Instructivo Ma-Lcq-348 01 Análisis de Propizamida en Alimentos para Animales

Instructivo de Cuantificación HPLC Código: MA-LCQ-348/01
Versión: 1
INSTRUCTIVO DE CUANTIFICACIÓN
HPLC/DAD DE PROPIZAMIDA EN
ALIMENTOS PARA ANIMALES
Método: Anasac Chile S.A.
Realizado por: Q.L. Carmen Gloria Herrera

Jefa Laboratorio Servicios analíticos
Anasac Chile S.A.

Departamento de Calidad Químicos
TABLA DE CONTENIDO
Contenido
1. OBJETIVO .......................................................................................................................................... 1
2. ALCANCE............................................................................................................................................ 1
3. RESPONSABLES ................................................................................................................................ 1
4. ACTIVIDADES DEL INSTRUCTIVO ................................................................................................. 1
5. REGISTROS Y ANEXOS .................................................................................................................... 9
Versión: 1 Página 1 de 100
1. OBJETIVO
El objetivo del instructivo, es describir el desarrollo del método de cuantificación de

Propizamida en muestras de alimentos para animales, utilizando la técnica de Cromatografía
Líquida de Alta Resolución (HPLC), con detector de arreglo de Diodos (DAD).
2. ALCANCE
Aplica tras el muestreo de: Cereal (Trigo), con el fin de analizar la cantidad de residuos del
plaguicida.
3. RESPONSABLES
Es responsabilidad del Supervisor del Laboratorio de Servicios Analíticos, la vigencia y

actualización del documento.
Es responsabilidad del Supervisor del Laboratorio de Control de Calidad, la correcta

aplicación del documento.
Es responsabilidad del Jefe de Servicios analíticos la aprobación y puesta en marcha del

documento.
4. ACTIVIDADES DEL INSTRUCTIVO
4.1 DETALLE DE LAS ACTIVIDADES
4.1.1 TERMINOLOGÍA
Estándar de referencia: Sustancia química de referencia primaria, que se reconoce de forma

generalizada y que está dotada de las cualidades apropiadas a la molécula explícita y cuyo
valor de pureza se acepta, sin necesidad de comparación con otra sustancia química.
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC): Técnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una
fase móvil.
Detector DAD: Permite hacer barridos a distintas longitudes de onda de cada uno de los
componentes separados. De esta manera, se genera un grupo de imágenes a diferentes
longitudes de onda. Mediante los arreglos de diodos se puede determinar la mejor longitud
de onda a la que debe monitorearse el compuesto de interés.
Análisis cuantitativo: Se basa en la comparación del área de pico del componente de interés,
con la de estándares de esta sustancia de concentración conocida, admitiendo que existe
una relación lineal entre el área del pico y la concentración en un determinado intervalo de
concentraciones.
Extracción del plaguicida: Separándolo de otros componentes de la muestra. La extracción

se suele llevar a cabo con disolventes orgánicos. Tanto el procedimiento utilizado para la
extracción como el disolvente (o mezcla de disolventes) elegido dependen del tipo de
muestra y de los plaguicidas a analizar
Clean – up: Consiste en la eliminación de los constituyentes de la muestra que interfieren

en el análisis. Generalmente, el extracto obtenido después de la extracción contiene, además
de los plaguicidas, una serie de compuestos coextraídos que interfieren en la determinación,
por lo que es necesario eliminarlos adecuadamente. En la mayor parte de los casos, esta
etapa incluye un proceso de partición líquido – líquido y/o una posterior purificación, que
suele realizarse por cromatografía líquida.
Métodos multi-residuales (MMR): Permiten la identificación y cuantificación de varios

plaguicidas, así como de algunos metabolitos, simultáneamente, aplicando un único
procedimiento de análisis. Se utilizan, fundamentalmente, para la inspección de alimentos y
en programas de control de residuos.
Métodos individuales o específicos: Son métodos especialmente diseñados para analizar un

único plaguicida, y, en ocasiones, también sus metabolitos o productos de degradación.
4.1.2 EQUIPOS Y MATERIALES
Equipo/ Instrumentos
HPLC
Detector DAD/UV (modo UV)
Autosampler
Horno
Bomba (modo isocrático)
Software (Lachrom o EZchrom Elite)
Balanza analítica
precisión 0,0001g
Balanza semimicro
precisión 0,00001g
Micropipetas de 100 y 1000 µL
Corriente de nitrógeno
Vórtex
Centrifuga
Sonicador
Agitador orbital
Materiales
Matraces volumétricos
Pipetas aforadas
Propipeta
Espátula
Probeta
Frasco con tapa para fase móvil
Filtros de membrana PTFE
Filtros de jeringa PTFE
4.1.3 ESTÁNDARES Y REACTIVOS
Estándar (s)
Propizamida de concentración conocida
Reactivos
Acetonitrilo HPLC
Agua HPLC
Ácido fosfórico (H3PO4) grado PA
Ácido acético glacial
4.1.4 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS
Phenomenex C18; Dimensiones 150 x 4,6 mm; tamaño de

Columna
partícula 5 µm
70% Acetonitrilo HPLC
Fase Móvil
30% Agua HPLC (con 0,5 %v/v de H3PO4)
Longitud de Onda 208 nm
Flujo 1 mL/min
Temperatura del Horno 35 °C
Volumen de Inyección 10 µL
Solvente de dilución Acetonitrilo
Tiempo de retención
3,6 ± 0,5
Propizamida (min.)
Tiempo de corrida de análisis
7,0
(min.)
4.1.5 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE ANÁLISIS
4.1.5.1 Especificidad del método:
- Preparar tres soluciones para evaluar si el método es apto para identificar la Propizamida
sin que la Matriz de la muestra interfiera, para esto preparar una solución estándar de
Propizamida, una solución de matriz cargada con Propizamida y una solución de muestra e
inyectar en triplicado en el equipo HPLC.
Preparación de estándar: pesar 5,0 ± 0,5 mg de Propizamida en un matraz volumétrico de

100 mL, llevar hasta la mitad del aforo con acetonitrilo y sonicar durante 10 minutos, llevar
a temperatura ambiente y aforar el matraz, tomar una alícuota de 0,25 mL y llevar a un
matraz de 50 mL.
Preparación de Muestra cargada:
- Pesar 50,0 ± 0,5 g de muestra en un tubo de centrífuga de 50 mL
- Agitar en el mismo tubo, durante 30 minutos usando un agitador orbital
- Posteriormente, añadir 15 mL de ácido acético glacial al 1% en acetonitrilo HPLC como

disolvente de extracción.
- Agitar durante 4 min. en un agitador orbital, y centrifugar a 3700 rpm durante 5 min.
- Extraer una alícuota de 25 mL del sobrenadante y secar en una corriente de nitrógeno
- Disolver el extracto seco en 12 mL de una mezcla 50:50 de acetonitrilo HPLC: agua HPLC
- Filtrar a través de una jeringa, utilizando un filtro de PTFE de 0,45 µm
- Transferir el extracto, a viales con 2 mL de acetonitrilo HPLC y adicionar una alícuota de

0,01 mL del estándar preparado
- Inyectar la muestra en el cromatógrafo.
Preparación de Muestra:
Pesar 50,0 ± 0,5 g de muestra en un tubo de centrífuga de 50 mL

- Transferir el extracto, a viales con 2 mL de acetonitrilo HPLC.
4.1.5.2 Preparación de la muestra – Aplica a la solución matriz muestra (libre de plaguicidas)

y a la muestra en estudio
- Pesar 50,0 ± 0,5 g de muestra en un tubo de centrífuga de 50 mL

- Transferir el extracto, a viales con 2 mL de acetonitrilo HPLC.
4.1.5.2 Solución Estándar de Propizamida
Pesar aproximadamente 5,00 ± 0,50 mg de estándar de Propizamida, incorporar a un matraz

volumétrico de 100 mL disolver y aforar con solvente de dilución. Homogenizar en un vortex.
4.1.5.3 Curva de Calibración de 0,0025 – 0,0200 mg/mL:
De la “solución estándar”, tomar alícuotas de: 250 µL, 500 µL, 1 mL, 1,5 mL y 2,0 mL;
incorporar c/u a matraces volumétricos de 50 mL, adicionar 2 mL de solvente de dilución,
aforar con “solución matriz muestra” (libre de plaguicidas), finalmente homogenizar en un
vortex. Realizar 3 inyecciones por concentración.
Gráfico 1. Curva de calibración Propizamida
4.1.5.4 Rango de trabajo
Rango de Trabajo
Analito
(mg/mL)
Propizamida 0,00025 – 0,00200
4.1.5.5 Exactitud del método
- Preparar 10 soluciones muestra con el método indicado en el punto 4.1.5.1 para la

preparación de la “Muestra cargada”, con el objetivo de determinar si el método es exacto
para cuantificar la concentración de principio activo presente en la muestra.
- Inyectar en triplicado en el equipo cromatográfico y evaluar.
- Criterios de aceptación: Recuperación obtenida: 90 – 110% y %CV entre muestras <2%.
Resultados:
Recuperación %CV Cumple/No Cumple

95,1% 1,8% Cumple
4.1.5.6 Precisión del método
Preparar 10 soluciones muestra replicando lo realizado en el punto 4.1.5.5 “Exactitud del

método” pero por un analista diferente, con el objetivo de determinar si el método es preciso
para cuantificar la concentración de principio activo presente en la muestra.
- Inyectar en triplicado en el equipo cromatográfico y evaluar.
- Criterios de aceptación: Recuperación obtenida: 90 – 110%, %CV entre muestras <2%

y %CV <2% entre las muestras de Exactitud v/s muestras de Precisión.
Resultados:
Recuperación %CV %CV v/s Cumple/No

Exactitud Cumple
95,3% 1,2% 0,8% Cumple
4.1.5.7 LÍMITE DE DETECCIÓN (LD) Y CUANTIFICACIÓN (LC)
LD = 3 X 
LC = 10 x 
Donde:
: 0,000025 (desviación estándar – ruido instrumental)
Resultados:
0,000075 mg/mL o
LD
0,003 mg/Kg
0,00025 mg/mL o
LC
0,01 mg/Kg
4.2 CÁLCULO DE CONCENTRACIÓN DE PROPIZAMIDA EN LA MUESTRA:
Graficar la curva de calibración para la ecuación y = bx + a
Pendiente Curva (b): 1957
Intercepto Curva (a): 1473,4
R2  0,99
Concentración de Propizamida (mg/mL)
Área Promedio Muestra - a = mg/mL Propizamida

b
(mg/Kg) Propizamida
mg/mL x 2 mL = (mg/Kg) de Propizamida en la Muestra

Peso Muestra (Kg)
4.3 REFERENCIAS
Método Implementado en Anasac Chile S.A.
5. REGISTROS Y ANEXOS
N° Nombre Registro Anexo N°

Cromatogramas curva de calibración,
1 selectividad, exactitud, replicabilidad y N/A I
muestras.
ANEXO I.
- Muestras





- Curva de calibración















- Selectividad








- Exactitud y Replicabilidad
-


























































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Realizado por: Q.L. Carmen Gloria Herrera

Anasac Chile S.A.

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El objetivo del instructivo, es describir el desarrollo del método de cuantificación de

Es responsabilidad del Supervisor del Laboratorio de Servicios Analíticos, la vigencia y

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4. ACTIVIDADES DEL INSTRUCTIVO

4.1 DETALLE DE LAS ACTIVIDADES

Estándar de referencia: Sustancia química de referencia primaria, que se reconoce de forma

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Extracción del plaguicida: Separándolo de otros componentes de la muestra. La extracción

Clean – up: Consiste en la eliminación de los constituyentes de la muestra que interfieren

Métodos multi-residuales (MMR): Permiten la identificación y cuantificación de varios

Métodos individuales o específicos: Son métodos especialmente diseñados para analizar un

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4.1.2 EQUIPOS Y MATERIALES

4.1.3 ESTÁNDARES Y REACTIVOS

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4.1.4 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS

Phenomenex C18; Dimensiones 150 x 4,6 mm; tamaño de

4.1.5 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE ANÁLISIS

4.1.5.1 Especificidad del método:

Preparación de estándar: pesar 5,0 ± 0,5 mg de Propizamida en un matraz volumétrico de

Versión: 1 Página 5 de 100

Preparación de Muestra cargada:

- Pesar 50,0 ± 0,5 g de muestra en un tubo de centrífuga de 50 mL

- Agitar en el mismo tubo, durante 30 minutos usando un agitador orbital

- Posteriormente, añadir 15 mL de ácido acético glacial al 1% en acetonitrilo HPLC como

- Extraer una alícuota de 25 mL del sobrenadante y secar en una corriente de nitrógeno

- Filtrar a través de una jeringa, utilizando un filtro de PTFE de 0,45 µm

- Transferir el extracto, a viales con 2 mL de acetonitrilo HPLC y adicionar una alícuota de

- Inyectar la muestra en el cromatógrafo.

Pesar 50,0 ± 0,5 g de muestra en un tubo de centrífuga de 50 mL

- Agitar en el mismo tubo, durante 30 minutos usando un agitador orbital

- Posteriormente, añadir 15 mL de ácido acético glacial al 1% en acetonitrilo HPLC como

- Extraer una alícuota de 25 mL del sobrenadante y secar en una corriente de nitrógeno

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- Filtrar a través de una jeringa, utilizando un filtro de PTFE de 0,45 µm

- Transferir el extracto, a viales con 2 mL de acetonitrilo HPLC.

- Inyectar la muestra en el cromatógrafo.

4.1.5.2 Preparación de la muestra – Aplica a la solución matriz muestra (libre de plaguicidas)

- Pesar 50,0 ± 0,5 g de muestra en un tubo de centrífuga de 50 mL

- Agitar en el mismo tubo, durante 30 minutos usando un agitador orbital

- Posteriormente, añadir 15 mL de ácido acético glacial al 1% en acetonitrilo HPLC como

- Extraer una alícuota de 25 mL del sobrenadante y secar en una corriente de nitrógeno

- Filtrar a través de una jeringa, utilizando un filtro de PTFE de 0,45 µm

- Transferir el extracto, a viales con 2 mL de acetonitrilo HPLC.

- Inyectar la muestra en el cromatógrafo.

4.1.5.2 Solución Estándar de Propizamida

Pesar aproximadamente 5,00 ± 0,50 mg de estándar de Propizamida, incorporar a un matraz

4.1.5.3 Curva de Calibración de 0,0025 – 0,0200 mg/mL:

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Gráfico 1. Curva de calibración Propizamida

4.1.5.4 Rango de trabajo

Propizamida 0,00025 – 0,00200

4.1.5.5 Exactitud del método

- Preparar 10 soluciones muestra con el método indicado en el punto 4.1.5.1 para la

- Inyectar en triplicado en el equipo cromatográfico y evaluar.

- Criterios de aceptación: Recuperación obtenida: 90 – 110% y %CV entre muestras <2%.

Recuperación %CV Cumple/No Cumple

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