Temario Paloma

Tema 1: Transferencia de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
TEMA 1: TRANSFERENCIA DE GENES
INTERES DE LOS ANIMALES

MODIFICADO GENÉTICAMENTE
Hay muchas cosas que no se pueden hacer

en humanos por lo que se investigan en
animales (= investigación básica) +
Biomedicina.
Xenotransplantes: Se usan cerdos para el

trasplante de órganos en humanos.
Específicamente en peces: puedo modificar

genes para conseguir peces que crecen más y
obtengan un mayor peso corporal. También
se pueden modificar características para que
sean resistentes a enfermedades. Se pueden
mejores desde el punto de vista
nutricional, se pueden usar los peces
como biorreactores. Se pueden realizar
modificaciones que hagan que los peces
asimilen mejor otros nutrientes para no
usar por ejemplo las harinas de pescado
(peces carnívoros) para minimizar el
impacto ambiental.
TECNOLOGÍA TRANSGÉNICA
Tecnología transgénica: Es lo primero que se aplicó desde el punto de vista clásico.

Objetivos principales de las tecnologías transgénicas:
Crecimiento
 Hormona del crecimiento
 Follistaina: otro tipo de gen que hace que los
individuos sean más grandes
Resistencia a enfermedades
 Cecropina
 Lactoferrina
 Lysozima-C3
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Tolerancia al frio: Ahora vuelve a estar de moda. Para poder incrementar los sitios donde se puede cultivar los peces más
cerca de los peces incorporando genes para proteínas anticongelantes así que aguanten temperaturas más bajas.
 Proteína anticongelante
Composición corporal
 B actina desaturasa
 Gen fat: hace que los individuos sean más gordos
Sabor
 DNA de camarones
Todas estas tecnologías transgénicas tienen muchos problemas en cuanto al tema de la comercialización porque no están
permitidas en todos los países.
HORMONA DEL CRECIMIENTO
Se introducen una H del crecimiento, incluso del mismo pez, para aumentar su crecimiento. Se consigue un incremento
del tamaño corporal.
Se ha trabajado sobre todo con:
 Trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss)
 Goldfish (Carassius auratus)
 Carpa (Cyprinus carpio)
 Tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus)
 Pez medaka (Oryzias latipes)
 Lucio (Exos lucius)
Salmón: se manipuló genéticamente para obtener un
crecimiento rápido introduciendo el gen de la
hormona de crecimiento bajo el control del
promotor del gen de proteína anticongelante del
abadejo y la región 3 'no traducida. Se necesita un
promotor muy fuerte que permite mucha expresión de la H del crecimiento.
Se consigue que los peces sean más grandes, PERO también más feos por lo que la comercialización es peor. En muchos
países los peces se venden ya fileteados por lo que este problema se evita un poco, pero en ES o IT están enteros.
OTROS GENES DE CRECIMIENTO

Introducción del gen de la follistatina de la carpa herbívora en la dorada
(Megalobrama amblycephala).
Se mete en la dorada en este caso y se obtiene un incremento en el tamaño,

aunque no son incrementos espectaculares.
RESISTENCIA A ENFERMEDADES
Truchas arcoiris transgénicas que expresan el transgén de la cecropina P1 o un

análogo sintético de la cecropina B, el CF-17 presentaban características de
resistencia a los patógenos bacterianos de los peces, Pseudomonas fluorescens y
Vibrio anguillarum. Transferencia de genes de péptidos antibacterianos.
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RESISTENCIA AL FRIO
Salmón atlántico y Goldfish
Proteína anticongelante de la platija: Se introduce la proteína anticongelante de

la platija como promotor para que el pez sea resistente a los cambios de Tº
COMPOSICIÓN CORPORAL
Mejorar la composición corporal y el contenido de nutrientes y producir

sustancias bioactivas en los peces.
Tecnología transgénica para generar peces ricos en LC-PUFAs n-3 (Omega-3 long-chain
polyunsaturated fatty acid) utilizando el pez cebra como modelo animal.
Peces cebras. El corrión es transparente por lo que se ve super bien y se puede trabajar con
ellos muy bien.
SABOR
Microinyeción de ADN total extraído de camarones chinos (Fenneropenaeus

chinensis) al cigoto de la carpa común con el objetivo de mejorar el sabor: Se inyecta
ADN de camarones para mejorar el sabor.
Otras posibilidades es usar los peces como:
BIORREACTORES
Los peces una vez que se consiguen como tienen muchos descendentes permiten
producir en gran cantidad por ejemplo proteínas.
Se modifican las células para por ejemplo producir insulina, se produce en gran
cantidad, se extrae la proteína y se purifica.
Desarrollo de un sistema de biorreactor para suministrar y

acumular proteínas foráneas en los huevos utilizando el pez
medaka Oryzias latipes con la ayuda de una secuencia parcial
de vitelogenina (Vtg)
BIOSENSORES
El pez Medaka se manipuló genéticamente para utilizarse

como biosensor capaz de detectar contaminantes ambientales
(por ejemplo, estrógenos o metales). Se utilizó un promotor
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inducible por estrógenos (el promotor de la vitelogenina) para controlar la expresión del gen GFP (= biofluorescente y por
ello lo detecto).
Se manipulan los peces para que puedan detectar determinados contaminantes. En presencia del contaminantes se
expresa el gen biofluorescente y así se puede detectar.
PLEIOTROPÍA
Los salmones genéticamente modificados son pleiotrópicos. Efecto

pleiotrópico = indeseado como anomalías en el crecimiento,
esterilidad, etc.
Para algunas cosas se manipulan los peces pero en otros casos no.
PROBLEMAS PECES MODIFICADOS GENÉTICAMENTE
La acuicultura se expande rápidamente
El riesgo de los peces GM está asociado a su introducción en la naturaleza y su competencia con las especies salvajes. Los
riesgos de la acuicultura actual son extrapolables al cultivo de peces transgénicos.
 ESCAPES DE PECES: escape y aparezcan en el medio natural como especie invasoras, por ejemplo
 HIBRIDACIÓN CON OTRAS ESPECIES: casi todos los peces tienen fecundación externa por lo que puede que
haya cruce con otras especies lo cual puede ser un peligro para las especies libres
Esquema de un pez modificado genéticamente (rojo) que se mezcla con

los normales (azules):
 Puede que no pase nada

 Puede que se mezcle con la población dando lugar a híbridos
que van desplazando a la población natural
 Puede que cause el fin de la población
PECES ESTÉRILES
Se intenta que sean estériles así que si hay escapes no haya problemas.
Los triploides en general suelen ser estériles. Si tengo peces infértiles, significa que
SIEMPRE necesito un suministro: al final los beneficio que puede que los estériles
aporten implican también desventajas.
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Para que sean estériles lo que se hace, por ejemplo, es impedir el desarrollo de la línea germinal metiéndolos en un
compuesto esterilizante: me da individuos normales pero infértiles.
CONTROL DE ESPECIES INVASORAS
Otra forma para evitar problemas de escapes y riesgos para la población naturla es:
Cromosoma y troyano + daughterless carp
Cromosoma Y troyano: se va seleccionando para eliminar el cromosoma X: se consiguen

peces con un transgén aromatasa por lo que las hembras no se desarrollan.
Pez que contiene una inserción transgénica del gen de la aromatasa en múltiples sitios del
autosoma. No hay hembras en la descendencia.
ESPECIES COMERCIALES
Las regulaciones EU son muy estrictas PERO la opinión del público es muy importante.
Salmón: Es el primer organismo genéticamente modificado que se puede comercializar.
Se vende en Canadá y USA. Esto es la tecnología transgénica de los años 90' = con la H
de crecimiento. Muchos problemas de donde se cultivan estos salmones: Canadá y estados
unidos.
REGULACIÓN
Es aplicable para todos los OGM. Debe ser organismos seguros:
 No tóxicos
 No alergénicos
 Con nuevas características nutricionales
 La composición debe ser adecuada
 Las características de los procesos deben ser adecuadas
PROTOCOLO DE BIOSEGURIDAD DE CARTAGENA
Protocolo de Cartagena: Están sujetos prácticamente todos los países. Va

cambiando todos los años.
El Protocolo de Cartagena sobre Bioseguridad es un instrumento internacional que regula los organismos vivos
modificados, OVMs, producto de la biotecnología moderna. Este acuerdo promueve la seguridad de la biotecnología,
estableciendo normas y procedimientos que permitan la transferencia segura, manipulación y uso de OVMs, enfocado
específicamente al movimiento transfronterizo.
Su nombre completo es Protocolo de Cartagena sobre Seguridad de la Biotecnología del Convenio de Diversidad
Biológica. Cartagena es el nombre de una ciudad colombiana en donde en febrero de 1999 el Protocolo de Bioseguridad
fue originariamente programado para ser concluido y adoptado.
Sin embargo, debido a ciertos asuntos por resolver, el Protocolo fue finalizado y adoptado un año después, el 29 de enero
del 2000 en Montreal, Canadá.
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En EU son muy estrictos frente a los OGM. Lo que hay en ES es básicamente lo mismo que dice EU porque seguimos las
mismas leyes.
EDICIÓN GENÉTICA
Desde el punto de vista regulatorio la edición genética es complicada
CONCEPTOS BÁSICOS:
1. Como cortar y pegar fragmentos de ADN

2. ¿Qué es en promotor?
3. ¿Qué es un vector de clonación?
4. ¿Qué es una construcción?
5. ¿Qué es un gen de selección?
6. ¿Qué es un gen reporter?
7. ¿Qué es transfectar células?
8. ¿Cómo se integra el DNA en el genoma?
9. ¿Cómo se inserta un gen en un genoma?
10. ¿Cómo se comprueba el éxito del experimento?
ENZIMAS ÚTILES PARA MANIPULAR ÁCIDOS NUCLEICOS
Necesitamos extraer el ADN y para manipularlo necesitamos enzimas
Nucleasas: digieren el ADN. Pueden ser exo o endo-nucleasas según si eliminan nucleótidos en el extremo 3’ o 5’
 Exonucleasas ADN
 Endonucleasas ADN
o Enzimas de restricción
 Ribonucleasas: nucleasas para ARN
Enzimas:
 Ligasas: unen extremos de ADN

 Fosfatasas: eliminan fragmentos de fosfato
 Quinasas: añaden fosfato
Polimerasas: pegan fragmentos
 Polimerasas de ADN
 Polimerasas de ARN
COMO CORTAR Y PEGAR FRAGMENTOS DE ADN
 Enzimas de restricción
 Ligasas
 Fosfatasas
¿QUÉ ES UN PROMOTOR?
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 Promotor: secuencia, situada corriente arriba de la codificadora, que interactúa con la polimerasa de ARN.
Asegura que la transcripción comience siempre en el mismo sitio. El promotor está en la parte 5’.
 Secuencia codificadora: secuencia de ADN que será transcrita a ARN por la polimerasa de ARN. No siempre
está.
 Terminador: secuencia situada corriente abajo de la codificadora de ARN que especifica dónde termina la
transcripción.
En eucariota hay muchos tipos de promotores mientras que en

procariotas son muy sencillos. Dependiendo de lo que se vaya a usar, a
veces se necesitan promotores más o menos fuertes.
PROMOTORES DE EUCARIOTAS: Los promotores son necesarios

para que la RNA polimerasa se una al DNA. Las bases en el promotor se
numeran con el signo negativo (-). Contienen secuencias cortas que son
críticas para el reconocimiento. Estas secuencias son similares entre
diferentes especies. La secuencia consenso es la más frecuente.
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a. Promotor básico
b. Promotor más sofisticado. Puede hacer que incremente la expresión de los genes o lo silencie.
Elementos funcionales en al expresión.
¿Qué tipos de promotores hay?
Los genes con expresión basal tienen promotores muy simples, pero luego hay otros genes que son más específicos.
 Específicos de tejido/ no específicos (generalistas): según el tipo de tejido necesito un promotor más o menos
básico
 Constitutivos/inducibles
 Fuertes/débiles: cuando son constitutivos suelen ser débiles porque, aunque la expresión sea constante de normal
no necesita que se exprese mucho.
 Amplio rango de especificidad/ estrecho: algunos activan más tipos de genes diferentes, mientras que otros
promotores, los estrechos, solo activan genes específicos
En manipulación se suelen querer

promotores fuertes, que den mucha
expresión y que se pueden usar para
muchos tejidos. Esto lo suele cumplir los
promotores de virus por eso son muy
comunes.
Virus de mamíferos y aves: Son promotores

fueres constitutivos y válidos para todos los tejidos
 RSV (virus del sarcoma deRous)

 TK (thimidina kinasa)
 SV40 (virus simio)
 CMV (citomegalovirus)
Respuesta a elementos: Son promotores que se inducen si hay hidrocarburos, metales, etc. y activan el gen de
fluorescencia, por ejemplo. Son ejemplos de los centinelas, por ejemplo.
 Hidrocarburos
 Metal (Hg, Cu, Ni, Cd, Zn)
 Estrógenos
¿QUÉ ES UN VECTOR DE CLONACIÓN?
Ejemplo de vector de procariota.
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Tiene siempre un origen de clonación, un gen de resistencia y el sitio de clonación donde se inserta el ADN.
¿QUÉ ES UN VECTOR DE EXPRESIÓN?
En el vector de expresión ya debemos tener promotores.
Muchos vectores de expresión son mixtos: que pueden crecer en bacterias y luego ya pasan a células animales.
Vector de 3423 bp: es pequeño. Según el tamaño de lo que tenga que clonar el vector serán más o menos grandes
Virus como vectores: Se suele usar una mezcla entre un plásmido y un

virus.
Los virus tienen los extremos para dar recombinación por eso se usan.
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Lentivirus se usan mucho para fragmentos muy grandes.
QUÉ ES UNA CONSTRUCCIÓN?
Voy a necesitar:
 La secuencia codificante del gen que quiero expresar

 Promotor
 Terminador (o no)
QUÉ ES UN GEN DE SELECCIÓN?
Para ver si el experimento va bien es muy útil usar genes de

selección. Son genes que convierten a las células resistencias por ejemplo a un ABs: al final del experimento veo si hay o
no resistencia, si el experimento ha ido bien si serán resistentes.
En célula de eucariota se usa la blasticida y el Gen418 y son genes de resistencia a ABs.
Son genes que confieren una nueva función a la célula y le permiten vivir en presencia de un agente selectivo, que suele
ser un antibiótico. Dicho agente, añadido al medio de cultivo, mata células no transformadas. Un buen agente de selección
es aquel que puede usarse en una dosis lo suficientemente alta como para impedir la viabilidad de las células no
transformadas y lo suficientemente baja como para no dañar las células transgénicas.
 Blasticidina
o Inhibe la síntesis de ADN en células de mamífero
o El vector contiene el gen de resistencia
 G418 (Geneticina)
o Bloquea la traducción
o La resistencia es la neomicina fosfotransferasa (NeoR)
o El vector contiene el gen de la neomicina fosfotransferasa
Selección por interferencia con el metabolito de

purina y pirimidina.
Gen TK es el gen que da el herpesvirus

simple. Es un gen que mata a las células:
Fosforila un producto que se llama
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ganciclovir. Las células con el gen TK fosforila el ganciclovir y hace que se interrumpa la síntesis de ADN por lo que la
célula acaba muriendo.
Las células que tienen éxito viven si le añado ganciclovir.
QUÉ ES UN GEN REPORTER?
Son los que sintetizan algo que me permiten identificar fácilmente lo que tengo modificado.
Los genes reportes se usan para saber si tengo un promotor y que está co-regulando.
Son secuencias de ácidos nucleicos que

codifican proteínas fáciles de analizar, Se
utilizan para análisis de la expresión
génica, por ejemplo, identificar regiones
de unión a factores de trascripción,
determinar eficacia de los promotores.
Ejemplo de genes repórter:
GAL (b-galactosidasa): Hydroliza X-gal

dando como resultado un compuesto
coloreado. Se detecta por el cambio/
producción de color. Este es el de las
bacterias.
 SEAP (secreted human placental alcaline phosphatase): Fosfatasa alcalina bioluminiscente, es muy sensible.
Puede dar bioluminiscencia.
 LUC (luciferasa): Oxidiza la luciferina y emite fotones. Se contabilizan fotones con un luminómetro o con una
cámara para contar fotones. Hay diferentes tipos de luciferasa
 GFP (green fluorescent protein): Emite fluorescenciaverde cuando se irradia con luz ultravileta.Procede de la
medusa Aequoera victoria. Es el que más se usa: se ve perfectamente con los rayos UV.
 mCherry: Miembro de la familia mFruits de proteínas fluorescentes rojas monoméricas (mRFP). Como RFP,
mCherry se deriva de DsRed del nidario. Discosoma
QUÉ ES TRANSFECTAR CÉLULAS?
Tienes que alterar las bacterias para que introducir un material exógeno. Tengo un plásmido
donde introduzco mi ADN por una reacción de ligación y se da una recombinación. Este plásmido lo
tengo que introducir en una bacteria: obtengo colonias de bacteria y tengo que ver cuáles son las
transformadas y cuales no.
Es alterar genéticamente una bacteria como resultado de la absorción directa, incorporación y/o
expresión del material genético exógeno (ADN exógeno).
La transfección consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas

mediante plásmidos, vectores víricos u otras herramientas.
Como puedo hacer que el ADN entre en la cél: muchas opciones

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 Puedo hacer micro-inyecciones en el huevo fecundado
 Infecciones con retrovirus durante las primeras etapas del desarrollo
Tengo células madre y una vez que tengo integrado el ADN ya sea por transfección o infección con virus, lo que hago es
transferirlas a un blastocisto crear una quimera e ir a buscar los individuos en los que haya funcionado y esté el gen que
quiera.
Electroporación: es lo más usado: hago un choque eléctrico para insertar el ADN. Es muy masivo por lo que viene bien
en grandes números y es más sencilla.
Electroporación: rompe la membrana = hay una elevada mortalidad cel. Con los virus se pierden menos cél. (más
exitosa).
¿QUÉ TIPOS DE TRANSFECCIONES HAY?
Transitorias: los circulitos son los fragmentos que introducimos. Puede

que la expresión de los genes sea transitoria y luego la célula se
encarga de destruir este ADN extraño.
 Corto plazo
 No requieren selección
 Porcentaje de éxito pequeño
Estables: El ADN se incorpora dentro del genoma.
 Permanentes - generan una nueva línea

celular
 Requieren selección
 Todas las células tienen DNA transfectado
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COMO SE INTEGRA EL DNA EN EL GENOMA?
Al azar: Expresión variable
 Inactivación por metilación del DNA

 Ausencia de intensificadores
 Integración en heterocromatina
= se introduce al azar: puede pasar que: que no se exprese, que haya modificaciones epigenéticas y que el ADN se
inactive o que el promotor no sea lo suficientemente fuerte y que luego no se exprese.
Lugares determinados gene targeting (Recombinación homóloga): complicado = introducir el gen en un sitio
determinado
 Remplazar un gen funcional por otro no funcional (‘knock-out’): el knock-out se ha ido sustituyendo en muchos
casos por la edición génica
 Inserción de un gen nuevo (‘knock-in’)
 Reparación de una mutación dentro de un gen (terapia génica): esto de normal funciona cuando afecta a una
parte del genoma
 Remplazar un gen por otro (mismo promotor/intensificador diferente gen)
RECOMBINACIÓN
Todos estos sucesos tienen

tener lugar por recombinación
= es un suceso muy improbable
porque tengo que sustituir un
gen por otro.
Homóloga: Debe tener lugar un

evento de recombinación que
haga que mi fragmento vaya
exactamente donde quiero =
complicado
INTEGRACIÓN AL AZAR
El gen APT (aminoglycoside phosphotransferase)

confiere resistencia a G418
Tk es marcador se selección negativo: El ganciclovir

es un análogo de un nucleóxido. En presencia de
ganciclovir las células con el gen TK se van a morir.
Las células TK+ fosforilan el ganciclovir dando como resultado un producto tóxico.
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Obtengo células resistenes al ABs PERO que en
presencia de ganciclovir se mueren porque tienen el
gen TK.
Integración por recombinación homóloga
Si la inserto por recombinación homóloga: quiero

remplazar el gen por el transgén.
Si consigo esta incorporación por la recombinación

homóloga el gen TK me queda fuera mientras que el
gen de resistencia queda dentro: serán células
resistentes al ABs y no sensibles al ganciclovir.
COMO SE INSERTAUN GEN EN UN GENOMA?
Cultivo celular de células totipotenciales >

por electroporación, por ejemplo,
introducimos el vector dentro de las células
por recombinación = obtengo células
resistentes al ABs en principio.
Hago una selección para las células con el

ganciclovir de manera que distingo las que
insertaron al azar de las que tuvieron
recombinación homóloga.
Inyecto las totipotenciales por

recombinación homóloga en el blastocito >
se introduce en una madre de alquiler > se
producen una descendencia de ratones
quimeras > se cruzan con ratones normales
(diferencian por color) > genero individuos
puros por el gen que he introducido con el
vector.
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EJERCICIO 1: DISRUPCIÓN DE GENES
La inactivación específica de genes es una técnica que permite analizar la función biológica de un gen.
En este experimento una parte del gen denominado X (= el objetivo es eliminar el gen y ver que pasa para saber cómo
funciona ese gen) se inserta en un vector knock out (figura 1). Este vector es un plásmido que no contiene un origen de
replicación de mamíferos (= para que NO se replique en el plásmido) y que lleva dos marcadores de selección. Uno de
estos marcadores es el gen neoR (que hace que las células sean resistentes a geneticina (tóxico para la síntesis de
proteínas) regulado por promotor de mamíferos y que se inserta en uno de los exones del gen.
1) ¿Cuáles pueden ser las consecuencias de insertar el gen neoR en un exón del gen X?
Que las células que tengan involucrado el gen neoR si se le añade geneticina al medio SI sean capaces de
sintetizar proteínas porque serán resistentes a tal producto y a la vez, al intentar el gen neoR se interrumpe el gen
X que ya NO será funcional y de esta manera podemos ver el efecto de su NO expresión y estudiarlo.
2) ¿Cuál es el significado de unir un promotor de mamíferos al gen neoR?

Regular la expresión del gen neoR. El promotor no tiene por qué ser de mamífero, puede ser de virus. Lo
importante es que se replique en el mamífero (podría ser un virus).
El segundo marcador de selección del vector es tkHSV el gen de la timidita kinasa del virus del herpes simplex que
cuando se expresa en células de mamífero tratadas con el antiviral ganciclovir las conduce a la muerte (= si no meto
ganciclovir no pasa nada a las células).
En el experimento se trató un cultivo de células de ratón con el vector indicado en su forma lineal en condiciones que
favorezcan la transformación. La mayoría de las células no son capaces de incorporar el DNA. En algunas ocasiones lo
hacen pero los ácidos nucleicos se degradan. Otras veces las células si son capaces de de captar el vector y pueden hacerlo
de dos formas. EL vector se integra al azar en el ADN de la célula (suceso más frecuente) o se integra por recombinación
homóloga (suceso infrecuente) en este caso el gen Neo remplaza al gen X en la célula y en el vector ocurre lo contrario, el
gen neo es remplazado por el gen X ( Ver figura 2)
3) ¿Qué células (A y B de la figura 2) replican el gen neoR durante la fase S del ciclo celular?
Las dos porque si está integrado, al replicar el genoma se replica todo, el gen neoR también.
4) ¿Qué células (A y B de la figura 2) expresan el gen neoR ?

En principio las dos porque tienen un promotor de células eucariotas específico para el gen neoR.
5) ¿Qué células (A y B de la figura 2) degradan y pierden el gen tkHSV rápidamente?

B, porque el gen TK se queda fuera de los brazos de recombinación.
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6) ¿Qué células (A y B de la figura 2) expresan el gen tkHSV solamente de forma transitoria?

B, porque mientras las inserto hay un momento de 24 horas en el el gen TK se queda en la célula pero a no estar
integrado en el genoma se irá degradando (tarda unas horas en degradarse tras no ser integrado) mientras que
las A sí que es integrado de forma permanente.
7) ¿En qué células (A y B de la figura 2) la función del gen X es inhibida?

B, porque pasa al vector (= se remplaza) mientras que el neoR se inserta en la célula.
8) ¿Qué mata a las células que no captan el DNA foráneo durante la transfección? ¿La geneticina o el ganciclovir?
Geneticina, porque al no integrar el gen neoR no van a ser resistentes a la genaticina que es un tóxico para la
síntesis de proteínas.
9) ¿Qué mata a las células en las que el DNA foráneo es degradado en el citoplasma? ¿La geneticina o el
ganciclovir?
Geneticina, porque es lo mismo: si no se integra en gen neoR y no hay expresión no son resistentes.
10) ¿Qué mata a las células en las que el vector se integra al azar en el DNA? ¿La geneticina o el ganciclovir?
Ganciclovir, porque las células son resistentes a la geneticina pero llevan el gen TK por lo que si añadimos
ganciclovir morirán ya que se bloquea la síntesis de las proteínas.
11) ¿Qué mata a las células en las que el vector se integra por recombinación homóloga? ¿La geneticina o el
ganciclovir?
Las homólogas son las resistentes y en principio no se mueren ya que tienen el gen neoR que las hace resistentes
a la geneticina y no presentan el gen TK que las hace sensibles al ganciclovir.
COMO SE COMPRUEBA EL ÉXITO DEL EXPERIMENTO?
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Técnica básica
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Tema 2: Conceptos avanzados Aplicaciones biotecnológicas en
Acuicultura
TEMA 2: CONCEPTOS AVANZADOS
Transposón Tol 2
El elemento Tol2 de medaka es un transposón autónomo que

codifica una transposasa funcional. La proteína transposasa
puede catalizar la transposición de una construcción que
contenga 200 y 150 pares de bases de ADN de la secuencia
de Tol2 en los extremos izquierdo y derecho,
respectivamente. Estas secuencias contienen repeticiones
invertidas terminales esenciales. Entre estas secuencias, se pueden clonar Insertos de ADN de tamaños bastante grandes
(hasta 11 kilobases) sin reducir la actividad de la transposición
EXPRESIÓN TRANSITORIA
INTEGRACIÓN EN LÍNEA GERMINAL
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Acuicultura
Sistema cre-lox
 Cre es una recombinasa de 38 kDa producto del gen cre del bacteriófago P1
 Cre reconoce una secuencia de 34 bp del genoma del bacteriófago llamado LoxP, cataliza la recombinación
recíproca y conservativa entre dos sitios LoxP
 LoxP consiste en dos secuencias repetidas invertidas de 13 bp separadas por una región asimétrica de 8 bp
Utilización del sistema CRE/loxP
Heat
shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and
hyperplasia in transgenic zebrafish
EJERCICIO 3: SISTEMA DE RECOMBINACIÓN CRE / LOXP
En este experimento se crearon dos grupos de ratones transgénicos. En uno de ellos (designado hCMV-cre) la región
codificante del gen cre está unida al promotor fuerte del citomegalovirus humano y al extremo distal de cre hay un
elemento de poliadenilación, (Fig. 1A.).
1) ¿Por qué es necesario añadir el promotor del virus del gen cre?
2) ¿Cuál es la consecuencia de la inclusión del elemento de poliadenilación?
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Acuicultura
Figura 1. Estructura de las construcciones de ADN

utilizadas para generar ratones transgénicos.
(A): hCMV-cre. (B): mαA-espaciador-T (las flechas

verticales señalas los sitios de restricción de BamH1; las
flechas horizontales corresponden a los cebadores
utilizados en las reacciones de PCR de las Figuras 3 y 4,
las puntas de flechas apuntan a los extremos 3 'de los
cebadores).
El otro ratón transgénico (mαA-espaciador-T) consiste en el promotor de un gen murino αAcristalina (mαA, activo en las
células del cristalino de los ojos), el gen de del virus SV40 que codifica para el antígeno T grande (la expresión de la gran
proteína T transforma en malignas las células de mamíferos), y un fragmento espaciador insertado entre el promotor y el
gen T grande (Fig. 1B). El espaciador, además de otras secuencias, contiene un elemento de poliadenilación y está
flanqueado por dos sitios loxP.
3) ¿Qué ocurriría si esta construcción se introduce en una célula del cristalino de mamífero?
4) ¿Es cierto que la transfección de células murinas del cristalino con el transgén m αAespaciador- T conduciría a su
transformación maligna debido a que el antígeno T grande se expresaría activamente?
5) ¿Cuál será, aproximadamente, el tamaño de transcrito producido a partir de esta construcción en células del
cristalino?
6) Los ratones transgénicos hCMV-cre se cruzaron con los ratones transgénicos mαA-espaciador-T y se analizaron
los descendientes de la presencia de los dos transgenes (Figs. 2 y 3). Se utilizó la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) para detectar cre y el gen grande T (Fig. 2A) y para estudiar la región loxP (Fig. 2B) en tres
crías de una camada. (En las condiciones de PCR utilizadas las regiones de más grandes de 500 pb no se
amplificaron) El tamaño de los productos de la PCR se determinó por electroforesis en geles de agarosa (Figs. 2A
y 2B). La región mαA-espaciador-T se analizaron por Southern-blot (Fig. 2C).
Figura 2. Genotipos de tres crías resultantes de cruce de ratones mαA-espaciador-T y

ratones hCMV-cre. (A): análisis mediante PCR de muestras de ADN extraído de la cola
de tres las crías utilizando los cebadores CRE (véase la Fig. 1A.) y los cebadores
específicos T grande (véase la Fig. 1B.), (B): análisis de PCR de muestras de ADN de la
cola utilizando el par de cebadores que amplifican el fragmento espaciador (véase la Fig.
1B), (C): análisis de transferencia de Southern de muestras de ADN de la cola digerido
con BamHI utilizando el fragmento de mαAespaciador- T (véase la Fig. 1B.) como una
sonda (pb, pares de bases)
7) ¿Qué crías tienen el gen cre?

8) ¿En qué crías se expresará el gen cre?
9) ¿En qué crías se expresará la proteína T en las células del cristalino?
10) ¿En qué crías se expresará la proteína T en las células de fibroblastos?
11) ¿El genoma de qué crías contiene un único sitio loxP?
12) ¿El genoma de qué crías contiene múltiples copias de la construcción mαA-
espaciador-T?
20
Acuicultura
13) ¿Qué ratones son de doble transgénico (mαA-spacer-T/hCMV-cre)
Utilizando PCR, se determinaron los genotipos de un gran número de ratones; los resultados se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1. Líneas de
ratones transgénicos y la aparición de tumores en el cristalino
Por último, se analizó la región loxP de cola y tejido ocular muestras de dos ratones transgénicos usando el par de
cebadores se muestra en la figura. 1B. Los resultados de este análisis de PCR se muestran en la figura. 3.
Figura 3. Análisis PCR de las regiones loxP en los ratones transgénicos
Las siguientes afirmaciones ¿son verdaderas o falsas?
14) El promotor de hCMV está activo sólo en las células del cristalino
15) El promotor de hCMV está activo sólo en los fibroblastos.
16) La proteína T se expresa en los fibroblastos de ratones transgénicos mαA-espaciador-T
17) La proteína T se expresa en las células del cristalino de ratones transgénicos mαA-espaciador-T.
18) La deleción de la región espaciadora dirigida por la recombinasa Cre se logró en todos los ratones de doble
transgénico de la Tabla 1.
21
Acuicultura
microARN (miARN)
ARN pequeños de entre 19-30 nucleótidos de largo que actúan como guías
de complejos de ribonucleoproteínas para dirigir la degradación de ARN
codificantes para proteínas o mensajeros (ARNm), la inhibición de la
traducción, la formación de la heterocromatina y la regulación
transcripcional. Los microRNAs regulan genes vinculados a procesos tales
como desarrollo, diferenciación celular, apoptosis, señales de transducción,
organogénesis y proliferación celular, entre otros.
 “Dicer” corta un horquilla de 70-130 nt en fragmentos de 14-19 nt

(miARN).
 Los miARN se emparejan con regiones 3’ no traducidas de ARNm
maduros, bloqueando la traducción.
 Los miARN se pueden unir al ADN modificando la cromatina:
metilación del ADN dirigida por ARN (RdDM) de la citosina.
Experimentos con miRNA
EJERCICIO 2: REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DEL GEN FOS MEDIANTE MICRO-ARN
22
Acuicultura
El proto-oncogen fos codifica para un componente del factor de transcripción AP1, que es importante en la expresión de
genes y en la proliferación celular. La desregulación de la función de AP1 puede llevar a la transformación maligna de las
células.
El experimento tiene como objetivo estudiar el papel del micro ARN 7b (miR-7b) en la regulación de la expresión del gen
fos. La secuencia de miR-7b es parcialmente complementaria a la región 3´no traducida del mRNA del gen fos. El
fragmento de ADN que codifica para miR-7b fue clonado en un vector de expresión. También se clonó otro micro-RNA
no relacionado con el gen fos. Los plásmidos recombinantes designados si-miR-7b (muestras 3 y 4 en la figura 1) y si-
miR-neg (muestras 5 y 6 en la figura 1) se transfectaron en fibroblastos de ratón. Como control se utilizaron células no
transfectadas (muestras 1 y 2 en la figura 1). Una parte de los cultivos, muestras 2, 4 y 6, se trató con ester de forbol (fobol
acetato miristato PMA) y la otra parte no se trató (muestras 1, 3 y 5). El ester de forbol es un análogo del diacilglicerol
que es capaz de estimular la proteinkinasa C)
Dos horas después del tratamiento con PMA se preparó un extracto de proteínas de cada uno de los cultivos y se realizó
un Western blot utilizando anticuerpos anti-Fos y anti-Actina. (Ver figura 1 A).
En otra réplica de los cultivos, una hora después del tratamiento con PMA se extrajo el RNA y se realizó un Northern blot
utilizando como sonda el cDNA del gen fos. (Ver figura 1 B).
1) ¿Para qué se realiza el Western blot?

2) ¿Para qué se realiza el Northern blot?
3) Si se bloquea la ORF del mRNA ¿se inhibe la síntesis de la proteína Fos?
4) ¿Los esteres de forbol, estimulan la traducción del fos mRNA?
5) ¿Tiene el miR-7b un efecto inhibitorio general de la transcripción en fibroblastos?
6) La expresión de un RNA exógeno ¿tiene un efecto general inhibitorio de la transcripción en fibroblastos?
7) El miR-7b ¿tiene un efecto inhibitorio general de la traducción en fibroblastos
8) La expresión de un RNA exógeno ¿tiene un efecto inhibitorio general de la traducción en fibroblastos?
9) El miR-7b ¿bloquea específicamente la expresión de la proteína Fos?
Figura 1. Análisis de los efectos del si-miR-7b en la

expresión génica en fibroblastos de ratón mediante
western blot (A) y northern blot (B).
Morfolinos
23
Acuicultura
Morpholinos: Usos de oligonucleotidos antisentido
24
Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
TEMA 3: EDICIÓN DE GENES
NUCLEASAS DE DEDOS DE ZINC
TALENT
Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) son enzimas de restricción artificiales generadas por la fusión de
un domino de unión TALEN y dominio de corte de DNA.
25
TAL (transcription activator-like) effectors (TALEs) son proteínas de la bacteria Xanthomonas que se pueden unir a
secuencias promotoras de las plantas que infecta la bacteria y activar la expresión de genes. Tienen un dominio Nterminal
responsable de la translocación, un dominio C terminal activador de la transcripción y un domino repetido central
formado por repeticiones variables de aproximadamente 34 que hace que sean capaces de reconocer secuencias
específicas.
Experimentos con TALENT
Supresión de la actividad de un gen:
 Unión a la secuencia
 Doble digestión enzimática con FoK1
 Reparación por recombinación no homól
CRISPR/Cas9
El sistema CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic

repeats/ CRISPR associated protein 9) es un mecanismo de defensa adaptativa
utilizado por Archea y bacterias para degradar material genético extraño. En estos organismos, el material genético del
bacteriófago es integrado en la región CRISPR. que será utilizado como resistencia contra futuras infecciones del
bacteriófago.
26
Estos fragmentos de secuencia especifica se traducen en

CRISPR ARNs cortos (crRNAs) y funcionan como guía para
dirigir la escisión del ADN invasor complementario, mediante
actividad nucleasa de la proteína CRISPR-asociada (Cas)
codificada también en el locus CRISP.
Sistema de defensa
de las bacterias
Herramienta de edición genética
27
Demostración: Herramienta de edición genética
Los sistemas CRISPR contienen dos componentes: un

ARN guía (gRNA) y una endonucleasa asociada a
CRISPR (proteína Cas).
28
El gRNA es un ARN sintético corto compuesto por una secuencia de andamiaje necesaria para la unión a Cas y un
espaciador de ∼20 nucleótidos definido por el usuario que es complemengtario la diana genómica que se va a modificar.
29
Proteína cas 9: 6 dominios
Unión de extremos no homólogos
30
31
dCas9: Las mutaciones en los

dominios de las nucleasas RuvC
y HNH (D10A y H840A en la
Cas9 de Streptococcus pyogenes
dan lugar a una variante de
Cas9, denominada dCas9, capaz
de unirse a la secuencia
objetivo, pero incapaz de
escindir su objetivo.
Editores sin doble digestión
32
33
Cas13a corta ARN
34
SHERLOCK (Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing)
EXPERIMENTOS
Identificar la secuencia diana
35
36
Lentiviral vector for expressing U6 sgRNA and CAGGS Cerulean fluorescent protein
Diseñar sgRNA
37
Experimentos con CRISPR/Cas9: reparación del gen albino
One-cell stage zebrafish embryos were injected with ∼2-3 nl of

a solution containing
250 ng/μl Cas9mRNA,
15 ng/μl sgRNA and 5-
50 ng/μl template DNA.
38
Reducción de la tolerancia térmica en un coral portador de mutaciones inducidas por CRISPR en el gen de un
factor de transcripción de choque térmico
El objetivo es estudiar la respuesta al stress. Identifican y mutan con CRISPR-Cas el gen que codifica el Factor de
Transcripción de Choque Térmico 1 (HSF1) y obtuvieron larvas en las que >90% de las copias del gen eran mutantes. Las
larvas mutantes sobrevivieron bien a 27 °C pero murieron rápidamente a 34 °C, una temperatura que no produjo
mortalidad las larvas de tipo salvaje
Concluyen que la función del HSF1 (presumiblemente su inducción de genes en respuesta al estrés térmico) desempeña
un importante papel protector en los corales. En términos más generales, concluyen que la mutagénesis CRISPR en
corales debería permitir la realización de pruebas amplias y rigurosas de la función de los genes tanto en las larvas como
en los corales adultos
sgRNA
Las secuencias de los

cromosomas mutantes
que contienen deleciones
que abarcan el intervalo
del exón 3 al exón 9 del
HSF1. Con el ADN de los
39
animales inyectados se hizo una PCR utilizando los cebadores 1 y 4 secuenciación de estos productos detectó deleciones
de ~2,6 kb
Identificación del éxito de la inyección de las larvas de A. millepora. Imágenes de campo claro y de fluorescencia de
larvas representativas no inyectadas (A-B) e inyectadas (C-F). Las larvas inyectadas se clasificaron a las 12 horas dela
fecundación en grupos con (C y D) o sin (E y F) fluorescencia visible del marcador de inyección Alexa Fluor 488-
dextrano.
40

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