Curso teórico-práctico de HPLC y UHPLC

Agilent, WTC-
Barcelona
Sergio Catalá
Agilent Technologies
Agilent FSE LC-MS
Introducción y Consideraciones Prácticas en
HPLC/UHPLC
Objetivos:
• Introducción parámetros Test
Idoneidad (”System Suitability”).
• Buenas Prácticas para evitar
problemas en U/HPLC.
Idea / Recomendación práctica.

TS “Troubleshooting”

Agilent, WTC-Barcelona
Sergio Catalá
Agilent Technologies
Agilent FSE LC-MS
Introducción: el Objetivo de la Cromatografia
Conseguir separar todos los componentes de la muestra con la mínima
dispersión de la banda cromatográfica, para conseguir la máxima eficacia
y capacidad de separación de picos cromatográficos.

Columna

Inyector Detector
Recomendaciones generales

Utilizar disolventes de alta pureza.

Filtrar fases móviles y muestras a través
de filtros de 0,22µm.
Considerar la miscibilidad, la solubilidad y
el pH (2.3-9.5) de las fases móviles.
Realizar una etapa de lavado entre
muestra y muestra.
Después de un análisis realizar una etapa
de lavado de columna y otra de lavado de
instrumento.
 Tareas Diarias (Antes de empezar)
1100/1200/1260 Series:
· Cambiar las fases móviles.

· Revisar la cantidad de solución de lavado de sellos y de

lavado de aguja (si están instaladas).

· Purgar todos los canales del sistema a un flujo de 5ml/min

durante 15 min.

· Instalar la columna y acondicionar todo el sistema durante

15-20 min.

· Encender la lámpara.
Pág.:
 Tareas Diarias (Antes de empezar) 1290:
· Opción Prime: Ésta opción realiza durante un tiempo estipulado la inyección
de un cierto volumen de fase móvil a una elevada velocidad por todos los canales
del equipo.

· Opción Purge: La opción de purga en éstos instrumentos es automática; no

hay que abrir ninguna válvula, se puede escoger el volumen del flujo y el tiempo
que se quiere realizar.

·Opción Conditioning: Permite eliminar microburbujas de aire que hayan

podido quedar y acondiciona el sistema en las condiciones iniciales que se desee.

Pág.:
Parámetros a monitorizar durante el análisis:

· Presión.

· Rizado de la Presión (Ripple).

· Ruido de la linia de base.

· Tiempos de retención.

· Área/altura y forma de los picos.

 Vista frontal y esquema sistema HPLC 1200

Pág.:
Código de Colores Agilent.

Color I.D.

Red 0.12 mm (0.005 inches)

Green 0.17 mm (0.007 inches)

Blue 0.25 mm (0.01 inches)

Orange 0.50 mm (0.02 inches)

Estrategia para la resolución de problemas en HPLC

Agilent, WTC-Barcelona
Sergio Catalá
Agilent Technologies
1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity Agilent FSE LC-MS
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.

· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.

· Linearidad.

· Ruido en la línea de base.

· Sensibilidad.

· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
 Resolución de problemas:

Pregunta: ¿ El problema es del método (columna, disolvente…)

o del instrumento?
·
Instrumento Método Instrumento o método

· Fuga. · Picos fantasma · Sobrepresión

· Fluctuaciones. · Reproducibilidad

· Sensibilidad

· Picos

· Ruido línia de base

Pág.:
Resolución de problemas Agilent
1100/1200 HPLC
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.

· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.

· Linearidad.

· Ruido en la línea de base.

· Sensibilidad.

· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Sobrepresión:
.
Causas:

· Columna contaminada.

· Frita válvula de purga contaminada.

· Atasco en el mezclador.

· Atasco en la válvula de inyección.

· Atasco en el asiento.

· Atasco en la aguja.

· Atasco en el horno de columnas.

· Atasco en la celda de flujo.

Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.

· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.

· Linearidad.

· Ruido en la línea de base.

· Sensibilidad.

· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Fuga

· Revisar todas las conexiones.

· Fuga en los cabezales de la bomba.

· Fuga en la válvula de inyección.

· Fuga en la válvula de entrada.

· Fuga en la válvula de purga.

· Fuga en la válvula de salida.

17
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.

· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.

· Linearidad.

· Ruido en la línea de base.

· Sensibilidad.

· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Fluctuaciones de presión:
Posibles causas:

· Aire en el sistema.

· Válvula de entrada defectuosa.

· Filtros obturados.

· Válvula de salida defectuosa.

· Desgasificador defectuoso.

Pressure Ripple ≤ 1 %

19
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.

· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.

· Linearidad.

· Ruido en la línea de base.

· Sensibilidad.

· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Reproducibilidad en tiempos de retención:

Causas:

· Bomba
· Válvula de entradadefectuosa.

· Columna
· Fluctuaciones de temperatura.
· Columna defectuosa.

21
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.

· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.

· Linearidad.

· Ruido en la línea de base.

· Sensibilidad.

· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Reproducibilidad en altura y/o área de pico:
Metering device
seal.
· Aguja defectuosa.
Pump.

· Asiento defectuoso.

· Rotor Seal defectuoso.

Column.
Rotor
seal.

23
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.

· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.

· Linearidad.

· Ruido en la línea de base.

· Sensibilidad.

· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Linearidad

Área de los picos no es Meteing device

linear. seal.

Inyector:
• Rotor seal.
• Aguja parcialmente obturada.

Detector:
• Saturación.
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.

· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.

· Linearidad.

· Ruido en la línea de base.

· Sensibilidad.

· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Ruido en la línia de base:

Signal
mAU height.

Noise. Time
.
Causas:

· Aire en el sistema

· Desgasificador defectuoso.

· Pulsos de la bomba.

·Fase móvil en mal estado.

· Celda de flujo sucia.

 Ruido en línea de
base

Parar flujo

yes no

¿Ruido?

Detector Bomba/desgasificador
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.

· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.

· Linearidad.

· Ruido en la línea de base.

· Sensibilidad.

· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
Sensibilidad

Respuesta del detector es

pequeña.

• Insuficiente cantidad de
muestra inyectada.
• Detector:
• Lámpara agotada.
• Celda de flujo sucia.
• Absorción disolvente
elevada.
Problemas más comunes en HPLC:
·Presión
- Sobrepresión.
- Fuga.
- Fluctuaciones de presión.

· Reproducibilidad
- Tiempos de retención.
- Área.

· Linearidad.

· Ruido en la línea de base.

· Sensibilidad.

· Picos.
- Forma no Gaussiana.
- Desdoblamiento.
- Picos fantasma.
 Desdoblamiento de picos:
Coelución de compuestos debido
a que la fase estacionaria de la
columna no está bien
acondicionada y/o está
desgastada. Los compuestos no
interaccionan bien y no se pueden
separar.

Pág.:
 Ensanchamiento de picos:
1 1. URACIL
2. NORTRIPTYLINE
5 COLUMN A Todos los picos anchos
Detector Response

3. DOXEPIN
4. AMITRIPTYLINE (SilGel Silica;
5. TRIMIPRAMINE
Single Endcap)
2 3
4 Initial · Perdida de la eficiencia de la
fase estacionaria de la columna
COLUMN A
After 1826
· Volumen de inyección elevado.
Column Volumes
· Elevada viscosidad de la fase
0 2 4 6 8 10 12 14 móvil.
Time, min.

Ensanchamiento de un solo pico:

· Elución tardía de un compuesto.

· compuesto de elevado peso

molecular (proteína o polímero)

Pág.:
 Colas de pico:
· Interacciones residuales de la fase
estacionaria con alguno de los compuestos.
·
· Compuesto coeluyendo junto con otro.

· Pérdida de eficacia de la fase estacionaria.

· Contaminación de la pre-columna.

Normal. Tailing.

2000

1500

1000 · Volumen de inyección elevado.

500

0
0 5 10 15 20 25

Time (min)

Pág.:
 Picos negativos

Normal. Negative.

Causas:
• La absorbancia de la muestra es inferior a la de la
fase móvil.
• Más común en RID..
• En DAD, la absorción de la referencia es superior a la
absorción de la muestra.

Pág.:
Picos Fantasma

Picos fantasma – Picos que aparecen al inyectar un

blanco.
60
Problema – Fase móvil.

15

30

15

0
3 7 15 17
20% to 100% MeOH Gradient.
No Sample Injected.
Resumen resolución de problemas

• Excluir errores del método.

• Localizar el problema en el instrumento.
• Realizar la reparación.
• Realizar los tests de comprobación.
• Verificar que el problema se ha resuelto.
Mantenimiento HPLC

Agilent, WTC-Barcelona
Sergio Catalá

Agilent Technologies

Agilent FSE LC-MS

38
Áreas de Mantenimiento de un Sistema
HPLC 1200
Maintenance Overview

Solvent inlet Pump Autosampler Detector

Limpiar los filtros. PTFE frita. Aguja. Lámpara.
Sellos. Asiento. Limpiar celda de
flujo
Sello de oro Rotor seal.
Column (OBV)
Compartment
Cambiar el sello Cambiar
del rotor si la sellos si la
válvula de opción de
selección de lavado de
columnas está sellos está
instalada. instalada.
Limpiar: Tests.
Pistones.
.
Tests a Realizar en un sistema HPLC 1200

Bomba Horno de Inyector Detector

Columnas Inyección de un
Test de Test del horno. Test de intensidad.
presión. standard.
Test de ruido de fondo
Test de fugas.
Test Holmio..
 Bomba binária Mantenimiento:
Sellos,
Válvula de entrada
Válvula de salida,
Válvula de purga,
Pistones.

Válvula de selección de disolventes (Opcional).

Cabezales de la bomba
Cabezal de la bomba

Outlet ball valve.

Purge valve.

Plunger housing.
Active inlet valve.
Lock Purge
Pump head. Outlet
screw. valve.
ball
valve.
Se
Support als
rings. .

Pist Active
ons. inlet
valve.
Cabezales con lavado de sellos

Seal keeper.
Tubing.
Gasket.
Peristaltic Pump.
Wash seals.

Seal support ring.

Gaske
t.

Wash Seal.

Seal
support
ring.
Válvula de purga

1. Separar la válvula de purga del

cabezal.
2. Sacar el sello de oro.
3. Sacar la frita antigua.
1. Instalar la nueva frita.
2. Instalar el sello de oro nuevo.
3. Reinstalar la válvula de purga.

PTFE frit.

Gold Seal.
Plastic cap.
Limpiar o intercambiar la válvula de salida

Binary pump OBV. 1. Desconectar el capilar de la válvular

de salida.
2. Desconectar la válvula de salida del
cabezal.
3. Sacar el sello de oro.
a. En las bombas binarias, cambiar el
filtro.
• Sonicar la válvula durante 15 min.
• Cambiar el sello de oro.
Valve housing. • Reinstalar la válvula de salida.

Gold Seal.

Plastic cap.
Válvula de entrada

1. Desenchufar el cable de la válvula.

2. Separar la válvula del cabezal.
3. Cambiar el cartucho.
4. Instalar la válvula en el cabezal.
6. Conectar el cable.

Cartridge.
Cabezal de la bomba

1. Desconectar todos los

capilares.
2. Desenchufar el cable
4 mm screw. de la válvula de
4 mm screw.
entrada.
Lock Purge
Outlet
ball
screw. valve. 3. Sacar los dos tornillos.
valve.
Se
als
4. Extraer el cabezal del
Suppor
t rings. . modulo..

Pist Active
ons. inlet
valve.
¿La bomba está bien?

Pump Ripple estable.

Test de presión.

Inyección de un estándar:
· Tiempo de retención acceptable.

· Área aceptable.
Mantenimiento del Inyector
Vista frontal del inyector

Cambiar el sello del rotor.

Cambiar la aguja.

Cambiar el asiento.

Limpiar las guías.

Realizar el test de presión.

Aguja/asiento Válvula de
inyección
Válvula de inyección
7

6
5
4
3
2
1

Injecton
Valve 1. Stator screws
2. Stator head Tools:
3. Stator face Hexagonal key.....9/64
4. Stator ring inch
5. Rotor seal (Vespel or
Tefzel) Wrench.................1/4 inch
6. Isolation seal
7. Valve body
Cambiar el sello del rotor

1. Desconectar todos 2. Separar el cabezal de la válvula y el filtro

los capilares y los tres del soporte.
tornillos.

Stator ring

Stator face

Stator head

3. Sacar el sello del rotor. Isolation seal

4. Instalar el aislante.
5. Instalar el nuevo sello. Rotor seal
Replacing the Rotor Seal – Part Two
6. Instalar el soporte. 7. Instalar el filtro en el cabezal de la
válvula.

8. Poner los tornillos en el 9.Reconectar los capilares.

cabezal.
2. Meetering
1.Bomba
Device

3.Bloqueado 6. Columna

4.Waste Asiento
Cambio de aguja y asiento

Antes de empezar se ha de seleccionar en el software la

opción de cambio de aguja (ChemStation/ Lab Advisor):

Instant Pilot: Lab Advisor:

Service and Diagnostics

Maintenance
Cambiar la aguja
1. Seleccionar la opción 2. Desconectar el loop de
Needle down en el inyección.
software.

3. Desconectar la aguja. 4. Instalar la aguja nueva.

Cambio de asiento
Antes de empezar se ha de seleccionar en el software la
opción de cambio de aguja (ChemStation/ Lab Advisor):

1. Desconectar el 2. Con un 3. Insertar el nuevo

capilar del asiento en la destornillador asiento.
válvula de plano sacar el
inyección.(port 5). asiento.
 Detectores Diode Array y
Longitud de onda variable.
Cambio de lámpara

Paso 1: Sacar los dos tornillos que

Tungste Deuteriu Detector cell sujetan la lámpara.
n lamp m lamp
Paso 2: Instalar la lámpara nueva.
Paso 3: Realizar tests específicos del
detector.
Preguntas

Agilent, WTC-
Barcelona
Sergio Catalá
Agilent Technologies
Agilent FSE LC-MS