UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL “FABIOLA SALAZAR

LEGUIA” DE BAGUA

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y APLICADAS

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA

PRACTICA N°4

NOMBRE DE LA PRACTICA: Visualización De ADN Bacteriano Mediante

Electroforesis En GEL DE AGAROSA

CURSO: Biología Molecular

CICLO: IV

DOCENTE: Romel Guevara Guerrero

INTEGRANTES:
 Angela Salinas Ramos
 Nilda Pacheco Chinchay
 Aldair Purihuaman Vásquez
 Juan Euler Umpunchin Aushuqui
 Lucila Jempets Watsum
 Michael Ramos Ayay

BAGUA – AMAZONAS

2023
TABLA DE CONTENIDO

TABLA DE CONTENIDO..........................................................................................................2

I. INTRODUCCIÓN...............................................................................................................3

II. OBJETIVOS.........................................................................................................................4

a. Objetivo general...................................................................................................................4

b. Objetivos específicos............................................................................................................4

III. MARCO TEORICO.............................................................................................................4

3.3 La corrida del ADN durante la electroforesis en gel..............................................................7

3.4 Factores que afectan la migración del ADN a través de geles de agarosa...........................8

3.5 Agentes intercalantes fluorescentes para visualizar moléculas de ADN en geles...............8

3.6 Utilización de estándares para estimar los tamaños de las moléculas de ADN...................9

3.7 Uso de reactivos en la electroforesis con geles de agarosa................................................10

IV. MATERIALES...................................................................................................................11

V. PROCEDIMIENTO...........................................................................................................12

VI. RESULTADOS..................................................................................................................13

13

VII. CONCLUSIONES.............................................................................................................14

VIII.RECOMENDACIONES....................................................................................................15

IX. ANEXOS............................................................................................................................15

X. Bibliografía.........................................................................................................................16
I. INTRODUCCIÓN

La electroforesis en gel es una técnica muy utilizada para separar moléculas o fragmentos de
moléculas de ácidos nucleicos. Los materiales más comunes para separar moléculas de ácidos
nucleicos son polímeros como la poliacrilamida o la agarosa. Estos geles se colocan en la
cubeta de electroforesis, sumergidos en un tampón de pH alrededor de 8.
La electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida es una de las metodologías más utilizadas
en el laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo con ácidos nucleicos. Mediante la
electroforesis podemos separar fragmentos de ADN y ARN en función de su tamaño,
visualizarlos mediante una sencilla tinción, y de esta forma determinar el contenido de ácidos
nucleicos de una muestra, teniendo una estimación de su concentración y grado de entereza.
Podemos además extraer del gel los fragmentos de ADN que sean de interés, para
posteriormente utilizarlos en diferentes aplicaciones. (Ramírez, 2005)
Las moléculas de agarosa son capaces de formar geles con tamaños de poro relativamente
definidos debido a las propiedades químicas de las moléculas de agarosa. La agarosa demuestra
histéresis: su temperatura de fusión es mayor que su temperatura de gelificación. Las moléculas
de agarosa se disuelven a aproximadamente 90°C, formando bobinas aleatorias en solución. Los
geles se forman cuando la temperatura cae a aproximadamente 40°C. A medida que se forma el
gel, las moléculas de agarosa primero se ensamblan en fibras helicoidales, que luego se agregan
para formar redes de hélices superenrolladas estabilizadas por enlaces de hidrógeno. Los
tamaños de los poros, que típicamente oscilan entre 50 y 200 nm, dependen de la concentración
de agarosa. A medida que aumenta la concentración de agarosa, el diámetro promedio del poro
disminuye. (Vazques, 2010).

En este experimento, someteremos diversas muestras a la electroforesis mediante gel de agarosa

y observaremos la velocidad y la dirección de su migración. Los colorantes A, B, C y D tienen
cargas negativas y pH neutro. Sin embargo, estas moléculas difieren por su estructura,
composición química y carga. El colorante F tiene una carga neta positiva y migrará por tanto
en dirección opuesta a la de los demás colorantes. Además, se colocará una combi- nación de
colorantes en un mismo pocillo en el transcurso de este experimento. Esto mostrará el poder de
separación de mezclas complejas de colorantes en componentes individuales de la electroforesis
en gel de agarosa.
 II. OBJETIVOS

a. Objetivo general
Separar y analizar los ácidos nucleicos como el ADN y ARN presente en una muestra
bacteriana.
b. Objetivos específicos

 Determinar el tamaño aproximado del ADN bacteriano

 Detectar la presencia de plásmidos o elementos genéticos móviles
 Analizar la integridad del ADN bacteriano

III. MARCO TEORICO

La electroforesis en gel de agarosa se utiliza comúnmente para separar moléculas en función de su carga,
tamaño y forma. A pesar de que la electroforesis en gel de agarosa sea una técnica simple y fácil, posee
dotes de separación eficases.
Para preparar las muestras para la electroforesis, éstas se mezclan con componentes que les agregan
densidad, como el glicerol o la sacarosa. Estos proporcionan a las muestras más densidad que la del
tampón de electroforesis. Por su densidad, las muestras se sumergen en la solución tampón y
permanecen en los pocillos.
Las moléculas cargadas contenidas en las muestras penetran en los capilares del gel Las propiedades del
gel determinan la velocidad de migración de las moléculas: las pequeñas moléculas migran más
rápidamente que las grandes. En este experimento, someteremos diversas muestras a la electroforesis
mediante gel de agarosa y observaremos la velocidad y la dirección de su migración.

3.1 CÁMARA DE ELECTROFORESIS

La cámara de electroforesis es un dispositivo que permite la generación de un campo eléctrico alrededor
de un gel donde se depositan las muestras. Este campo se genera dentro de una solución amortiguadora
en la que se encuentra sumergido el gel que contiene las muestras; el alto contenido de electrolitos
permite la transmisión de la corriente eléctrica, manteniendo el pH estable al paso de la corriente. La
cámara cuenta con dos polos que se conectan a una fuente de energía. En las cámaras de electroforesis
vertical el polo positivo se encuentra en la parte inferior de la cámara y en las horizontales, en uno de los
extremos En ambos tipos de cámaras el polo positivo se distingue con color rojo y el negativo con negro.
Cada molécula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rápidamente una velocidad constante al

equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo eléctrico) con la resistencia al avance (fuerza de
fricción o rozamiento) impuesta por el medio en el que se desplaza.

La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para evitar perturbaciones
mecánicas y corrientes de convección durante la separación. En algunos soportes (papel o similares) la
muestra queda sobre la superficie y avanza a lo largo de ella, con escasa fricción, por lo que el
mecanismo principal de separación es la magnitud de la carga de cada componente de la muestra. Otros
medios de soporte (“geles”, medios semisólidos o gelatinosos) están formados por polímeros que forman
una malla, matriz o red tridimensional a través de la cual deben avanzar las moléculas de la muestra, que
queda embebida en el medio de soporte electroforético. Como consecuencia, la fricción es notable y los
factores de forma y tamaño adquieren una alta relevancia en la separación.

3.2 MODOS DE DISPOSICIÓN DEL SOPORTE

HORIZONTAL

En papel, para aminoácidos u otras moléculas pequeñas; en soportes similares (especialmente,

acetato de celulosa), para proteínas. En gel de almidón o de agarosa, para proteínas y
especialmente para ácidos nucleicos. Casi siempre el tampón cubre el gel (para evitar que se
seque debido al calentamiento sufrido al pasar la corriente), denominándose por ello
“electroforesis submarina”. El soporte se impregna por capilaridad de disolución tampón, que
disuelve la muestra y mantiene el contacto eléctrico. Se aplica la muestra depositándola (con
pipeta o un aplicador específico) como una gota sobre el soporte (papel, acetato de celulosa) o
dentro de un “pocillo” 1.ánodo (+)
2. compartimentos con tampón y los
electrodos
3. componente que migra debido a su
carga negativa
4. punto de aplicación de la muestra
5. componente que migra debido a su
carga positiva
6. papel
7. cátodo (−)

VERTICAL
Se usa casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (más resistente físicamente, no se desliza), para
proteínas o para ácidos nucleicos de pequeño tamaño. El gel puede rellenar tubos de vidrio (este formato
 ya apenas se usa) o estar contenido entre 2 placas rectangulares. Contacto eléctrico y disolvente gracias
al tampón que embebe el gel y llena las cubetas o compartimentos del ánodo y cátodo. La muestra se
deposita

con micro pipeta llenando un “pocillo” creado al polimerizar el gel. En cuanto a la composición del gel
hay dos variantes: electroforesis continua (un solo tipo de gel) y electroforesis discontinua (2 tramos de

gel de composición ligeramente diferente).

1. compartimento superior 5. pocillos donde

con tampón y el cátodo se aplican las
2. bandas en las que se muestras
separan los componentes 6. cátodo (−)
3. colorante indicador del 7. gel colocado
frente de avance entre placas de
4. compartimento inferior vidrio
con tampón y el ánodo 8. ánodo (+)

1.compartimento superior
con tampón y el cátodo 4.cátodo (−)
2. gel colocado entre placas 5. las muestras se aplican a los
de vidrio pocillos empleando una
3. compartimento inferior micropipeta
con tampón y el ánodo 6. ánodo (+)
3.3 La corrida del ADN durante la electroforesis en gel
De acuerdo con Cao Romero (2019): La velocidad de migración de los ácidos nucleicos en
matrices de agarosa está determinada por los siguientes factores:
 Tamaño molecular. Las moléculas más grandes migran más lentamente porque su
fricción de arrastre es mayor y porque se mueven a través de los poros del gel con
mayor dificultad que las moléculas pequeñas.
 Forma o conformación. El ADN súper-enrollado migra más rápido que el ADN lineal.
 Concentración de agarosa. Al disminuir la concentración de agarosa, los poros del gel
son más grandes y las moléculas migrarán con mayor velocidad.
 Amortiguador de electroforesis. La movilidad electroforética de los ácidos nucleicos es
influenciada por la composición y la fuerza iónica del amortiguador de electroforesis.
 Voltaje aplicado. La fuerza fundamental del movimiento por electroforesis es el voltaje
aplicado al sistema. La velocidad de las moléculas es directamente proporcional al
gradiente de voltaje.
 Bandas poco definidas. Puede ocurrir cuando la agarosa no gelifica adecuadamente,
causando que los pozos estén mal formados (presencia de burbujas o tiempo de
polimerización insuficiente); también puede deberse a que el gel se haya preparado con
agua y no con amortiguador, o bien, a que se hayan cargado grandes cantidades de ADN
o ARN en el pozo.
Tabla 1: Relación entre las concentraciones de agarosa para preparar geles utilizados en la
electroforesis y los rangos de los tamaños de los fragmentos de ADN que se desea separar.
3

3.3

3.4 Factores que afectan la migración del ADN a través de geles de agarosa
Debido a la carga negativa de los residuos de fosfato en la cadena principal del ADN, las
moléculas de ADN se mueven hacia el polo positivo (ánodo) del aparato de electroforesis. La
tasa de migración real de las moléculas de ADN en un experimento particular se ve afectada por
múltiples factores. Algunos de estos factores son intrínsecos a las moléculas de ADN, mientras
que otros factores se relacionan con las condiciones electroforéticas.
Los factores intrínsecos incluyen tanto la longitud como la conformación de las moléculas de
ADN que se están analizando. (Lopez, 2020) Dentro de un cierto rango de tamaño dictado por
las condiciones del gel, la tasa de migración de las moléculas lineales de ADN es inversamente

proporcional al log10 del número de pares de bases. La migración de moléculas de ADN más
estructuradas, como los plásmidos superenrollados, es mucho menos predecible. Las tasas de
migración de estos ADN más altamente estructurados están influenciadas por la densidad de
bobinas, la presencia de mellas y otras características estructurales. Las tasas de migración de
las moléculas de ADN en geles de agarosa también se ven afectadas por la composición del gel.
La tasa de migración de una molécula de ADN disminuye a medida que aumenta la
concentración de agarosa en el gel. Los investigadores suelen ajustar la concentración de
agarosa para optimizar la resolución de las moléculas de ADN dentro de un rango de tamaño
particular. Los dos tampones comúnmente utilizados en laboratorios, TAE (Tris: acetato:
EDTA) y TBE (Tris: borato: EDTA), también afectan las tasas de electroforesis. (Gutiérrez,
2002) Debido a esta variabilidad inherente, los investigadores siempre incluyen un carril de
patrones de ADN con tamaños conocidos en el mismo gel que las muestras que se analizan. Es
importante destacar que estos estándares necesitan tener una estructura similar (por ejemplo,
lineal o superenrollada) y ser sometidos a las mismas modificaciones químicas que las muestras
de ADN que se analizan.

3.5 Agentes intercalantes fluorescentes para visualizar moléculas de ADN en geles.

Los ácidos nucleicos son visualizados por colorantes fluorescentes que se unen fuertemente al
ADN. Los colorantes son agentes intercalantes que se insertan en la hélice de ADN y en
regiones estructuradas de ácidos nucleicos monocatenarios.
La fluorescencia de estos colorantes aumenta en un orden de magnitud cuando se unen a los
ácidos nucleicos, por lo que la fluorescencia de fondo en los geles de agarosa suele ser baja.
 Solía utilizarse bromuro de etidio (EtBr) para visualizar fragmentos de ADN. EtBr absorbe la
luz en el rango ultravioleta (UV) y emite luz naranja. Los geles se ven con transiluminadores
especiales

que contienen luces UV. El EtBr es un compuesto sensible a la luz, por lo que las existencias se
almacenan en la oscuridad. Además, es un moderadamente tóxico y carcinógeno por lo que su
uso está siendo reemplazado por colorantes alternativos como el GelRed entre otros.

3.6 Utilización de estándares para estimar los tamaños de las moléculas de ADN

Un estándar de ADN es una mezcla patentada de fragmentos de

ADN lineales que varían en tamaño de0.5 a 10 kilobases (kb).
La intensidad de tinción de las bandas en geles de agarosa
refleja la cantidad de ADN en la banda, porque EtBr se
intercala de manera bastante uniforme a lo largo de la longitud
de las moléculas de ADN lineales. Como puede ver, esta
mezcla en particular contiene cantidades similares de cada
fragmento de ADN, con la excepción del fragmento de 3 kb,
que tiene ~2.5 más ADN que los otros fragmentos. La mayor
intensidad del fragmento de 3 kb sirve como marcador de
orientación útil en situaciones en las que fragmentos más
pequeños podrían haberse escurrido del extremo del gel o
cuando algunos marcadores no están bien resueltos entre sí.
(¡Estas son ocurrencias comunes!)
Tenga en cuenta que las moléculas más cortas en el gel están
más bien separadas entre sí que las moléculas más largas. Los
productos de PCR que analizará en este laboratorio están en
su mayoría en el rango de 400-1000 pb. Para incrementar la
resolución de estas moléculas, se utilizan geles deagarosa al
1.25%. (Esto reducirá la resolución de moléculas de ADN
más grandes). Obsérvese también que las bandas más
pequeñas aparecen más borrosas en el gel teñido, debido a
que se han visto más afectadas por la difusión aleatoria ya que
han migrado a través de la red de polímeros de agarosa.
(Miliwebsky, 2005)
 3.7 Uso de reactivos en la electroforesis con geles de agarosa
 El SYBR Green: Es un colorante de unión de ADN bicatenario, para la visualización
del ADN en la electroforesis con geles de agarosa. Emite una fluorescencia más
brillante.
 TAE (Tris acetato EDTA): Puede utilizar este tampón para el ADN genómico y
altamente condensado. También se puede utilizar como tampón de corrida y de
preparación del gel.
 Tampón de carga 6X ladder: es un tampón de carga premezclado con dos colorantes
de seguimiento para agarosa y electroforesis en gel de poliacrilamida no
desnaturalizante. Se incluye EDTA para quelar el magnesio (hasta 10mM) en reacciones
enzimáticas, deteniendo así la reacción
IV. MATERIALES
Para la realización de este experimento de laboratorio se emplearon los siguientes materiales.

a) Agarosa
b) Horno microondas
c) Micro pipeta
d) Tips
e) Papel higiénico
f) Cámara electroforética
g) Tubo eppendorf
h) Agua destilada
i) SYBER Green (compuesto fluorescente)
j) Balanza
k) Loading Buffer (6X DNA Gel)
l) Ladder (Perfect DNA)
m) Tae 50X
n) Frasco de laboratorio
o) Probeta
p) ADN E.Coli

a b c d e
a

h i j
f g

k m n o p
l
 V. PROCEDIMIENTO

1. Primeramente, prepararemos la agarosa, empezamos pesándolo a 1g.

2. Luego lo colocamos en un frasco de vidrio con tapa que sea resistente al calor.

3. Pasamos a aforar el agua en una probeta que llegue a los 100ml, procederemos a echarlo
junto a la agarosa, nunca ponemos nuestra mezcla sobre una superficie fría si no sobre un
papel higiénico.

4. En este paso procederemos a llevar la muestra a nuestro horno microondas, ponemos la

temperatura especifica que viene el horno microondas de fábrica, metemos al horno
cuantas veces sea necesario para que nuestra muestra se mezcle completamente y no
tenga ningún grumo seria aproximadamente 4 minutos, pero no tiene que llegar a hervir.

5. Lo sacamos del microondas y volvemos a colocar el papel debajo de la muestra,

esperamos que se enfrié, pero si quieren adelantar este proceso pueden enfriarlo mojando
las manos y colocándola en nuestra botella de vidrio

6. Antes que se solidifique añadimos un compuesto fluorescente que eso nos permitirá ver el
ADN que porque solo no se puede visualizar el compuesto que añadiremos es una
alternativa como tinte al bromuro de etidio es el SYBR GREEN.

7. Se mezcla y se coloca a la cubeta con los peines de la cámara electroforética, esperamos

hasta que se haga gelatina, lo llevamos a refrigeración, pero con mucho cuidado porque
se puede derramar.

8. Preparamos el tampón de electroforesis con TAE 50X, diluimos el tampón de

electroforesis TAE 50X en agua destilada para obtener una concentración final.
Aseguramos de preparar suficiente tampón para llenar la caja de electroforesis.

9. Preparación del loading buffer: Prepara una solución de loading buffer diluyendo el
loading buffer concentrado en agua destilada según las instrucciones del fabricante. El
loading buffer ayuda a cargar las muestras en los pocillos del gel y proporciona una carga
eléctrica para la electroforesis. Asegúrate de preparar suficiente loading buffer para
mezclar con las muestras de ADN.
10. Ajustamos la concentración de la muestra de ADN diluyéndola en loading buffer

11. Preparación de la muestra de carga: En un tubo de microcentrífuga, mezcla la muestra de

ADN

12. con loading buffer en una proporción adecuada. Añade SYBR Green en la cantidad
recomendada según las instrucciones del fabricante. También carga un marcador de peso
molecular (ladder) en uno de los pocillos para tener una referencia del tamaño del ADN,
el ADN va en el lado negativo

13. Carga de las muestras: Vertemos cuidadosamente la mezcla de ADN y loading buffer en
los pocillos del gel de agarosa utilizando una micropipeta aproximadamente 5ul, ponemos
en la mitad del marcador

14. Electroforesis: Colocamos el gel en una caja de electroforesis y vertemos la mezcla de

TAE 50X con agua destilada en la caja hasta que el gel esté completamente cubierto.
Conecta los electrodos a la fuente de alimentación y aplica una corriente de 90voltios.
Esperamos de 30-40 minutos.

15. Tinción y visualización del ADN: Después de la electroforesis, apaga la corriente y retira
el gel de la caja de electroforesis. Coloca el gel en una caja de tinción y agrega SYBR
Green. Siguiendo las instrucciones del tinte utilizado para el tiempo de tinción
recomendado. La SYBR Green se unirá al ADN y emitirá fluorescencia bajo la
iluminación ultravioleta. Utiliza una cámara de gel o un sistema de imagen para capturar
una imagen del gel teñido y visualizar las bandas de ADN.

VI. RESULTADOS

Resultaron fueron que el ADN de E.coli se ha desintegrado que no se puede utilizar para
otros proyecto.
 VII. CONCLUSIONES

 En conclusión, la electroforesis en gel de agarosa proporciona información valiosa sobre el

tamaño aproximado del ADN bacteriano, la presencia de plásmidos u otros elementos
genéticos móviles, así como la integridad del ADN en la muestra analizada. Estos resultados
son fundamentales para comprender la composición y características del ADN bacteriano,
así como para investigaciones relacionadas con genética bacteriana, resistencia a antibióticos
y biología molecular en general.
 La detención de plásmidos mediante electroforesis en gel de Agarosa es una indicación
directa de que la bacteria posee un mecanismo de transferencia genética horizontal en
conclusión es que la presencia de plásmidos o elementos genéticos móviles en la muestra
bacteriana analizada sugiere la existencia de un potencial para la transferencia de genes y la
propagación de características genéticas adicionales, lo que puede tener implicaciones
significativas en términos de adaptación y supervivencia bacteriana.

 La integridad del ADN bacteriano es fundamental para asegurar la funcionalidad y la

capacidad de replicación del material genético, esto sugiere que la muestra de ADN
bacteriano es de alta calidad y apta para posteriores análisis y estudios genéticos. Además,
también indica que las condiciones de manipulación, extracción y almacenamiento del
ADN bacteriano han sido adecuadas, evitando así la degradación o fragmentación del
material genético. En conclusión, es que la visualización de bandas de ADN bacteriano
bien definidas y sin fragmentación en la electroforesis en gel de agarosa indica la
integridad y estabilidad del ADN en la muestra analizada, lo cual es esencial para realizar
análisis genéticos precisos y confiables.
 VIII. RECOMENDACIONES
 Procurar que la agarosa sea purificada para que las reacciones sean
óptimas.

 Si se trata de material contaminado realizar proceso de purificación

que interfieren con las enzimas utilizadas.

 Priorizar los cuidados del proceso los factores que afectan la

migración

del ADN atreves de geles de sacarosa.

 Se sugiere asegurarse de que las modificaciones químicas sean

exactas para que el proceso se desarrolle de forma ideal

 Utilizar estándares para estimar los tamaños de la molécula de ADN.

 Utilizar las reglas de bioseguridad para protegerse en especial de

reactivos corrosivos.

IX. ANEXOS

Figura 1. Estamos pesando la agarosa

en la balanza solo 1g Figura 2. Mezclamos agua destilada y
la agarosa en el recipiente de vidrio
con tapa.
Figura 3. Metemos al horno microondas La mezcla Figura 4. Metemos la mezcla al congelador

Figura 5. Manipulamos el LADDER Figura 6. Sacamos los peines.

de nuestro gel.

Figura 7. Preparamos TDA 50X Figura 8. Activamos la cámara

Electroforética y esperamos los resultados. con agua destilada.

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
X. Bibliografía

Gutiérrez, J. G. (2002). PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA TAQ DNA

POLIMERASA A PARTIR DE E.COLI RECOMBINANTE . Ciencia UANL, 400.
Lopez, S. R. (2020). genoma para eliminar contaminantes en medicamentos de proteínas
recombinantes. Biofarma, 20.
Miliwebsky, E. (2005). Validación de una técnica de PCR múltiple para la detección de
Escherichia coli productor de toxina Shiga. Rev. argent. microbiol, 450.
Ramírez, A. (2005). LOCALIZACIÓN MOLECULAR MEDIANTE PCR INVERSO DEL
SITIO DE INSERCIÓN DE UN TRANSPOSON Tn10 LIGADO A gntS EN MUTANTES
DE Escherichia coli. Ciientífica Venezolana, 143.
Vazques, A. R. (2010). CLONACIÓN MOLECULAR, EXPRESIÓN HETEROLOGA Y
PURIFICACIÓN DE YFML: UNA RNA HELICASA DE LA FAMILIA DEAD.
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO, 51.