UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL “FABIOLA

SALAZAR LEGUIA” DE BAGUA

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y APLICADAS

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA

PRACTICA DE LABORATORIO N°3

NOMBRE DE LA PRACTICA: Visualización de ADN Bacteriano genómico por

electroforesis en gel de Agarosa

DOCENTE: Guevara Guerrero Romel

ASIGNATURA: Biología Molecular

ESTUDIANTES:

 Aguilar Torres Jhordin Oner

 Sejekam Kajekui Alex Emer
 Villalobos Salas Angely
 Wong Mera Dalia

FECHA DE ENTREGA: 27/04/2023

BAGUA - AMAZONAS

2023
TABLA DE CONTENIDO

1 INTRODUCCIÓN..............................................................................................................3

2 OBJETIVOS.......................................................................................................................4

2.1 Objetivo general..........................................................................................................4

2.2 Objetivos específicos...................................................................................................4

3 MARCO TEORICO............................................................................................................5

3.1 La purificación de ADN genómico de E. coli.............................................................5

3.1.1 Técnicas y métodos para purificación de ADN genómico de E. coli..................5

4 MATERIALES Y EQUIPOS.............................................................................................8

4.1 Materiales....................................................................................................................8

4.2 Equipos........................................................................................................................8

4.3 Soluciones....................................................................................................................8

4.4 Composición del buffer...............................................................................................9

5 PROCEDIMIENTO.........................................................................................................10

6 RESULTADOS................................................................................................................13

7 CONCLUCIÓN................................................................................................................14

8 RECOMENDACCIONES...............................................................................................15

9 BIBLIOGRAFÍA..............................................................................................................16

10 ANEXOS..........................................................................................................................17

TABLA DE ILUSTRACIÓN

Ilustración 1: Proceso de Lisis celular........................................................................................5

Ilustración 2: Purificación del ADN por precipitación con alcohol...........................................6

Ilustración 3:Columnas de intercambio iónico para proteínas...................................................7

1 INTRODUCCIÓN
La electroforesis en gel de agarosa es un método bastante utilizado para separar, identificar y
purificar fragmentos de ADN. La agarosa utilizada para la electroforesis ha sido altamente
purificada; esto genera una preparación de agarosa con propiedades electroforéticas deseables
y una mínima fluorescencia de fondo, lo cual es importante para visualizar moléculas de
ADN (Cao Romero, 2019).

En biología molecular, la mayoría de los estudios requieren el uso de la electroforesis; sin

embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa
ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como
proteínas, mientras que en la electroforesis horizontal generalmente se trabaja con ADN o
ARN. De otro lado, existen otros métodos electroforéticos que presentan ciertas
modificaciones ( Yábar Varas, 2003)

La presente práctica experimental de electroforesis en gel de agarosa para la visualización de

ADN bacteriano, ha permitido aplicar la técnica electroforética que permite el análisis (en
este caso) de una sola muestra de ADN genómico microbiano, en el que se pretende averiguar
el tamaño aproximado. Se desglosan los objetivos específicos planteados que parten de los
procesos que llevarán a aprender los fundamentos y procedimiento experimental en el análisis
de electroforesis de ADN en gel de agarosa.

Cumpliendo con el ultimo objetivo específico, se muestran imágenes de los resultados de la

electroforesis para, finalmente realizar las interpretaciones correspondientes con respecto a la
imagen obtenida luego de la corrida para determinar aproximadamente el tamaño molecular
del ADN genómico. Se detalla la realización del experimento, en el que se aplicó las técnicas
que corresponden (aún habiendo sido modificados de acuerdo a las necesidades del grupo).

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2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
Analizar mediante electroforesis en gel de agarosa el ADN Genómico Purificado (bacteriana)

2.2 Objetivos específicos

 Familiarizarse con métodos de separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis
en geles de agarosa.
 Determinación de los tamaños moleculares mediante electroforesis en gel de agarosa
en relación al uso de buffers para diferentes pesos moleculares de ADN.
 Interpretar los resultados de la electroforesis en la determinación de ADN genómico


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3 MARCO TEORICO
3.1 Fundamentos de electroforesis en gel de agarosa
El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de
un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de un campo
eléctrico, serán separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular ( Yábar Varas, 2003).

Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la matriz y establecer un patrón

de fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes. Estos pasos
facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán
posteriormente analizadas e interpretadas (Cao Romero, 2019).

FIGURA 1: Configuración de electroforesis en gel de agarosa.  El gel de agarosa se asienta en

un tanque de tampón, las muestras mezcladas con el colorante de carga se colocan en
pocillos en un extremo del gel y se aplica una corriente eléctrica que hace que el ADN
cargado negativamente se mueva hacia el electrodo positivo.

3.2. La corrida del ADN durante la electroforesis en gel

De acuerdo con Cao Romero (2019): La velocidad de migración de los ácidos nucleicos en
matrices de agarosa está determinada por los siguientes factores:

 Tamaño molecular. Las moléculas más grandes migran más lentamente porque su
fricción de arrastre es mayor y porque se mueven a través de los poros del gel con
mayor dificultad que las moléculas pequeñas.

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  Forma o conformación. El ADN súper-enrollado migra más rápido que el ADN
lineal.
 Concentración de agarosa. Al disminuir la concentración de agarosa, los poros del
gel son más grandes y las moléculas migrarán con mayor velocidad.
 Amortiguador de electroforesis. La movilidad electroforética de los ácidos nucleicos
es influenciada por la composición y la fuerza iónica del amortiguador de
electroforesis.
 Voltaje aplicado. La fuerza fundamental del movimiento por electroforesis es el
voltaje aplicado al sistema. La velocidad de las moléculas es directamente
proporcional al gradiente de voltaje.
 Bandas poco definidas. Puede ocurrir cuando la agarosa no gelifica adecuadamente,
causando que los pozos estén mal formados (presencia de burbujas o tiempo de
polimerización insuficiente); también puede deberse a que el gel se haya preparado
con agua y no con amortiguador, o bien, a que se hayan cargado grandes cantidades
de ADN o ARN en el pozo.

Tabla 1: Relación entre las concentraciones de agarosa para preparar geles utilizados en la
electroforesis y los rangos de los tamaños de los fragmentos de ADN que se desea separar.

3.3. Lectura de electroforesis en gel

Una forma fácil y económica de determinar el tamaño molecular aproximado de un

fragmento de ADN es mediante la comparación con un marcador de tamaño molecular, el
cual se separa en el mismo gel de agarosa mediante electroforesis y, por lo general, se coloca
en el carril primero, último o ambos (Manjarrez Álvarez, 2013).

Los geles de agarosa se pueden visualizar usando una caja de luz independiente conectada a
transiluminador de luz UV. La luz ultravioleta brilla a través del gel desde abajo y las bandas

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de ADN emiten fluorescencia gracias al tinte intercalado unido a ellas. Esto puede capturarse
usando una cámara con un filtro UV especializado para sus registros (Padilla Peña, 2015).

Las escaleras marcadoras vienen con una guía para indicar el tamaño de cada banda que
incluyen. Al comparar esto con las bandas en los carriles de muestra, se pueden determinar
los tamaños de las bandas. También se puede comparar la cantidad relativa de ADN entre
muestras, ya que concentraciones más altas de ADN producirán bandas más brillantes
(Thieman & Palladino, 2010). 

La imagen obtenida del gel mediante la visualización con luz UV debe ser parecida a la
siguiente:

FIGURA 2: El Kb que está al lado de cada número en el marcador indica cuánto kilo de
bases tiene el fragmento de ADN.
3.4. Uso de reactivos en la electroforesis con geles de agarosa

 El SYBR Green: Es un colorante de unión de ADN bicatenario, para la visualización

del ADN en la electroforesis con geles de agarosa. Emite una fluorescencia más
brillante.
 TAE (Tris acetato EDTA): Puede utilizar este tampón para el ADN genómico y
altamente condensado. También se puede utilizar como tampón de corrida y de
preparación del gel.

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  Tampón de carga 6X ladder: es un tampón de carga premezclado con dos colorantes
de seguimiento para agarosa y electroforesis en gel de poliacrilamida no
desnaturalizante. Se incluye EDTA para quelar el magnesio (hasta 10mM) en
reacciones enzimáticas, deteniendo así la reacción

4 MATERIALES Y EQUIPOS
4.1 Materiales
a. Matraces
b. Vaso precipitado
c. Micropipetas automáticas 10 – 100 μl
d. Tubos eppendorf de 1,5 mL
e. Puntas desechables de micropipetas

a b c d

e f

4.2 Equipos
a. Congelador
b. Microondas
c. Transiluminador de luz UV.
d. Equipo de electroforesis (cubeta, soporte, peine, fuente de alimentación).

a b
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4.3 Reactivos
 Agarosa
 ADN genómico purificado
 TAE (Tris acetato EDTA) 20 mL
 Colorante fluorescente SYBR Green 2uL
 Tampón de carga 6X Ladin.
 Agua pura 980 mL

a b c d

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5 PROCEDIMIENTO
1. Preparación del gel de Agarosa 1,5 %
 Se vierte en un matraz 1 gr de agarosa, aforar con agua pura a 100 ml.
 Se funde la solución de agarosa en un microondas para homogenizar la
solución.
 Se deja enfriar la suspensión hasta que alcance una temperatura de 45 °C.
 Verter la solución de agarosa en una cubeta de electroforesis y se coloca el
peine que servirá para formar los pocillos del gel.
 Añadir Colorante fluorescente SYBR Green 2 uL a la solución de agarosa.
Mezclar bien.
 Se deja polimerizar la solución en la refrigeradora para obtener el gel de
agarosa.
2. Preparación de las muestras de DNA y buffer TAE
 Se cogen 10 µl del ADN genómico purificado e insertar en un tubo eppendorf,
y se le añaden 2 µl de tampón de carga. De esta manera se proporción de
muestra 5 en 1.
 Extraer 20 ml de buffer TAE (Tris acetato EDTA) con una pipeta y mezclar
con 980 mL de agua purificada en un vaso de precipitado.
3. Electroforesis
 Se retira el peine del gel de agarosa y se extrae del soporte del gel con cuidado
de no romperlo y se coloca en la cubeta de electroforesis: Los pocillos deben
de estar cerca del cátodo (polo negativo, color negro).
 Se añade la solución preparada de buffer de electroforesis TAE, de forma que
cubra bien el gel de agarosa.
 Se aplican 10 µl de la muestra preparada uno de los pocillos formados en el
gel de agarosa.
 Se tapa la cubeta de electroforesis y se conectan los electrodos a la fuente de
alimentación. Se comprueba que está bien conectada.
 Se programa la fuente a unos 90 voltios y se comienza a correr la
electroforesis que durará unos 30-45 minutos.
 Una vez acabada la electroforesis se visualizan los fragmentos de DNA
mediante luz UV y se realiza una fotografía de la imagen.

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6 RESULTADOS

Luego de la electroforesis del gel, mediante la visualización con luz UV se obtuvo la

siguiente imagen:

FOTOGRAFIA 1: Electroforesis de ADN genómico de E.coli fraccionado en

agarosa 1%. La banda brillante del gel corresponde al fragmento ADN
genómico bacteriano.

DISCUSIONES

La diferencia en velocidad de migración es dada por el tamaño y la forma de DNA, las

moléculas con cargas negativas migran hacia el lado positivo. El colorante del tampón de
carga permite visualizar al frente el avance de las muestras.
Para poder visualizar el tamaño de los fragmentos de ADN, hace falta comparar la migración
de las bandas de muestra con la migración de bandas del marcador de peso molecular (cuyo
tamaño es conocido). Sin embargo, al no poder observarse las bandas de los marcadores, no
se puede estimar el tamaño de los fragmentos de ADN analizados.

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7 CONCLUCIÓN

8 RECOMENDACCIONES
 Cuando se trabaja con reactivos tóxicos, siempre se deberá usar guantes, lentes
protectores y mandil para evitar un contacto directo o accidental con ellos.

 Evitar tener contacto con la luz ultravioleta (UV) empleada para la visualización de
ADN con 90 V de potencia, para evitar graves daños oculares y epiteliales.

 Asegurarse de mantener la fuente poder apagada o desconectada al momento de

manipular el equipo, para evitar quemaduras por descarga eléctrica.

 Se recomienda utilizar envases de vidrio resistentes a altas temperaturas (por ejemplo:

Pyrex) en el proceso de calentamiento de sustancias; evitar enfriamiento drástico de
los envases de vidrio para evitar daños en el material.

 El material biológico debe ser conservado a bajas temperaturas. El ADN genómico y

los productos de amplificación pueden ser almacenados a 4°C.

 Las puntas que se insertan en las micropipetas y que tienen contacto directo con las
moléculas de ADN sean nuevas y estériles, a fin de evitar contaminación de la
muestra con nucleasas.

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9 BIBLIOGRAFÍA

Yábar Varas, C. (2003). Manual de Procedimientos de Electroforesis para Proteínas y ADN.

Lima: Instituto Nacional de Salud. Obtenido de
file:///C:/Users/COMPAQ/Downloads/38%20(1).pdf

Cao Romero, M. (2019). Manual de Laboratorio de Biología Molecular. Universidad

Autónoma Metropolitana, Ciudad de Mexico. Obtenido de
file:///C:/Users/COMPAQ/Documents/BIOLOGIA%20M/Manual_practicas_laborator
io_biologia_molecular.pdf

Manjarrez Álvarez, N. (2013). Manual de prácticas de laboratorio. Técnicas Básicas de

Biología Molecular. UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA, Iztapalapa.
Obtenido de http://publicacionescbs.izt.uam.mx/DOCS/biomolec.pdf

Padilla Peña, A. (2015). Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento

y Caracterización electroforética de ADN Plasmídico. Departameto de Bioqímica y
Biología molecular, Córdova. Obtenido de
file:///C:/Users/COMPAQ/Documents/BIOLOGIA%20M/17%20ELECTROFORESI
S%20ACS%20NUCLEICOS%20GELES%20AGAROSA.pdf

Thieman, W., & Palladino, M. (2010). Introdución a la biotecnología . Madrid: PEARSON.

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10 ANEXOS

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