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Crioconservación de diferentes especies de hongos entomopatógenos

Conference Paper · November 2015

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Roberto Montesinos-Matías Miguel Angel Ayala-Zermeño

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Angélica María Berlanga-Padilla

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LEÓN, GUANAJUATO. 5 Y 6 DE NOVIMEBRE DE 2015
 
 
CRIOCONSERVACIÓN DE DIFERENTES ESPECIES DE HONGOS
ENTOMOPATÓGENOS

Roberto Montesinos-Matías, Miguel Ángel Ayala-Zermeño, Angélica Berlanga-Padilla

Adrien Gallou y Hugo César Arredondo-Bernal.
Centro Nacional de Referencia de Control Biológico. SENASICA-DGSV. Km 1.5, Carretera
Tecomán-Estación FFCC. C.P. 28120. Tecomán, Colima, México.
montesinosroberto@yahoo.com.mx

Resumen. La transferencia periódica se utiliza con frecuencia para la conservación de hongos

filamentosos, sin embargo, su práctica está propensa a la contaminación, consume tiempo, y no
impide los cambios genéticos y fisiológicos durante el mantenimiento a largo plazo. Varios
métodos han sido desarrollados para eliminar estas desventajas. No obstante que la conservación
a largo plazo se puede lograr de varias maneras, la elección de la metodología puede ser un
problema. La crioconservación basada en la suspensión del metabolismo por las bajas
temperaturas, esta reportada que asegura la retención de las características morfológicas de los
hongos, además de la estabilidad genética. Se evaluó ocho especies de hongos entomopatógenos
(HE) con el protocolo de crioconservación (-70 y -196°C) utilizado en la Colección de Hongos
Entomopatógenos (CHE) del Centro Nacional de Referencia de Control Biológico (CNRCB). De
las características fenotípicas observadas, la inmersión en nitrógeno líquido sugiere que es el
método más seguro para la conservación de los HE.

Palabras clave: crioconservación, viabilidad, esporulación, fenotipo.

Introducción

Los hongos entomopatógenos (HE) de diferentes especies frecuentemente requieren métodos

especiales de conservación para asegurar su viabilidad, pureza e integridad genética (López-
Lastra et al. 2002). En la Colección de Hongos Entomopatógenos del CNRCB (SENASICA-
SAGARPA) los aislados se mantienen en Agar Dextrosa Sabouraud (ADS) al 1% y 4% o medios
suplementados con cutícula de insecto (1%). Como parte de la implementación de los
lineamientos enumerados por la Federación Mundial de Colecciones de Cultivo (World
Federation for Culture Collection, WFCC 2010), en la CHE, se está respaldando la colección en
dos métodos de conservación, principalmente la liofilización y la crioconservación, estos
métodos están reportados que minimizan el riesgo de cambios genéticos (WFCC 2012). Se está
considerando que para aquellas cepas que no toleren estas técnicas, se opte por métodos alternos
como gel de sílice, aceite mineral o agua destilada estéril. La crioconservación es la preservación
de material biológico a bajas temperaturas, en el intervalo de -20 a -196°C. El uso de nitrógeno
líquido permite alcanzar la temperatura prácticamente más baja disponible. A la temperatura de
equilibrio, la difusión molecular es extremadamente lenta y la probabilidad de que ocurran
reacciones químicas es prácticamente nula. Se busca que el método de crioconservación garantice
la conservación de las características fenotípicas y genotípicas de las cepas de la colección, de
manera que puedan estar disponibles cuando el material biológico sea requerido como insumo
durante las estrategias de evaluación para el control de plagas de importancia fitosanitaria
implementados por el SENASICA.

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La transferencia periódica en medio de cultivo es el método más utilizado para mantener aislados
de microorganismos con el cual no se requiere equipo específico, el mantenimiento puede
realizarse en refrigeración, factor que tiene una estrecha relación con el tiempo de viabilidad del
material, lo cual además depende del desarrollo del hongo y sus requerimientos nutricionales
(Humber 2012). Algunas desventajas de la transferencia periódica son: la posibilidad de la
pérdida de la identificación del microorganismo después de cierto número de transferencias de
nombres o designaciones de los cultivos; el riesgo de contaminación y de cambios genéticos que
se incrementa a mayor número de transferencias; la posible inoculación con el microorganismo
equivocado cuando se realiza la resiembra de una serie de cepas; el riesgo de pérdida del cultivo
cuando se trabaja con hongos que requieren nutrientes específicos y no se realizan transferencias
periódicas a medios frescos oportunamente y la deshidratación del medio de cultivo. Además, si
maneja un gran número de microorganismos el trabajo es continuo y se requiere un espacio
considerable para el almacenamiento (Smith y Onions 1994, Jenkins y Grzywacz 2003). La
ventaja de esta técnica es que se pueden mantener prácticamente todas las especies de hongos. En
contraste, el método de crioconservación minimiza los riesgos de cambios genéticos y las
desventajas que ofrece la transferencia periódica.

El objetivo de este estudio fue evaluar la crioconservación de nueve especies de HE en términos

de pureza, viabilidad, y características morfológicas, además de la estabilidad genética, a
diferentes tiempos de evaluación (1, 2, 3, 4 y 5 años).

Materiales y Métodos

Los hongos seleccionados para evaluar el método de crioconservación se muestran en el Cuadro

1. Se utilizaron especies de hongos entomopatógenos representativos de la CHE del CNRCB,
entre ellos algunas son utilizadas por la Dirección General de Sanidad Vegetal para el control de
plagas de importancia fitosanitaria, como la langosta (CHE-CNRCB 213) y el Psílido Asiático de
los Cítricos (CHE-CNRCB 224).

Los hongos se propagaron en cajas de Petri con medio de cultivo ADS, se incubaron a 27°C hasta
alcanzar su esporulación (Montesinos-Matías et al. 2015). Previo al proceso de crioconservación
se esterilizaron crioviales conteniendo 1.3 mL de glicerol al 10% (v/v). Se obtuvieron bloques
circulares del cultivo esporulado utilizando popotes estériles, en cada vial se colocó tres bloques
circulares del cultivo, con ayuda de una aguja estéril (Montesinos-Matías et al. 2015). Se aseguró
que los bloques circulares se sumergieron completamente en el glicerol (10%). En cada tiempo de
evaluación (1, 2, 3, 4 y 5 años) se consideró viales por triplicados. Para la conservación a -196°C,
se utilizaron criotubos NUNCTM (Simione 2009). Los crioviales se dejaron reposar entre 2 y 12
horas a 4°C, para permitir la difusión del crioprotector al interior de las células, proceso
denominado “curado” (Humber 2012).

Después de una semana de permanecer almacenados en crioconservción, se recuperó un vial a las

diferentes temperaturas de evaluación para valorar las características propias del
entomopatógeno, como medida de control de calidad.

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El estudio de estabilidad genética está en proceso de análisis con la técnica de huella genética
“Amplified Fragment Length Polymorphism” (AFLP, por sus siglas en inglés) por parte del
Laboratorio de Biología Molecular del CNRCB.

Resultados

En la Cuadro 1 se muestra los resultados de pureza, viabilidad y esporulación de los hongos

almacenados en crioconservación a -70°C y en nitrógeno líquido (-196°C), a los dos años de
estudio. Las cepas almacenadas a -70°C, fue posible recuperar el 80% con buen crecimiento y
esporulación, se incluye a Beauveria bassiana, Metarhizium acridum, M. anisopliae, Isaria
javanica e Isaria fumusorosea. La cepa de Hirsutella citriformis mostró un crecimiento lento y
levaduriforme, formando sectores estériles en las placas de cultivo. Los hongos Lecanicillium
lecanii y Nomuraea rileyi no fue posible recuperarlos en estas condiciones de evaluación.

Cuadro 1. Viabilidad y esporulación de los hongos almacenados durante 2 años en crioconservación.

-70 °C -196°C
Viabilidad Viabilidad
No. Especies de hongos Acrónimo y pureza Esporulación y pureza Esporulación
1 Metarhizium anisopliae CHE-CNRCB 224 + b + b
2 M. acridum CHE-CNRCB 213 + b + b
3 Beauveria bassiana CHE-CNRCB 80 + b + b
4 B. bassiana CHE-CNRCB 169 + b + b
5 Hirsutella thompsonii CHE-CNRCB 327 + b + b
6 H. citriformes CHE-CNRCB 335 + d + b
7 Isaria fumosorosea CHE-CNRCB 293 + b + b
8 I. javanica CHE-CNRCB 305 + b + b
9 Lecanicillium lecanii CHE-CNRCB 351 - - 1/3ˤ b
10 Nomuraea rileyi CHE-CNRCB 354 - - + b
Evaluación del crecimiento del hongo entomopatógeno después de su recuperación del método de conservación: +: se recuperó el aislamiento
puro (viabilidad); -: no se recuperó el aislamiento; d: débil crecimiento micelial y esporulación; b: buen crecimiento y esporulación; c:
aislamiento contaminado: * en evaluación. ˤ Se recuperó el hongo únicamente de un vial de tres evaluados.

La respuesta a la crioconservación de las cepas almacenados en nitrógeno líquido fue muy

favorable para la retención de las características morfológicas, se recuperó el 100%. La cepa de
L. lecanii presentó un crecimiento lento al inicio del cultivo (se recuperó únicamente en un vial
de tres), primeros 6 días, posteriormente mejoró su crecimiento (Fig. 1). En una comparación
global de los aspectos de crecimiento para cada cepa sometida a las dos condiciones de
crioconservación, el uso de nitrógeno líquido evidenció una mejor recuperación de cada hongo
almacenado.

Discusión

La selección del método para la conservación de un microorganismo, depende del propósito o

aplicación del mismo, la inversión con que se cuente, el equipo y las instalaciones disponibles;
por lo que se deben consideran alternativas de corto, mediano y largo plazo. Sin embargo, es
importante considerar que los microorganismos difieren en su tolerancia a los métodos de
conservación, a no ser que una colección sea muy especializada y que un método provea

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condiciones óptimas para todas sus cepas, además la elección dependerá de las ventajas y
desventajas que ofrezcan las diferentes técnicas (Snell 1984).

a   b   c   d  

e   f   g   h  

Figura 1. Macromorfología de especies de hongos recuperados de nitrógeno líquido. a) Lecanicillium lecanii; b)

Metarhizium anisopliae; c) Isaria fumosorosea; d) Nomuraea rileyi; e) Beauveria bassiana; f) Hirsutella thompsonii;
g) M. acridum y h) H. citriformis. Cultivos desarrollados en placas de Petri de 90 mm.

La crioconservación es un método efectivo y estable para almacenar organismos por tiempos

prolongados. En este estudio las cepas almacenadas en nitrógeno líquido mostraron cambios
menores en sus características típicas de crecimiento (morfológicas), en comparación con el
almacenamiento a -70°C. El hongo L. lecanii mostró una mayor susceptibilidad a la
crioconservación en nitrógeno líquido, seguido de H. thomsonii. Las dos temperaturas de
crioconservación influyen en la viabilidad de los hongos evaluados, estas variantes afectan la
preservación del material biológico. L. lecanii que resultó susceptibles a la crioconservación, se
recuperó del método de conservación en agua destilada estéril, con buen aspecto en sus
características de crecimiento (datos no publicados, evaluación en paralelo con este estudio). Las
especies que resultaron susceptibles al método de crioconservación, sugiere el uso de métodos
alternativos como agua destilada estéril o gel de sílice para su preservación.

Esta evaluación indican que un programa de criopreservación demanda la estandarización del

método empleado a seguir para elegir un método compatible para el hongo que se desea
preservar. Por la complejidad del proceso de crioconservación pequeñas variantes durante la
puesta en marcha del método pueden conducir a cambios drásticos en el material biológico.
Además, la estandarización de la metodología asegura que los resultados de investigación sean
consistentes y comparables. Por lo tanto, una vez que un régimen de crioconservación es
establecido se debe registrar detalladamente la metodología (Simione 2009). En este estudio se
tiene considerada la evaluación del método de crioconservación para hongos entomopatógenos
hasta por cinco años, además se están ejecutando estudios complementarios de estabilidad
genética, para validar los métodos utilizado en la CHE del CNRCB.

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Literatura citada

Humber, R.A. 2012. Preservation of entomopathogenic fungal cultures, p. 317-328. In: Lacey
L.A. (Ed.). Manual of techniques in insect pathology. 2nd. Edition. Academic Press. Yakim,
Washington, USA. 484 p.

Jenkins, N.E., Grzywacz, D. 2003. Towards the standardization of quality control of fungal and
viral biocontrol agents, p. 247-264. In: van Lenteren J.C. (Ed.). Quality control and production of
biological control agents: theory and testing procedures. CAB International, Wallingford,
London, UK.

López-Lastra, C.C., Hajek, A.E., Humber, R.A. 2002. Comparing methods of preservation for
cultures of entomopathogenic fungi. Canadian Journal of Botany 80: 1126-1130.

Montesinos-Matías R., Ayala-Zermeño, M.A., Berlanga-Padilla, A.M. 2015. Manual para

conservación y mantenimiento de hongos entomopatógenos. SENASICA. 59 p.

Simione, F.P. 2009. Thermo Scientific Nalgene and Nunc Cryopreservation Guide. Thermo
Fisher Scientific Inc. Wyman, USA. 12 p.

Smith, D., Onions, A.H.S. 1994. The preservation and maintenance of living fungi. 2a. Edition.
International Mycological Institute. CAB International, UK. Wallingford, Oxon, UK. 122 p.

Snell, J. S. 1984. General Introduction to maintenance methods. pp: 11-21. In: Kirsop, B.E.,
Snell, J.J.S. (Eds). Maintenance of microorganisms. A manual of laboratory methods. Academic
Press Inc. Londres, UK.

World Federation for Culture Collection (WFCC). 2010. Guidelines for the establishment and
operation of collections of cultures of microorganisms. 3rd Edition. Brussels, Belgium. 19 p.

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