienta educativa, sino también una
fuente de inspiración para todos los futuros profesionales médicos que buscan explorar y
comprender los aspectos más profundos de la biología molecular. A medida que se adentren en
las técnicas de biología molecular podrán comprender de mejor manera como han revolucionado
la medicina, permitiendo diagnósticos más precisos, terapias personalizadas y avances en la
investigación de enfermedades.

Bienvenidos a la Guía de Práctica de Biología Molecular para Estudiantes de Medicina Humana:

un viaje hacia la comprensión profunda y la excelencia médica.

Dr. Juvenal H. Paiva Palomino

 UNIVERSIDAD ANDINA DEL CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
Escuela Profesional de Medicina Humana
LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
Dr. Juvenal Hernán Paiva Palomino

PRÁCTICA N° 07

Nombres y Apellidos: …………………………………………………………………………………………….

Código: ………………………………………………………………………………………………………………….
Grupo y Horario: ……………………………………………………………………………………………………

CUALIFICACIÓN DE ADN

I. INTRODUCCIÓN:

Cualificación o calificación

Se refiere a la evaluación de la calidad o integridad del ADN en una muestra. Esto implica
determinar si el ADN está en buenas condiciones para su uso en experimentos posteriores. La
calificación del ADN puede implicar la evaluación de la integridad de las cadenas de ADN
(principalmente si están degradadas) o la detección de contaminantes que podrían afectar los
resultados de los experimentos.

Para llevar a cabo la calificación de ADN, se pueden utilizar diferentes técnicas, como la
electroforesis en gel, que puede mostrar la integridad del ADN al observar el patrón de bandas
en el gel, o la evaluación de la relación A260/A280 mediante espectrofotometría para
determinar si hay contaminantes presentes.

Electroforesis
La electroforesis es un término general que se refiere a la técnica de separación o
caracterización de moléculas cargadas eléctricamente con base en sus tasas específicas de
migración en un campo eléctrico. El proceso es generalmente realizado en una matriz porosa,
de modo que las macromoléculas puedan migrar diferencialmente de acuerdo con sus
propiedades físicas y a su peso molecular.
La matriz comúnmente usada para la separación de moléculas de ADN con tamaños entre 100
pb y 30 Kb es la agarosa.

Agarosa
La agarosa es una polisacárido constituido por unidades repetidas de una molécula llamada
agarobiosa. Este material se extrae en general de las algas marinas y es usada en biología
molecular para la separación de moléculas, especialmente ADN por electroforesis como se
mencionó previamente.
La agarosa cumple la función de matriz a través de la cual, las moléculas, en este caso de ADN,
se mueven con velocidades diferentes, inversamente proporcionales a su tamaño; es decir, que
 UNIVERSIDAD ANDINA DEL CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
Escuela Profesional de Medicina Humana
LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
Dr. Juvenal Hernán Paiva Palomino

cuanto más pequeña es la molécula, mayor será la distancia que ella recorra en un determinado
periodo de tiempo.
Los fragmentos de ADN que tiene carga eléctrica negativa, conferida por la ionización de sus
grupos fosfato, migran en dirección al polo positivo. Después de la migración electroforética,
todas las moléculas de ADN del mismo tamaño quedan agrupadas en una determinada región
del gel y son visualizadas como una banda (Figura 1)

Figura 1: Bandas de ADN genómico corridas en un gel de agarosa al 0,7%.

El procedimiento puede dividirse en cuatro etapas:

1. Preparación del gel

2. Aplicación de las muestras,
3. Electroforesis
4. Análisis de los fragmentos separados.

La concentración de agarosa en la preparación del gel es seleccionada en función del tamaño de

los fragmentos que se desea separar. Podemos seguir las siguiente relación que se muestra en
la tabla 1.
 UNIVERSIDAD ANDINA DEL CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
Escuela Profesional de Medicina Humana
LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
Dr. Juvenal Hernán Paiva Palomino

Tabla 1. Relación entre la concentración de agarosa y el rango de separación en tamaño

molecular del ADN.
Concentración de Agarosa (%) Rango de separación de
moleculas lineales de ADN (kb)
0,3-0,4 5,0 – 60,0
0,5-0,6 1,0- 20,0
0,7-0,8 0,8-10,0
0,9-1 0,5-7,0
1,2 0,4-6,0
1,5 0,2-3,0
2 0,1-2,0

Modificado de Puerta y Urueña, 2005.

Monitoreo de la electroforesis

Cuando la corriente está pasando por la cámara de electroforesis es la presencia de burbujas de

hidrógeno que se forman en el electrodo negativo y el gas oxígeno que surge a partir del
electrodo positivo (productos de la electrólisis del agua). Por otro lado, podremos verificar que
los colorantes del tampón de aplicación (buffer loading) ya están migrando a través del gel, en
dirección al polo positivo. La banda que se mueve más rápidamente es la del colorante azul de
bromofenol, de color más azulada, la banda que se mueve más lenta es la del xileno-cianol (más
verdosa).

Tratamiento con bromuro de etidio y cuidados de manipulación

El bromuro de etidio es un reactivo mutagénico potente y por tanto un serio candidato a ser un
compuesto carcinogénico.

Sin embargo, sigue siendo uno d elos tratamientos más utilizados, más rápido, práctico,
sensible y reproducible de detectar ADN en geles de agarosa. Ese agente se intercala entre las
bases de los ácidos nucleicos, fluoresce en naranja (590 nm) cuando es iluminado con luz
ultravioleta (260 a 360 nm). Los protocolos de este curso que manipulan el bromuro de etidio
serán realizados por el docente responsable, en áreas especialmente reservadas para este
procedimiento. El bromuro de etidio puede ser adicionado cuando la agarosa está en el
erlenmeyer en proceso de enfriamiento, puede ser adicionado al tampón de electroforesis
cuando está corriendo o el gel puede ser tratado posterior a la corrida electroforética en un
recipiente separado.

Manipulación y descontaminación del bromuro de etidio

 UNIVERSIDAD ANDINA DEL CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
Escuela Profesional de Medicina Humana
LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
Dr. Juvenal Hernán Paiva Palomino

- Siempre use guantes de nitrilo libres de talco.

- Limite el uso del bromuro de etidio a una región del laboratorio reservada
especialmente para ese fin.
- Después de la coloración del gel use un embudo para descartar la solución de bromuro
de etidio en un recipiente oscuro para descarte.
- Geles tratados y soluciones usadas deben ser manipuladas de acuerdo con protocolos
especiales de descontaminación.

Indicaciones de peligro :

H302: Nocivo en caso de ingestión

H330: Mortal en caso de inhalación
H341: Se sospecha que provoca defectos genéticos

Visualización de los geles tratados con soluciones intercalantes

La visualización de los geles de agarosa depende de la transiluminación con luz ultravioleta, ya

que el bromuro de etidio fluoresce cuando se somete a una luz ultravioleta de longitud de onda
entre 260 a 360 nm.

Fotografía de los geles

Las fotografías obtenidas a partir de los geles de agarosa son muy importantes como registro de
experimentos realizados e indispensables para la interpretación posterior de los mismos. A
veces las fotografías con grandes períodos de exposición consiguen registrar señales muy
débiles o invisibles al ojo humano. Es indispensable tener cuidado con el tiempo de exposición,
pues exceso de tiempo puede inhibir la aparición de bandas, especialmente aquellas de menor
tamaño molecular.

Importancia de la integridad de los pozos en los geles de agarosa

 UNIVERSIDAD ANDINA DEL CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
Escuela Profesional de Medicina Humana
LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
Dr. Juvenal Hernán Paiva Palomino

Cualquier defecto causado en la forma de los pozos de los geles de agarosa durante el modelaje
del gel o durante la aplicación de las muestras, puede ser causa importante de problemas en la
electroforesis. Para que exista una buena definición de las bandas después de la migración, es
necesario que las moléculas de ADN del mismo tamaño entren en el gel exactamente en el
mismo tiempo. Cualquier factor que deforme la cara interna anterior del pozo y que saque esta
fase de la posición de perpendicularidad en relación al campo eléctrico va alterar el aspecto de
las bandas de ADN formadas. A continuación, se relacionan las principales fuentes de daños
causados a los pozos de aplicación y que causan deformaciones en las bandas de ADN:

• Introducir la punta de la micropipeta directamente dentro del carril puede causar

deformaciones en las paredes, además del riesgo de perforar el fondo del pozo.
• Los geles deben siempre estar sumergidos dentro del tampón en el momento de
aplicación de las muestras.
• Centralice la extremidad de la punta en el pozo y baje la punta hasta tocar la superficie
del tampón, lentamente expulse la muestra de la punta.
• Como el tampón de aplicación de las muestras tiene sacarosa o glicerol en su
composición, estas sustancias aumentan la densidad de la muestra y hacen que ella se
vaya al fondo del pozo.
• Torcer o balancear el peine en la hora de remoción puede deformar los pozos. Sostenga
firmemente el peine con las dos manos en el momento de retirarlo.
• Remover los peines antes que la agarosa se haya solidificado completamente también
deforma los pozos. No tenga prisa en elaborar un gel, es muy difícil distinguir
visualmente un gel casi solidificado de uno solidificado completamente.
• Suciedades o residuos de agarosa en un peine mal lavado también altera la forma de los
pozos. Inspeccione cada peine antes de usar y lávelos bien para remover cualquier
residuo de agarosa.

II. OBJETIVOS

Ø Determinar la calidad del ADN que ha sido obtenido mediante protocolos básicos
de extracción.
Ø Conocer el fundamento de la corrida electroforética.
Ø Adquirir destreza en la preparación de geles de agarosa.
Ø Adquirir destreza en la corrida electroforética de muestras de ADN en geles de
agarosa
Ø Conocer las características que determinan la calidad adecuada del ADN.
 UNIVERSIDAD ANDINA DEL CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
Escuela Profesional de Medicina Humana
LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
Dr. Juvenal Hernán Paiva Palomino

Materiales y Método
Equipos:
- pHmetro
- Micropipetas de diversos volumenes
- Balanza analítica
- Agitador magnético
- Estufa u horno microondas
- Cámara de electroforesis
- Fuente de poder
- Fotodocumentador o transiluminador
- Gafas de protección para luz ultravioleta
- Micropipetas

Reactivos y soluciones:
- Bromuro de etidio
- Azul de bromofenol (tampón colorante 6X),
- Buffer TAE 1X o TBE1X
- Buffer loading o buffer TEII con azul de bromofenol
- Marcador de peso molecular 1000pb
- Agua bidestilada
- Agua ultrapura
- Papel parafilm
- Tubos Ependorff 0,2 mL
- Tubos eppendorf de 1,5 mL
- Puntas de micropipeta (tips) estériles de 10µL; 200µL
- Erlenmeyer para preparación de agarosa Máscara y gorro de protección
- Guantes de nitrilo
- Frascos de descarte
Procedimiento para la preparación del gel de agarosa
Realizar los calculos para obtener un gel de agarosa al porcentaje elegido.
Pesar en la balanza analítica la cantidad adecuada agarosa (para biología molecular) necesaria
para tener una concentración de 0,8-1% para correr ADN genómico teniendo en cuenta que la
altura del gel debe ser de 1 cm.
 UNIVERSIDAD ANDINA DEL CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
Escuela Profesional de Medicina Humana
LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
Dr. Juvenal Hernán Paiva Palomino

1. Pesar la agarosa para la concentración de 1 % y adicionar tampón TAE 1X o TBE 1X en el

volumen deseado.
2. En un recipiente resistente a calor o Erlenmeyer, colocar la cantidad necesaria de TAE 1X
o TBE1X considerando el volumen final a utilizar (considerar que producto del
calentamiento puede haber perdida de volumen por evaloración) y colocar la cantidad
de agarosa ya pesada.
3. Disolver la mezcla en baño María, estufa o microondas hasta no observar grumos y
observar la solución de color transparente.
4. Dejar enfriar hasta que el gel alcance la temperatura aproximada de 50-60 °C, adicionar
5 μL de solución de bromuro de etidio o Sybr Safe (colocar la agarosa demasiado
caliente puede quebrar o fragmentar la cámara de electroforesis)
5. Preparar la bandeja de la cámara de electroforesis, verificando que este en una
superficie bien nivelada, posteriormente colocando el peine deseado.
6. Llenar la bandeja, evitando la formación de burbujas (dispersar la agarosa lentamente)
7. Dejar gelificar la agarosa

8. Cuando esté gelificado ( aproximadamente 45min-1hr) sacar el peine de manera firme y

vertical.
9. Llevar el gel de agarosa a la cuba de electroforesis.
Preparación de la muestra para electroforesis
1. Sobre papel parafina o tubos eppendorff de 0,2mL coloque 2 μL de agua ultra pura o
buffer TEII, 1 μL buffer loading y posteriormente, adicionar 2μL de ADN.
2. Homogenizar las muestras con cuidado por pipeteo y sembrar 5 μL de la mezcla
previamente preparada en el punto 1.
3. Llenar la cuba con buffer TAE 1X o TBE1X hasta cubrir completamente el gel.
Corrida electroforética
1. Posicionar los electrodos en la cámara de electroforesis de modo que el inicio de la
corrida este próximo al electrodo negativo (negro).
2. Encender la fuente de energía y seleccionar el voltaje y tiempo de corrida apropiado.
 UNIVERSIDAD ANDINA DEL CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
Escuela Profesional de Medicina Humana
LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
Dr. Juvenal Hernán Paiva Palomino

3. Realizar la corrida electroforética bajo una intensidad de corriente eléctrica apropiada

para la muestra en estudio (Máximo 5 V/cm), calcular el valor para la cámara a utilizarse
en esta práctica de laboratorio.
4. Después de la corrida apagar la fuente y remover los electrodos.
5. Retirar el gel de agarosa de la cámara de electroforesis, con mucho cuidado.
6. Llevar con cuidad el gel a un transiluminador o fotodocumentador y tomar la fotografía
usando la extensión tiff.
7. Limpiar cuidadosamente toda la superficie que estuvo en contacto con el bromuro de
etidio.
 UNIVERSIDAD ANDINA DEL CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
Escuela Profesional de Medicina Humana
LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
Dr. Juvenal Hernán Paiva Palomino

ANEXO:
Buffer TE II
10 mM Tris-HCl pH 7,5
0,1mM EDTA pH 8,0

Solución madre TAE (Tris-Acetato-EDTA) 50 X para un litro

Tris Base 242 g
Ácido acético glacial 57,1 mL
EDTA-Na2 pH=8,0. 100mL
Llevar a volumen con agua bidestilada

Solución madre TBE (Tris-Borato-EDTA) 10X para un litro

Tris Base 108 g

Ácido bórico 55 g
EDTA-Na2 0,5M pH=8,0. 40 mL aproximadamento 7,5g
Llevar a volumen con agua bidestilada

Buffer loading
azul de bromofenol 2,5 mg,
xylene cyanol FF 2,5mg
sucrosa 400 mg
Disolver en un mililitro de agua desionizada.
 UNIVERSIDAD ANDINA DEL CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
Escuela Profesional de Medicina Humana
LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
Dr. Juvenal Hernán Paiva Palomino

RESULTADOS Y CONCLUSIONES:

CUESTIONARIO:

1. ¿Por qué la matriz del gel de agarosa ofrece resistencia al paso de las
moléculas de ADN?

2. ¿Cómo se valor a la integridad y la concentración del ADN con esta técnica?

 UNIVERSIDAD ANDINA DEL CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
Escuela Profesional de Medicina Humana
LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
Dr. Juvenal Hernán Paiva Palomino

3. ¿Qué tipo de método es la electroforesis?

4. Por que se utiliza buffer TAE o buffer TBE?