UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL

“FABIOLA SALAZAR LEGUIA” DE BAGUA

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y APLICADAS

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA

PRACTICA N°4

NOMBRE DE LA PRACTICA: Visualización De ADN Bacteriano Mediante

Electroforesis En GEL DE AGAROSA

DOCENTE: Romel Guevara Guerrero

CURSO: Biología Molecular

INTEGRANTES:
 Angela Salinas Ramos
 Nilda Pacheco Chinchay
 Aldair Purihuaman Vásquez
 Juan Euler Umpunchin Aushuqui
 Ney Anderson Rivero Rodríguez
 Lucila Jempes Watsum
 Michael Ramos Ayay

BAGUA – AMAZONAS

2023
TABLA DE CONTENIDO

Contenido
TABLA DE CONTENIDO..........................................................................................................2

1 INTRODUCCIÓN...............................................................................................................3

2 OBJETIVOS.........................................................................................................................4

2.1 Objetivo general...................................................................................................................4

2.2 Objetivos específicos............................................................................................................4

3 MARCO TEORICO.............................................................................................................5

1. Factores que afectan la migración del ADN a través de geles de agarosa...........................5

2. Se utilizan agentes intercalantes fluorescentes para visualizar moléculas de ADN en geles

..............................................................................................................................................5

3. Se utilizan estándares para estimar los tamaños de las moléculas de ADN.........................6

4 MATERIALES.....................................................................................................................7

5 PROCEDIMIENTO.............................................................................................................8

6 RESULTADOS..................................................................................................................10

7 CONCLUSIONES.............................................................................................................11

8 RECOMENDACIONES....................................................................................................11

9. ANEXOS............................................................................................................................12

14

10. Bibliografía.........................................................................................................................15
1 INTRODUCCIÓN

La electroforesis en gel es una técnica muy utilizada para separar moléculas o fragmentos
de moléculas de ácidos nucleicos. Los materiales más comunes para separar moléculas de
ácidos nucleicos son polímeros como la poliacrilamida o la agarosa. Estos geles se
colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un tampón de pH alrededor de 8.
La electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida es una de las metodologías más
utilizadas en el laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo con ácidos nucleicos.
Mediante la electroforesis podemos separar fragmentos de ADN y ARN en función de su
tamaño, visualizarlos mediante una sencilla tinción, y de esta forma determinar el
contenido de ácidos nucleicos de una muestra, teniendo una estimación de su
concentración y grado de entereza. Podemos además extraer del gel los fragmentos de
ADN que sean de interés, para posteriormente utilizarlos en diferentes aplicaciones.
(Ramírez, 2005)
Las moléculas de agarosa son capaces de formar geles con tamaños de poro
relativamente definidos debido a las propiedades químicas de las moléculas de agarosa.
La agarosa demuestra histéresis:su temperatura de fusión es mayor que su temperatura de
gelificación. Las moléculas de agarosa se disuelven a aproximadamente 90°C, formando
bobinas aleatorias en solución. Los geles se forman cuando la temperatura cae a
aproximadamente 40°C. A medida que se forma el gel, las moléculas de agarosa primero
se ensamblan en fibras helicoidales, que luego se agregan para formar redes de hélices
superenrolladas estabilizadas por enlaces de hidrógeno. Los tamaños de los poros, que
típicamente oscilan entre 50 y 200 nm, dependen de la concentración de agarosa. A
medida que aumenta la concentración de agarosa, el diámetro promedio del poro
disminuye. (Vazques, 2010)
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
Separar y analizar los ácidos nucleicos como el ADN y ARN presente en una muestra
bacteriana.
2.2 Objetivos específicos

 Determinar el tamaño aproximado del ADN bacteriano

 Detectar la presencia de plásmidos o elementos genéticos móviles
 Analizar la integridad del ADN bacteriano
3 MARCO TEORICO

1. Factores que afectan la migración del ADN a través de geles de agarosa

Debido a la carga negativa de los residuos de fosfato en la cadena principal del ADN,
las moléculas de ADN se mueven hacia el polo positivo (ánodo) del aparato de
electroforesis. La tasa de migración real de las moléculas de ADN en un experimento
particular se ve afectada por múltiples factores.
Algunos de estos factores son intrínsecos a las moléculas de ADN, mientras que otros
factores se relacionan con las condiciones electroforéticas. Los factores intrínsecos
incluyen tanto la longitud como la conformación de las moléculas de ADN que se
están analizando. (Lopez, 2020)
Dentro de un cierto rango de tamaño dictado por las condiciones del gel, la
tasa de migración de las moléculas lineales de ADN es inversamente proporcional al
log10 del número de pares de bases. La migración de moléculas de ADN más
estructuradas, como los plásmidos superenrollados, es mucho menos predecible. Las
tasas de migración de estos ADN más altamente estructurados están influenciadas por
la densidad de bobinas, la presencia de mellas y otras características estructurales.
Las tasas de migración de las moléculas de ADN en geles de agarosa también se ven
afectadas por la composición del gel. La tasa de migración de una molécula de ADN
disminuye a medida que aumenta la concentración de agarosa en el gel. Los
investigadores suelen ajustar la concentración de agarosa para optimizar la resolución
de las moléculas de ADN dentro de un rango de tamaño particular. Los dos tampones
comúnmente utilizados en laboratorios, TAE (Tris: acetato: EDTA) y TBE (Tris:
borato: EDTA), también afectan las tasas de electroforesis. (Gutiérrez, 2002)
Debido a esta variabilidad inherente, los investigadores siempre incluyen un carril de
patrones de ADN con tamaños conocidos en el mismo gel que las muestras que se
analizan. Es importante destacar que estos estándares necesitan tener una estructura
similar (por ejemplo, lineal o superenrollada) y ser sometidos a las mismas
modificaciones químicas que las muestras de ADN que se analizan.

2. Se utilizan agentes intercalantes fluorescentes para visualizar moléculas de ADN

en geles

Los ácidos nucleicos son visualizados por colorantes fluorescentes que se unen
fuertemente al ADN. Los colorantes son agentes intercalantes que se insertan en la
hélice de ADN y en regiones estructuradas de ácidos nucleicos monocatenarios. La
fluorescencia de estos colorantes aumenta en un orden de magnitud cuando se unen a
los ácidos nucleicos, por lo que la fluorescencia de fondo en los geles de agarosa suele
ser baja. Solía utilizarse bromuro de etidio (EtBr) para visualizar fragmentos de ADN.
EtBr absorbe la luz en el rango ultravioleta (UV) y emite luz naranja. Los geles se ven
con transiluminadores especiales que contienen luces UV. El EtBr es un compuesto
sensible a la luz, por lo que las existencias se almacenan en la oscuridad. Además, es
un
moderadamente tóxico y carcinógeno por lo que su uso está siendo reemplazado por
colorantes alternativos como el GelRed entre otros
3. Se utilizan estándares para estimar los tamaños de las moléculas de ADN

Un estándar de ADN es una mezcla

patentada de
fragmentos de ADN lineales que varían en
tamaño de0.5 a 10 kilobases (kb). La
intensidad de tinción de las bandas en geles
de agarosa refleja la cantidad de ADN en la
banda, porque EtBr se intercala de manera
bastante uniforme a lo largo de la longitud
de las moléculas de ADN lineales. Como
puede ver, esta mezcla en particular
contiene cantidades similares de cada
fragmento de ADN, con la excepción del
fragmento de 3 kb, que tiene ~2.5 más
ADN que los otros fragmentos. La mayor
intensidad del fragmento de 3 kb sirve
como marcador de orientación útil en
situaciones en las que fragmentos más
pequeños podrían haberse escurrido del
extremo del gel o cuando algunos
marcadores no están bien resueltos entre sí.
(¡Estas son ocurrencias comunes!)
Tenga en cuenta que las moléculas más
cortas en el
gel están más bien separadas entre sí que
las
moléculas más largas. Los productos de
PCR que
analizará en este laboratorio están en su
mayoría en
el rango de 400-1000 pb. Para incrementar
la
resolución de estas moléculas, se utilizan
geles de
agarosa al 1.25%. (Esto reducirá la
resolución de
moléculas de ADN más grandes).
Obsérvese también que las bandas más
pequeñas aparecen más borrosas en el gel
teñido, debido a que se han visto más
afectadas por la difusión aleatoria ya que
han migrado a través de la red de polímeros
de agarosa. (Miliwebsky, 2005)
 4 MATERIALES
Para la realización de este experimento de laboratorio se emplearon los siguientes materiales.

a) Agarosa
b) Horno microondas
c) Micro pipeta
d) Tips
e) Papel higiénico
f) Cámara electroforética
g) Tubo eppendorf
h) Agua destilada
i) SYBER Green (compuesto fluorescente)
j) Balanza
k) Loading Buffer (6X DNA Gel)
l) Ladder (Perfect DNA)
m) Tae 50X
n) Frasco de laboratorio
o) Probeta
p) ADN E.Coli

a b c d e
a

h i j
f g

k m n o p
l
5 PROCEDIMIENTO
1. Primeramente, prepararemos la agarosa, empezamos pesándolo a 1g
2. Luego lo colocamos en un frasco de vidrio con tapa que sea resistente al calor
3. Pasamos a aforar el agua en una probeta que llegue a los 100ml, procederemos a
echarlo junto a la agarosa, nunca ponemos nuestra mezcla sobre una superficie fría si
no sobre un papel higiénico
4. En este paso procederemos a llevar la muestra a nuestro horno microondas, ponemos
la temperatura especifica que viene el horno microondas de fábrica, metemos al horno
cuantas veces sea necesario para que nuestra muestra se mezcle completamente y no
tenga ningún grumo seria aproximadamente 4 minutos, pero no tiene que llegar a
hervir
5. Lo sacamos del microondas y volvemos a colocar el papel debajo de la muestra,
esperamos que se enfrié, pero si quieren adelantar este proceso pueden enfriarlo
mojando las manos y colocándola en nuestra botella de vidrio
6. Antes que se solidifique añadimos un compuesto fluorescente que eso nos permitirá
ver el ADN que porque solo no se puede visualizar el compuesto que añadiremos es
una alternativa como tinte al bromuro de etidio es el SYBR GREEN
7. Se mezcla y se coloca ala cubeta con los peines de la cámara electroforética,
esperamos hasta que se haga gelatina, lo llevamos a refrigeración, pero con mucho
cuidado porque se puede derramar.
8. Preparamos el tampón de electroforesis con TAE 50X, diluimos el tampón de
electroforesis TAE 50X en agua destilada para obtener una concentración final.
Aseguramos de preparar suficiente tampón para llenar la caja de electroforesis.
9. Preparación del loading buffer: Prepara una solución de loading buffer diluyendo el
loading buffer concentrado en agua destilada según las instrucciones del fabricante. El
loading buffer ayuda a cargar las muestras en los pocillos del gel y proporciona una
carga eléctrica para la electroforesis. Asegúrate de preparar suficiente loading buffer
para mezclar con las muestras de ADN.
10. Ajustamos la concentración de la muestra de ADN diluyéndola en loading buffer
11. Preparación de la muestra de carga: En un tubo de microcentrífuga, mezcla la muestra
de ADN con loading buffer en una proporción adecuada. Añade SYBR Green en la
cantidad recomendada según las instrucciones del fabricante. También carga un
marcador de peso molecular (ladder) en uno de los pocillos para tener una referencia
del tamaño del ADN, el ADN va en el lado negativo
12. Carga de las muestras: Vertemos cuidadosamente la mezcla de ADN y loading buffer
en los pocillos del gel de agarosa utilizando una micropipeta aproximadamente 5ul,
ponemos en la mitad del marcador
13. Electroforesis: Colocamos el gel en una caja de electroforesis y vertemos la mezcla de
TAE 50X con agua destilada en la caja hasta que el gel esté completamente cubierto.
Conecta los electrodos a la fuente de alimentación y aplica una corriente de 90voltios.
 Esperamos de 30-40 minutos
14. Tinción y visualización del ADN: Después de la electroforesis, apaga la corriente y
retira el gel de la caja de electroforesis. Coloca el gel en una caja de tinción y agrega
SYBR Green. Siguiendo las instrucciones del tinte utilizado para el tiempo de tinción
recomendado. La SYBR Green se unirá al ADN y emitirá fluorescencia bajo la
iluminación ultravioleta. Utiliza una cámara de gel o un sistema de imagen para
capturar una imagen del gel teñido y visualizar las bandas de ADN.
6 RESULTADOS

Resultaron fueron que el ADN de E.coli se ha desintegrado que no se puede utilizar para otros
proyectos
7 CONCLUSIONES

1. En conclusión, la electroforesis en gel de agarosa proporciona información

valiosa sobre el tamaño aproximado del ADN bacteriano, la presencia de plásmidos
u otros elementos genéticos móviles, así como la integridad del ADN en la muestra
analizada. Estos resultados son fundamentales para comprender la composición y
características del ADN bacteriano, así como para investigaciones relacionadas con
genética bacteriana, resistencia a antibióticos y biología molecular en general.
2. La detención de plásmidos mediante electroforesis en gel de Agarosa es una
indicación directa de que la bacteria posee un mecanismo de transferencia genética
horizontal en conclusión es que la presencia de plásmidos o elementos genéticos
móviles en la muestra bacteriana analizada sugiere la existencia de un potencial
para la transferencia de genes y la propagación de características genéticas
adicionales, lo que puede tener implicaciones significativas en términos de
adaptación y supervivencia bacteriana.

3. La integridad del ADN bacteriano es fundamental para asegurar la funcionalidad

y la capacidad de replicación del material genético, esto sugiere que la muestra de
ADN bacteriano es de alta calidad y apta para posteriores análisis y estudios
genéticos. Además, también indica que las condiciones de manipulación, extracción
y almacenamiento del ADN bacteriano han sido adecuadas, evitando así la
degradación o fragmentación del material genético. En conclusión, es que la
visualización de bandas de ADN bacteriano bien definidas y sin fragmentación en
la electroforesis en gel de agarosa indica la integridad y estabilidad del ADN en la
muestra analizada, lo cual es esencial para realizar análisis genéticos precisos y
confiables.

8 RECOMENDACIONES
 Procurar que la agarosa sea purificada para que las reacciones sean
óptimas

 Si se trata de material contaminado realizar proceso de purificación que

interfieren con las enzimas utilizadas

 Priorizar los cuidados del proceso los factores que afectan la migración del
ADN atreves de geles de sacarosa

 Se sugiere asegurarse de que las modificaciones químicas sean exactas

para que el proceso se desarrolle de forma ideal

 Utilizar estándares para estimar los tamaños de la molécula de ADN.

 Utilizar las reglas de bioseguridad para protegerse en especial de reactivos

corrosivos.
9. ANEXOS

Figura 1. Estamos pesando la agarosa

en la balanza solo 1g

Figura 2. Mezclamos agua destilada y la

Agarosa en el recipiente de vidrio con tapa

Figura 3. Metemos al horno microondas

La mezcla
Figura 4. Metemos la mezcla al
congelador

Figura 5. Manipulamos el LADDER

Figura 6. Sacamos los peines de

nuestro gel
 Figura 7. Preparamos TDA 50X
con agua destilada

Figura 8. Activamos la cámara

Electroforética y esperamos los resultados
10. Bibliografía
Gutiérrez, J. G. (2002). PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA TAQ DNA
POLIMERASA A PARTIR DE E.COLI RECOMBINANTE . Ciencia UANL, 400.
Lopez, S. R. (2020). genoma para eliminar contaminantes en medicamentos de
proteínas recombinantes. Biofarma, 20.
Miliwebsky, E. (2005). Validación de una técnica de PCR múltiple para la detección de
Escherichia coli productor de toxina Shiga. Rev. argent. microbiol, 450.
Ramírez, A. (2005). LOCALIZACIÓN MOLECULAR MEDIANTE PCR INVERSO
DEL SITIO DE INSERCIÓN DE UN TRANSPOSON Tn10 LIGADO A gntS EN
MUTANTES DE Escherichia coli. Ciientífica Venezolana, 143.
Vazques, A. R. (2010). CLONACIÓN MOLECULAR, EXPRESIÓN HETEROLOGA
Y PURIFICACIÓN DE YFML: UNA RNA HELICASA DE LA FAMILIA DEAD.
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO, 51.