CÓDIGO: P-QB-GU-10.002.

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GESTIÓN DE LABORATORIOS
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OBJETIVO

Conocer una de las reacciones de oxidación celular que ocurren en el Ciclo de

Krebs.

ALCANCE

El estudiante iniciará por conocer una de las reacciones involucradas en el Ciclo

de Krebs y al finalizar la práctica deberá integrar el concepto bioquímico de
oxidación celular.

GENERALIDADES

INTRODUCCIÓN

El Ciclo de Krebs, vía final común en la degradación de las moléculas

combustibles (azúcares, ácidos grasos y aminoácidos), se realiza en la
mitocondria (corpúsculo alargado, de mitos, hilo y khondrion, dim. De khondros,
corpúsculo) y abarca cuatro reacciones de oxidación, entre las que se encuentra la
conversión de Succinato en Fumarato. Esta reacción es catalizada por una enzima
de la membrana mitocondrial interna, la Succinato Deshidrogenasa, que se une en
forma covalente con una coenzima (FAD) y a través de la cual realiza la extracción
de dos átomos de Hidrógeno del Succinato, con la concomitante reducción de
FAD hasta FADH2.

La actividad de la enzima puede detectarse en el laboratorio mediante el uso de

moléculas indicadoras en forma oxidada, cuya reducción por FADH 2 puede
inferirse por el cambio de color del indicador. En presencia del inhibidor
competitivo Malonato, la reacción no se llevará a cabo.

PROTOCOLO

1. Preparación del Extracto Enzimático

Después de lavar el tejido (5 g de corazón de bovino) con agua destilada, córtelo

en pequeños trozos, colóquelo en un mortero de porcelana, al que ha debido
agregar un poco de arena lavada. Macere, agregando lentamente un Tampón de
Fosfatos pH 7.4 (aproximadamente 5 ml), hasta formar una pasta. Continúe
añadiendo Tampón (unos 15 ml) y transfiera la suspensión a un vaso de
precipitados. Colóquelo en hielo durante 10’ y agite, suavemente, de vez en
cuando.
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Centrifugue a 1500 r.p.m. durante 10 minutos, deseche el precipitado y guarde el

sobrenadante que, entre las muchas enzimas y componentes celulares, contiene
la enzima Succinato Deshidrogenasa.

Sugerencia. Lea cuidadosamente los puntos 2 al 5 y prepare los 4 tubos antes de

colocarlos al baño maría.

2. Preparación de un “tubo blanco”

El “tubo blanco” o “patrón” se emplea como elemento de comparación. Prepárelo

en la forma siguiente: vierta 3 ml de Tampón de Fosfato pH 7.4 y 0.5 ml del
indicador de la reacción (2,6-Diclorofenol Indofenol, concentración 5 x 10-5 M) y
úselo en el próximo paso.

3. Detección de la Actividad de la Succinato Deshidrogenasa

En el tubo en el que va a efectuar la reacción, vierta 2.0 ml de Tampón de Fosfato

pH 7.4, 0.5 ml del indicador y 1 ml de Succinato de Sodio 0.25 M.
Durante 5’, incube ambos tubos en baño María a 37oC. Sin sacar los tubos del
baño, adicione a cada uno 1.0 ml de extracto enzimático. Observe
cuidadosamente, discuta con su compañero de grupo y determine qué ha
sucedido.

4. Efecto del Incremento de la Concentración de Enzima

Tome otro tubo de ensayo y adicione en él 1 ml de Tampón Fosfato pH 7.4, 0,5 ml

de indicador y 1 ml de Succinato de Sodio 0.25 M.
Durante 5 minutos incúbelo junto con los otros tubos y luego adicione en él 2 ml de
sustrato enzimático (se duplica la concentración de la enzima). Observe
cuidadosamente, discuta con su compañero de grupo y determine qué ha
sucedido.

5. Efecto Inhibidor del Malonato

Para evaluar el efecto del Malonato, tome otro tubo de ensayo y adicione en él 1
ml de Tampón Fosfato pH 7.4, 0,5 ml de indicador, 1 ml de Succinato de Sodio
0.25 M y 1.0 ml Malonato de Sodio 0.67 M.
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Durante 5 minutos incúbelo junto con los otros tubos y luego adicione en él 1 ml de
sustrato enzimático. Observe cuidadosamente, discuta con su compañero de
grupo y determine qué ha sucedido.

BIBLIOGRAFÍA

 OSPINA, Blanca Lucía. Introducción a la Bioquímica. Universidad Nacional

de Colombia Sede Palmira.

 HERRERA, Emilio. Elemento de Bioquímica. México: Interamericana-

McGraw-Hill, 1993.

 LEHNINGER, Albert. Biochemistry. 2nd ed. New York: Worth Publishers,

1975.

 STRYER, Lubert. Bioquímica. 4 ed Trad. J. Macarulla. Barcelona, 1995.

Blanca Lucía Adriana Valencia C. Carmen Elena

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Ospina Giraldo Johannes Delgado O. Mier Barona

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