TEMA 1 “SEGURIDAD EN EL LABORATORIO”

A la hora de diseñar un laboratorio de microbiología es importante la distribución de los

espacios y las áreas de trabajo. Para ello el microbiólogo le da criterios específicos al
arquitecto.
En un laboratorio de microbiología no puede incidir directamente la luz solar, pues
puede dañar las muestras. Por ello, la iluminación es artificial (100 footcandle).
La ventilación es artificial (aire acondicionado) pues las ventanas están cerradas para
evitar intercambios de aire entre el exterior y el laboratorio. La temperatura oscila entre
21 y 23 ºC y la humedad es cercana al 50%.

La zona de preparación de medios de cultivo y la zona de descontaminación están

separados de la zona de trabajo. También ha de hacer una zona de lavado de material.
Las poyetas (mesas de trabajo) pueden tener varias alturas según se quiera trabajar de
pie (90 – 95 cm) o sentado (65 – 80 cm) y han de ser superficies no rugosas y
fácilmente descontaminables.
Existen áreas de almacenamiento para las muestras (refrigerador o congelador) y para
los reactivos. También hay fregaderos con agua caliente y fría. Para obtener agua
destilada se puede utilizar ósmosis inversa, destilación, filtración o intercambio iónico.
Por último, es de vital importancia la presencia de equipos de seguridad tales como
lavaojos, duchas, extintores, alarmas de fuego y humo…

El personal está expuesto a agentes infecciosos que entrañan un determinado riesgo.

Con el objetivo de minimizar al máximo estos riesgos, se adoptan unas normas de
seguridad. Estas normas afectan al diseño del edificio, el equipamiento y los planes de
seguridad y organización interna.
En un laboratorio estamos expuestos tanto a agentes biológicos como no biológicos y
hemos de emplear cualquier instalación, dispositivo o sistema que sirva para reducir el
riesgo antes, durante y después de la sesión de trabajo.
El riesgo de sufrir un accidente derivado de un agente biológico depende del huésped
susceptible (estado de salud del biólogo), de la concentración que se encuentra dicho
microorganismo y de las vías de transmisión:
- oral: errores de pipeteo, fumar, comer, beber, ingerir caldos dispensados en
envases de bebidas, falta de higiene usando cultivos puros de bacterias muy
infectivas
- contacto con mucosas y piel: salpicaduras en cara y ojos
- aérea: enfriar asas calientes hundiéndolas en el agar, centrífugas no herméticas
donde se emplean tubos no cerrados, pipetear con demasiada fuerza, oler las
placas, agitar tubos
- parenteral: inoculación accidental con una jeringa o con objetos cortantes

Clasificación de agentes biológicos

Agente biológico: microorganismo, con inclusión de los genéticamente modificados,
cultivos celulares y endosporas susceptibles de originar cualquier tipo de infección,
alergia o toxicidad.
Grupo 1: poca probabilidad de causar enfermedad en el hombre. Bajo riesgo para el
individuo y la comunidad. Ej: bacterias de la industria alimentaria
Grupo 2: puede causar enfermedad en el hombre con escaso peligro de propagarse a la
comunidad, existiendo profilaxis o tratamiento eficaz. Moderado riesgo individual y
riesgo comunitario limitado. Ej: sarampión
Grupo 3: puede causar una enfermedad grave en el hombre y presenta un serio peligro
para los trabajadores, con riesgo de que se propague a la comunidad, existiendo
generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Alto riesgo individual y bajo riesgo para
la comunidad. Ej: rabia
Grupo 4: aquel que causando una enfermedad grave en el hombre supone un serio
peligro para los trabajadores, y con muchas probabilidades de que se propague a la
comunidad. No existe generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Alto riesgo para el
individuo y la comunidad. Ej: virus del Ébola

Para minimizar ese riesgo existen una serie de barreras:

- Barreras primarias (equipo de seguridad): CSB, batas, mascarillas, guantes…
- Barreras secundarias (diseño y construcción de la instalación): aire
acondicionado, autoclave…
Niveles de contención (métodos que hacen seguro el manejo de materiales infecciosos
en el laboratorio):
- Nivel de contención 1
- Nivel de contención 2
- Nivel de contención 3: cuando se manipula con microorganismos que cursan con
patología grave, de difícil y largo tratamiento que pueden curar con secuelas y
ocasionalmente producir la muerte
- Nivel de contención 4: cuando se procesa con certeza (o se sospecha) un agente
especialmente patógeno e infectocontagioso, exótico o no, que produce alta
mortalidad y para el que no existe tratamiento y/o es poco fiable

Normas a seguir en un laboratorio:

- Limitar el acceso
- Marcar las áreas con la señal de riesgo biológico y su nivel de contención
- Cerrar puertas y ventanas
- Limpiar y desinfectar superficies de trabajo
- No utilizar los pasillos como almacén (dejar espacio libre para evacuar en caso
de emergencia)
- Transportar las muestras en cajas, nunca en la mano
- Utilizar ropa protectora. Esta nunca deberá ser sacada fuera de la zona de trabajo
en niveles de contención 3 o 4, y si se quita debe ser desechada automáticamente
en una bolsa de material contaminado
- Usar guantes desechables que no deben ser sacados de la zona de trabajo. Tras
quitárselos hay que lavarse las manos
- Nadie podrá trabajar en una zona de tuberculosis con una prueba de Mantoux
negativa
- No debe usarse lentes de contacto
- No debe colocarse papel en la zona de trabajo
- El personal con el cabello largo debe llevarlo recogido
- Debe limitarse el uso de agujas hipodérmicas y jeringas. Solo deben usarse las
unidades ya montadas. Nunca se debe volver a poner la capucha, sino
depositarlas en contenedores
BARRERAS PRIMARIAS:
Equipos o prendas de protección personal:
- Protectores de ojos  gafas de seguridad, pantallas faciales (obligatorio frente al
uso de luz UV)
- Protectores de manos y brazos  guantes, manguitos
- Protección respiratoria  mascarillas, máscara
- Protectores del cuerpo  batas (con puño elástico), delantales
- Protección auditiva
Cabinas de seguridad: son cabinas de circulación forzada que, según sus
especificaciones y diseño, proporcionan diferentes niveles de protección.
- Cabinas de flujo laminar: recintos que emplean un ventilador para forzar el paso
de aire a través de un filtro HEPA que atrapan partículas de hasta 0,3 micras
- Vertical  protección del producto y básica del operador (muestras
biológicas no patógenas, cultivos celulares y de tejidos) [1]
- Horizontal  protección del producto pero no del operador (muestras en
clínica hospitalaria, cultivo de tejidos vegetales) [2]
- Cabinas de seguridad biológica (CSB): son recintos ventilados, diseñados para
proteger al operador, el medio ambiente y, en algunos casos, el material.
Disponen de dos sistemas que impiden la salida de contaminación (flujo de aire
laminar y filtros HEPA)
- Clase I: cámaras cerradas con entrada de aire desde el operador y sale a
través de unos filtros HEPA. No protege el producto (agentes biológicos de
riesgo moderado) [3]
- Clase II: el aire pasa a la entrada y salida por filtros HEPA. Protección del
producto (agentes biológicos 1, 2 y 3). Dos tipos: A (recircula el 70%) y B (más
segura, recircula el 30%) [4]
- Clase III: recintos herméticos con presión negatica, entrada mediante
guantes, entrada de aire mediante un filtro HEPA y dos filtros a la salida,
extracción del aire del 100%. [5]

[1] [2] [3]

[4] [5]
BARRERAS SECUNDARIAS:
Contribuye a la protección del propio personal del laboratorio
Proporciona una barrera para proteger a las personas que se localizan fuera del
laboratorio
Protege a la comunidad frente a posibles escapes de agentes infecciosos

Recomendaciones:
Localización: fuera del tráfico del hospital, que no sea lugar de paso para cafeterías,
bibliotecas…
Acceso del personal restringido: nivel 2 (puerta con llaves) y nivel 3 (doble puerta)
Lavabo: debe existir uno en el mismo laboratorio, accionado sin usar las manos y
preferentemente cerca de la salida
Lavaojos: deben de estar próximos a las duchas de seguridad, ya que los accidentes
oculares suelen ir acompañados de lesiones cutáneas
Superficies interiores impermeables y resistentes a productos químicos
Superficies de trabajo resistentes al calor moderado y a disolventes orgánicos
Señalización de peligro biológico
Presión negativa del laboratorio
Filtros HEPA: cambiarlos cada 6 meses por una empresa especializada

Gestión de residuos
Se clasifican en: inespecíficos (cartón, papel, basura orgánica…) y específicos
(mutágenos, pilas de botón, termómetros)
Los residuos líquidos no infecciosos se tiran por el fregadero, mientras que los
infecciosos se depositan en una cubeta con lejía.
Los residuos sólidos se incineran o esterilizan. Los objetos punzantes se depositan en
recipientes especiales.
Los únicos residuos químicos que pueden tirarse por el desagüe son los ácidos y bases
inorgánicos (previa neutralización).
 TEMA 2 “DIVERSIDAD DEL MUNDO MICROBIANO”
La microbiología es la ciencia que estudia a los microorganismos (seres vivos solo
visibles bajo el microscopio). Bajo este criterio de tamaño, quedan incluidos seres muy
distintos en diferentes aspectos.
La microbiología estudia seres procariotas (bacterias), eucariotas (hongos como
levaduras y mohos, protozoos, algas microscópicas) y virus.
Dos características únicas de la microbiología son la gran diversidad de seres que
estudia y el uso de una metodología propia (microscopio, cultivos puros, esterilización,
técnicas de asepsia).
La diversidad en los microorganismos se expresa de muchos modos: tamaño y
morfología; estrategias metabólicas; movilidad; patogenicidad; adaptación a
condiciones ambientales; filogenia… De los tres dominios de seres vivos, dos son
procarióticos (Bacteria y Archaea)

El microscopio óptico sirve para observar células a bajos aumentos. El más usado es el
de campo claro, por lo que necesitaremos de técnicas de tinción para la observación de
las bacterias con microscopía óptica. También se pueden usar microscopios de contraste
de fases, de campo oscuro o de fluorescencia. El microscopio electrónico se usa para
observar estructuras internas, detalles superficiales de la célula y virus.

El tamaño de las células procarióticas varía desde las más pequeñas (1,2 µm), pasando
por las medianas (3 µm) y llegando a las más grandes, que suelen ser las algas (50 µm).
Sin embargo se han observado procariotas gigantes que alcanzan los 750 µm.

Una célula procariota es capaz de tener una vida independiente. Su esquema se reduce a
obtener sustancias del medio, transformarlas y reproducirse. Ocasionalmente las
bacterias se encuentran en poblaciones que contienen millones de individuos.

ESTRUCTURA GENERAL
Envolturas: membrana citoplasmática, pared celular y cápsula (opcional)
Citoplasma: nucleoide, ribosomas 70S e inclusiones (opcionales)
Proyecciones proteicas al exterior: flagelos, fimbrias y pelos (todas opcionales)

La membrana citoplasmática es muy parecida a las membranas eucarióticas (doble

membrana lipídica con los grupos hidrófobos orientados hacia el interior y los hidrófilos
hacia el exterior). Sin embargo, cobra mayor importancia ya que cumple las funciones
de transporte de nutrientes y es el principal centro metabólico de la célula. En ella se
incrustan proteínas encargadas de los sistemas respiratorios, fotosintéticos…
Una de las primeras clasificaciones de bacterias es la distinción entre Gram + y Gram –.
Esto fue descubierto por Christian Gram en 1884 mientras realizaba la tinción de Gram.
- Paso 1: aplicar cristal violeta  todas las células se tiñen
- Paso 2: añadir un mordiente (lugol) para ayudar a retener el cristal violeta
- Paso 3: añadir un decolorante (alcohol)  las células Gram + mantienen el
colorante, pero las Gram – lo pierden
- Paso 4: añadir otro colorante (safranina)  las Gram + siguen teñidas de violeta
y las Gram – se tiñen de rojo
Esto se explica por los distintos tipos de pared celular. La pared celular de las Gram +
poseen una gruesa capa de peptidoglicanos que hace que se retenga el colorante. Las
Gram – también la tienen, pero mucho más delgada, por lo que pierde el colorante.
Las Gram – tienen una membrana externa de lipopolisacáridos que no tienen las Gram
+.

En el citoplasma de una célula procariota encontramos el nucleoide, que es la región

donde se encuentra el cromosoma enrollado. También puede tener fragmentos de ADN
que no son vitales, pero sí pueden otorgarle ciertas ventajas, como puede ser la
resistencia a antibióticos.
Encontramos ribosomas 70 S y orgánulos como endosporas o vesículas de gas.

La cápsula es un material polisacárido que aumenta el factor de virulencia de una

bacteria.
Los flagelos tienen función de movilidad; las fimbrias de adhesión y los pili (pelos) de
conjugación.
Las bacterias pueden tomar distintas formas y agrupaciones:
 OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS
La mayoría de los procariotas son muy pequeños y contrastan muy poco con el medio,
por lo que han de ser teñidas (excepto los microorganismos pigmentados).
Se pueden observar las muestras en fresco (sin teñir), pero este método es poco
adecuado a la hora de observar las muestras.

Para teñir un microorganismo tenemos tres formas:

TINCIÓN SIMPLE: consiste en la tinción con colorantes básicos. Los colorantes
básicos son atraídos por la bacteria, dada la carga negativa neta de esta. Ej: azul de
metileno
TINCIÓN NEGATIVA: consiste en la tinción con colorantes ácidos. Los colorantes
ácidos son repelidos por la bacteria y se pone de manifiesto el medio en que se
encuentran. Ej: eosinato
TINCIÓN DIFERENCIAL: distintas técnicas que nos ponen de manifiesto el tipo de
microorganismo que estamos observando. Ej: tinción de Gram

Para la tinción primero se prepara el frotis mediante la extensión de una fina capa de
muestra sobre el portaobjetos y se deja secar al aire. Posteriormente se fija por calor
mediante el flameado del portaobjetos. Es importante que la muestre esté seca para no
dañar los componentes celulares.
Después se le añade el colorante, se lava con agua el exceso y se deja secar al aire para
posteriormente observar la muestra al microscopio (objetivos de 40x y 100x)
 TEMA 3 “REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES Y MEDIOS DE
CULTIVO”
Los microorganismos están presentes en todos los lugares de la Tierra capaces de
mantener la vida. Así, definimos hábitat microbiano como el lugar donde vive una
población microbiana.
Para cultivar los microorganismos en el laboratorio es necesario proporcionarles todos
los nutrientes que necesitan en cantidades adecuadas y unas condiciones ambientales
parecidas a las de sus hábitats naturales.

Los microorganismos se clasifican según:

Diferentes opciones para obtener energía:
QUIMIOTROFOS (obtienen energía a partir de compuestos químicos)
- Quimioorganotrofos  estos compuestos son orgánicos (glucosa, acetato…)
- Quimiolitotrofos  estos compuestos son inorgánicos (H2S, Fe2+, NH4+)
FOTOTROFOS (obtienen energía a partir de la luz)

Diferentes opciones para obtener el carbono:

AUTÓTROFOS (obtienen el carbono a partir de CO2)
HETERÓTROFOS (obtienen el carbono a partir de materia orgánica)

Los quimiorganotrofos son heterótrofos. Muchos quimiolitotrofos y todos los fototrofos

son autótrofos.

Los nutrientes son la materia prima a partir de la cual se obtienen energía y metabolitos
necesarios para sintetizar los componentes celulares. Se dividen en:
MACRONUTRIENTES: aquellos que hacen falta en una proporción mayor del 95%
C, O, H  a partir de la materia orgánica y de la inorgánica (CO2)
N  a partir de la materia orgánica (proteínas) y de la inorgánica (NO 3, NH4)
P  a partir de fosfatos. Necesario para la síntesis de ácidos nucleicos y fosfolípidos
S  a partir de SO42-, SH-. Necesario para la síntesis de algunos aminoácidos
K  a partir de iones o sales. Necesario para la actividad enzimática
Ca  a partir de iones o sales. Necesario para termorresistencia de la espora
Mg  a partir de iones o sales. Necesario para la estabilidad de los ribosomas
Fe  cofactor de enzimas y proteínas transportadoras de electrones; forma parte de los
citocromos

MICRONUTRIENTES: aquellos que están en cantidades traza. Forman parte de

enzimas y cofactores.

FACTORES DE CRECIMIENTO: se trata de compuestos que son necesarios y que no

pueden sintetizar (vitaminas, aminoácidos, bases nitrogenadas, sangre...)

Un microorganismo es prototrofo cuando es capaz de sintetizar todos estos elementos;

es auxotrofo cuando es incapaz de sintetizar un elemento.
 MEDIOS DE CULTIVO
Son soluciones de nutrientes para cultivar microorganismos en el laboratorio.
MEDIOS QUÍMICAMENTE DEFINIDOS (o sintéticos): aquellos en los que se conoce
la composición química exacta
MEDIOS COMPLEJOS: contienen todos los ingredientes necesarios para el
crecimiento del microorganismo, pero su composición química exacta se desconoce
(hidrolizados de productos animales o vegetales  peptona, extracto de carne…)

MEDIOS LÍQUIDOS O CALDOS

MEDIOS SEMISÓLIDOS: agar al 0,4 – 0,8 %
MEDIOS SÓLIDOS: agar al 1,5 – 2 %. Inmovilizan a las células y, al crecer, forman
masas aisladas visibles a las que llamamos colonias.

MEDIOS ENRIQUECIDOS: base nutritiva común + componentes especiales (sangre,

suero, extracto de tejidos animales o vegetales). Proporcionan componentes adicionales
que necesitan los microorganismos exigentes. Ej: agar sangre, BHI
MEDIOS SELECTIVOS: contiene compuestos (sales biliares, cloruro sódico,
colorantes, antibióticos) que inhiben selectivamente el crecimiento de algunos
microorganismos pero no de otros. Ej: MSA, MacConkey
MEDIOS DIFERENCIALES: tiene algún compuesto frente al cual los microorganismos
reaccionan de manera diferente (ej: fuente de carbono metabolizable por algunas
bacterias y no por otras). Un indicador de pH permite detectar visualmente la
producción de ácidos o bases producidos por los diferentes tipos de colonias durante el
metabolismo del compuesto diferencial. Ej: MSA, MacConkey
MEDIOS ENRIQUECIDOS Y DIFERENCIALES (AGAR SANGRE): se emplea para
el cultivo y aislamiento de microorganismos en general y, de modo particular, de
aquellos que son especialmente exigentes en cuanto a sus requerimientos de factores de
crecimiento. La sangre permite, además, la detección de microorganismos hemolíticos.

Los microorganismos pueden ser no exigentes, exigentes, fastidiosos o no cultivables.

Para conservar los microorganismos podemos utilizar:

- refrigeración: almacenamiento a baja temperatura (2 a 6ºC). Corto plazo.
Transferencias al menos una vez al año. Riesgo alto de contaminación
- congelación: -20 a -80ºC en congeladores; -196ºC en nitrógeno líquido. Alto
porcentaje de muerte durante el proceso de congelación/descongelación. Uso de
crioprotectores. Viables la preservación durante varios años
- liofilización: congelación y desecación. Adición de agentes protectores (leche
descremada o sacarosa) que reduce la mortalidad. Viables la preservación
durante un tiempo ilimitado.
 TEMA 4 “FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO MICROBIANO
Y TÉCNICAS DE CULTIVO EN EL LABORATORIO”
Los requerimientos para el crecimiento microbiano pueden dividirse en dos grandes
categorías principales: químicos (nutrientes y tipos de medios de cultivo) y físico-
químicos (temperatura, pH, concentración y oxígeno)

OXÍGENO MOLECULAR:
Aerobios estrictos: no necesitan O2. Respiración aerobia
Aerobios facultativos: no necesitan O2, pero crecen mejor con él. Respiración aerobia,
anaerobia y fermentación
Microaerófilos: necesitan O2 a bajas tensiones. Respiración aerobia
Anaerobios aerotolerantes: no necesitan O2 ni crecen mejor con él. Fermentación
Anaerobios estrictos: O2 es dañino o letal. Fermentación o respiración anaerobia

La tolerancia al O2 viene dictada por la existencia de ciertas enzimas capaces de

descomponer las formas tóxicas que se forman siempre como consecuencia de su
utilización.

a) aerobio estricto
b) anaerobio estricto
c) aerobio facultativo
d) microaerófilo
e) anaerobio aerotolerante

El cultivo de aerobios se realiza en placas de Petri, con agitadores o mediante una

entrada de aire a presión
El cultivo de anaerobias se realiza en condiciones especiales de ausencia de oxígeno o
en jarras que reducen el O2 en H2O

Para el cultivo de microaerobios y capnófilos (el CO2 favorece su crecimiento) usamos

tarros con velas o paquetes generadores de CO2

TEMPERATURA:
Temperatura mínima  gelifracción de la membrana; transporte tan lento que no hay
crecimiento
Temperatura óptima  reacciones enzimáticas a la máxima velocidad posible
Temperatura máxima  desnaturalización proteica; colapso de la membrana y lisis
térmica

Psicrófilos: temperatura mínima (0ºC), temperatura óptima (15ºC), temperatura máxima

(20ºC)
Psicrotolerantes: pueden crecer a 0ºC pero su temperatura óptima oscila entre 20 y 40ºC
Mesófilos: temperatura mínima (10ºC), temperatura óptima (20-40ºC), temperatura
máxima (50ºC)
Termófilos: temperatura mínima (40ºC), temperatura óptima (55-65ºC), temperatura
máxima (70ºC)
Hipertermófilos: temperatura mínima (70ºC), temperatura óptima (80-100ºC),
temperatura máxima (>100ºC)
Ningún eucariota crece por encima de 60-65ºC.
PH:
Acidófilos: crecen a pH ácidos
Neutrófilos: crecen a pH neutros
Alcalófilos: crecen a pH básicos

Los tampones más usados son los tampones fosfato (constan de fosfatos unibásicos y
bibásicos) y carbonatos.

CONCENTRACIÓN DE SAL:
No halófilas: no toleran concentraciones mayores del 1%
Halotolerantes: soportan cantidades moderadas (5-10%) pero crecen mejor sin ellas
Halófilos: dependen del ion sodio (1-15%)
Halófilos extremos: crecen a 15-30% y dependen de ellas

TÉCNICAS DE CULTIVO

1.- Preparación del medio de cultivo (todos los nutrientes en cantidad adecuada)
2.- Esterilización: eliminar todos los microorganismos que pudiera haber en el medio o
en el contenedor
3.- Inoculación: adición de un inóculo (pequeña cantidad de microorganismos). Salvo
excepciones, este inóculo será un cultivo puro (todas las células son iguales)
4.- Incubación: el cultivo se incuba en condiciones que favorezcan el crecimiento
microbiano del microorganismo en particular
Para evitar la contaminación de los cultivos es necesario seguir unas técnicas
microbiológicas que denominamos técnicas de asepsia.

Preparación del medio de cultivo:

1) pesar de acuerdo con las instrucciones del fabricante (medios preparados) o de
cada uno de los componentes que lo forman
2) añadir el volumen de agua destilada correspondiente (los recipientes no deben
superar el 60% de su capacidad cuando van a ser autoclavados)
3) disolver y ajustar el pH del medio
4) esterilizar en autoclave (20 minutos a 120ºC). Las sustancias termolábiles han de
esterilizarse por filtración y ser añadidas al media cuando la temperatura sea de
50-60ºC
5) dejar enfriar hasta 60-65ºC y dispensar en placas de Petri
Técnicas de asespsia:
Utensilios de siembras: asa y aguja de siembra, cayados o espátulas de Drigalsky y
pipetas automáticas

Transferencia aséptica:

Transferencia aséptica:
(a) El asa de siembra se calienta hasta la incandescencia y se deja luego enfriar brevemente
al aire
(b) Se destapa el tubo
(c) Se pasa el extremo del tubo por la llama (flamear)
(d) se extrae la muestra con el asa esterilizada y se transfiere a un medio estéril
(e) Se vuelve a flamear el extremo del tubo
(f) Se tapa el tubo. Se esteriliza el asa antes de dejarla en la mesa
 SIEMBRAS
SIEMBRAS EN TUBO:
Siembra de un medio líquido o caldo

Cuando el caldo está turbio denota crecimiento bacteriano.

Siembra por picadura de un agar blando y en superficie de un agar sólido inclinado

Con la técnica del agar sólido ponemos de manifiesto la movilidad del microorganismo
y su relación con el O2

SIEMBRAS EN PLACAS DE PETRI:

Siembra en estría
OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS MEDIANTE SIEMBRA EN ESTRÍAS POR
AGOTAMIENTO:

Así obtenemos cultivos puros a partir de mezclas complejas que contienen muchos
microorganismos.
 TEMA 5 “CONTROL DE LOS MICROORGANISMOS”

Ocasionalmente tendremos que destruir, eliminar o inhibir microorganismos de nuestra

muestra. Para ello utilizamos métodos físicos o químicos.

Esterilización: destrucción o eliminación de todos los microorganismos de un objeto o

hábitat
Desinfección: destrucción, inhibición o eliminación de microorganismos patógenos
sobre un objeto inanimado
Antisepsia: desinfección química de la piel o mucosas. No supone destrucción de toda
forma de vida
Limpieza: separación lo más completa posible de dos sustancias unidas entre sí
físicamente de forma floja
Sepsis: degradación, descomposición o putrefacción. Indica contaminación microbiana
o una enfermedad microbiana en el organismo
Asepsia: ausencia de contaminación. En el laboratorio trabajamos en condiciones de
asepsia (trabajar al lado de un mechero, emplear guantes estériles…)
Cida: muerte. Biocida, bactericida, fungicida, viricida, germicida
Statico: inhibición o parada del crecimiento. Bacteriostático, fungistático, virostático…

Orden decreciente de la resistencia de los microorganismos a los biocidas químicos:

Priones  endosporas de bacterias  micobacterias  quistes de protozoos  formas
vegetativas de protozoos  Gram -  Hongos y esporas de hongos  virus sin
envoltura  Gram +  virus con envoltura lipídica

PRINCIPALES MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

Métodos físicos
CALOR: destruye a los microorganismos por desnaturalización de las proteínas,
membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos. Su eficacia
depende de la temperatura y el tiempo de exposición.
Calor seco:
- Flameado  hasta el rojo de las asas de siembra
- Incineración  de material de desecho
- Horno Pasteur  160 -170ºC (1-2h). Para materiales de vidrio y metálicos
Calor húmedo: es más eficaz que el calor seco, produciéndose más rápidamente debido
a la presencia del agua. Induce la desnaturalización de las proteínas y la fusión de
lípidos de membrana por rotura de puentes de hidrógeno
- Ebullición  causa la muerte de bacterias, virus y hongos, pero no asegura la
muerte de las esporas, que requieren temperaturas superiores
- Autoclave  el tratamiento se efectúa a temperaturas por encima de la
temperatura de ebullición, para ello se opera a una presión mayor que la
atmosférica (1 atm, 121ºC, 15-20 min.) Se emplea principalmente para
esterilizar medios de cultivo y materiales que sean resistentes al calor.
Para saber si el autoclave se ha realizado correctamente utilizamos
controladores:
- controles biológicos: ampollas de Bacillus stearotermophyllus y Clostridium
PA3679. Si al aplicar en el medio de cultivo crecen, significa que el autoclave
no ha funcionado
- controles no biológicos: tiras indicadoras que se tornan negras a altas
temperaturas.
 - Tyndalización  es un método de esterilización fraccionada que se lleva a cabo
en dos o tres ciclos
a) en un autoclave, con la válvula de escape abierta (presión normal) se somete
el material a 50 – 100ºC durante 1 – 2 h
b) el material se introduce en una estufa a 30 – 37ºC durante 24 horas
Mueren todas las células vegetativas de la muestra, pero permanecen viables las
esporas, que quedan activadas para germinar. Durante las fases de tipo b) se
produce la germinación de las esporas activadas en la fase anterior. En la
siguiente fase de tipo a) morirán las células vegetativas procedentes de la
germinación en la fase anterior, y así sucesivamente, hasta que al cabo de unos
cuantos ciclos no queda ningún microorganismo en la muestra
RADIACIONES:
- Radiaciones ionizantes  rayos X y γ. Tienen gran capacidad de penetración y
dañan los componentes vitales. Se utilizan para esterilizar material quirúrgico,
material de laboratorio de un solo uso, medios de cultivo, fármacos…
- Radiaciones no ionizantes  rayos UV. Tienen poco poder de penetración y
lesionan el DNA formando enlaces entre timinas, parando la replicación. Se
utilizan para controlar el aire en ambientes cerrados, lámparas germicidas,
vacunas…
FILTRACIÓN:
Uuso de filtros para fluidos biológicos que se degradan por calor. En microbiología se
suele utilizar filtros de membrana (0,22 – 0,45 µm)
 Agentes químicos
Un agente químico puede actuar como esterilizante, desinfectante y/o antiséptico
dependiendo de la concentración, el tiempo de exposición y el pH.

AGENTES ALQUILANTES (óxido de etileno):

Extraen grupos –H para añadir grupos –CH3 de las bases adenina y guanina. Tienen un
elevado poder de penetración. Se emplea a modo de autoclave para esterilizar materiales
sensibles al calor (5-6%, 50-60ºC en humedad, 4-6 h)

DERIVADOS YODADOS:
Antiséptico cutáneo, oxidante de componentes celulares. Tiene el inconveniente de
manchar la piel y provocar reacciones de hipersensibilidad. Para evitarlo se le añade un
transportador y se pasa a denominar yodomorfo. Ej: povidona yodada  preoperatorios,
extracción sanguínea…

AGUA OXIGENADA:
Oxidante, bactericida (3-6%), esporicida (10-25%) y desinfectante de líquido de
lentillas y piel

CLORO Y DERIVADOS:
Oxidantes de componentes celulares. Desinfectantes y antisépticos en suministros de
agua potable y piscinas. Se usa en forma de hipoclorito sódico (lejía) o hipoclorito
cálcico. En estas reacciones, se forma ácido hipocloroso (HClO) que se disocia en Cl -

FENOLES:
Primer antiséptico y desinfectante empleado. Desnaturaliza las proteínas y altera las
membranas celulares. Se usa como valoración de eficacia de desinfectantes (si es más
potente que el fenol, es aceptado). Aplicación como desinfectante asociado a jabones y
lejía.

ALCOHOL ETÍLICO:
Desnaturalización de proteínas. Debe emplearse en solución acuosa al 70% pues las
concentraciones mayores deshidratan a los microorganismos, conservándolos en vez de
destruirlos. Bactericida y moderadamente fungicida. Poco o nada eficaz contra esporas,
micobacterias y varios tipos de virus. Efectividad rápida pero poco duradera dada a su
tendencia a evaporarse. Desinfectar termómetros, superficie externa de tapones de
goma, frascos-ampolla que contienen medicamentos…
Un uso prolongado daño los materiales de montaje de las lentes, disuelve las gomas y
ciertas tubuladuras plásticas.
Para su aplicación se deben dejar transcurrir 30 minutos en mucosas o 2 a 5 minutos en
la piel, entre la aplicación del alcohol y el comienzo del procedimiento quirúrgico.

PASTEURIZACIÓN:
Destrucción de todos los microorganismos patógenos o reducción de microorganismos
alterantes. Para su aplicación se hace pasar la leche por un tubo que está en contacto con
una fuente de calor:
- Baja: 63ºC 30 min
- Alta: 71ºC 15 seg.
- UHT: 140ºC 1-3 seg.