COLECCIÓN Y MANEJO DE

OVOCITOS

LUISA ECHEVARRÍA CUREÉ

 Recuperación de Fecundación
Superovulación embriones in vitro

Criopreservación

Sincronización Transferencia de Transferencia

de celos embriones nuclear

2
Santiani A. 2008. Biotecnologías Reproductivas en Ganado Bovino
 OVOCITO
 a) Células haploides
 b) Requerimiento energéticos especiales
 c) Almacena transcritos y proteínas
 d) Le afectan cambios pH, T° , luz, ROS, etc.

Células de GRANULOSA
 a) Células somáticas
 b) Producen factores de crecimiento, estrógenos, procesan
colesterol, etc.
 c) En folículos antrales, existen las células de cúmulo, que son
diferentes a las células murales. Las células del cúmulo ayudan
en la maduración del ovocito.

Células TECA
 a) Producen factores de crecimiento y andrógenos.
 b) Podrían contribuir a la activación de folículos primordiales
 FORMAS DE COLECCIÓN DE
OVOCITOS
◦ Ovarios de camal
◦ Disección individual de los folículos (Sato y col., 1990), corte y fragmentación de ovarios (Takagi y col.,
1992; Hamano y Kuwayama, 1993),

◦ Aspiración de folículos antrales in vivo guiado.

◦ Punción y aspiración de folículos antrales por medio de ultrasonografía (Pieterse y col., 1988) en vacas
de alto valor genético, 10-20 ovocitos por ovario
◦ Los ovocitos se obtienen generalmente de folículos antrales mayores a 2 mm y menores a 6-7 mm de
diámetro ya que ovocitos de folículos más pequeños, carecerían de competencia meiótica en cultivo
(Motlik y Fulka, 1986), vale decir, serían incapaces de completar la maduración nuclear y son incapaces
de experimentar la ruptura de la vesícula germinativa después de su aislamiento de las células de la
granulosa.

◦ Los ovocitos de folículos más grandes a menudo se encuentran en procesos de atresia; es por ello,
probablemente, que los mayores porcentajes de fecundación y desarrollo se obtengan con ovocitos
de folículos entre 2-7 mm como lo demuestran los trabajos de Pavlok y col. (1992).
HTTPS://WWW.YOUTUBE.COM/WATCH?V=4OJU7YNZVUS
Protocolos de Estimulación
Ovárica

FSH
PMSG
HMG
OVARIOS DE VACA DE CAMAL
Colecta de ovocitos ovarios de camal
MADURACIÓN DE OVOCITOS
Mg MV Luisa Echevarría Cureé
OVOGÉNESIS
 MADURACIÓN OVOCITARIA

 La maduración nuclear y Figura 1. Ovocitos

citoplasmática ocurre in bovinos madurados
vivo durante el crecimiento in vitro con medio
folicular y la ovulación. Este de cultivo 199
desarrollo ovocitario va de la suplementado.
mano con la maduración folicular, Observación con
siendo ambos procesos inducidos microscopía de
contraste de fase.
por cambios característicos en los a: Eliminación del
niveles plasmáticos de las primer corpúsculo
gonadotrofinas. polar
b: Inmaduro.
 El segundo arresto en metafase (De los Reyes, 1992
dos se mantiene hasta que el
ovocito sea fecundado o
activado partenogénicamente,
completándose la meiosis con la
consiguiente eliminación del
segundo corpúsculo polar.
 Maduración citoplasmática
 Redistribución de las organelas citoplasmáticas,
 Cambios en la dinámica de los filamentos del citoesqueleto
 Maduración molecular.

 Redistribución de organelas citoplasmáticas.

Durante la maduración, la posición de las mitocondrias, localización
periférica a distribución dispersa en todo el citoplasma.
La cantidad de ribosomas y la síntesis de proteínasnaumenta a partir del
inicio de la maduración.
En el estadio de GV el retículo endoplásmico se encuentra
uniformemente distribuido en el citoplasma, pero al final de la maduración
se localiza en la zona cortical.
 Maduración citoplasmática
 Los filamentos que componen el citoesqueleto son los
microtúbulos, los filamentos de actina y los filamentos
intermedios, y son los responsables de la segregación de
los cromosomas durante la meiosis.

 La maduración molecular ocurre durante el crecimiento y

maduración del ovocito y se refiere a la transcripción,
almacenamiento y procesamiento del ARN mensajero que
va a ser traducido en proteínas por los ribosomas. Estas
proteínas estarán involucradas tanto en la maduración del
ovocito como en los eventos subsiguientes como la
fecundación, la formación de pronúcleos y el desarrollo
embrionario temprano.
 Maduración nuclear
 Cuando la meiosis se reinicia después del pico preovulatorio de LH y los
cromosomas vuelven a condensarse, el número de quiasmas disminuye y
los cromosomas homólogos quedan unidos solo por sus extremos.
 Al término de la profase I se produce la ruptura de la envoltura nuclear,
también conocida como ruptura de la vesícula germinal y los
microtúbulos del huso se unen a los cinetocoros.
 En la metafase I, los cromosomas homólogos se hallan dispuestos en el
plano ecuatorial, unidos entre si por los extremos, mientras que son
traccionados hacia los polos opuestos por los centrómeros.
 Al llegar al estadio de metafase II los cromosomas se encuentran
dispuestos en el plano ecuatorial con cada cromátida hermana unida
por el centrómero a polos opuestos del huso. En este punto la meiosis se
arresta nuevamente y se reiniciará cuando el ovocito sea
fecundado por un espermatozoide.
  La Maduración in vitro (MIV) es una técnica
de reproducción asistida que consiste en
obtener que ovocitos inmaduros (de
folículos entre 2 y 10 mm) logren
reiniciar meiosis luego que son
removidos del folículo. Estos ovocitos se
MADURACIÓN IN VITRO encuentran en estadio de vesícula germinal
(ovocito inmaduro) y, tras el proceso de
maduración nuclear, alcanzarán el estadio
de metafase II (ovocito maduro).
 La meiosis es reiniciada debido a que se
eliminan los diversos factores que
mantienen arrestado al ovocito en estadio
de VG y son expuestos in vitro a las
gonadotropinas que estimulan la
 Maduración ovocitaria (Edwards RG, 1965)
Características de ovocitos para MIV
 1. Niveles hormonales (dependientes del estadío de
desarrollo)
 2. Complejos cúmulo ovocito no expandidos
 3. Ovocitos de tamaños variados
 4. Tasa de maduración dependiente de la especie.

ADITIVOS CLÁSICOS PARA MEDIOS PARA MIV

1. FSH (0.075 a IU/ml)
2. HCG (0.1 – 10 UI)
3. EGF (10 ng/ml)
4. Piruvato
5. Estradiol (1ug/ml)

Tiempo de maduración: 24 – 48 horas

Deficiencia en expansión y mucificación de las células del cúmulo

 Maduración de ovocitos
 Ovocito colectado: Profase I (diploteno).
 Se reinicia la división meiótica hasta metafase II.
 Ovocitos provenientes de folículos <6 mm maduran in
vitro en 20 - 24 h.
 90% alcanza su maduración.

21
SISTEMAS DE MADURACIÓN IN VITRO
Los sistemas de maduración in vitro deben asegurar que el ovocito complete:

 Maduración nuclear,
 Capacidad de ser fecundados
 Capacidad de continuar su desarrollo.

 Dependen de la selección correcta de los ovocitos para madurar en el

laboratorio es crucial para la producción de embriones.
 Buena selección de los ovocitos a madurar in vitro se basa normalmente
en escoger aquellos con el citoplasma homogéneo no granular ni
polarizado y con células del cúmulo intactas rodeando al gameto, ya
que ellos representan los mayores porcentajes de maduración (Leibfried y
col., 1989; De Loos y col., 1989, De los Reyes y col., 1994).
Sistema OPU-IVF Maduración
espermática

Ovum pick-up
(OPU) Ovocitos
Maduración Fecundación

Criopreservación

ET
Cultivo embriones

Blastocisto
23
CONSIDERACIONES EN LA MADURACIÓN IN VITRO

 La remoción de todas las células de la corona y del cúmulo previo a la

incubación, se relaciona a una disminución del reinicio meiótico (Sirard y
First, 1988); pues los ovocitos denudados de las células del cúmulo son
incapaces de responder a la LH y FSH, ya que estas células son las
mediadoras del efecto de las gonadotrofinas (Ball y col., 1983; Muller y
Behrman, 1986; Brackett y col., 1989; Zuelke y Brackett, 1990; Sirard y col.,
1992).

 Se puede añadir "células colaboradoras" como las células de la granulosa;

concentraciones bajas (1 a 5 x 106/ml) de estas células estimulan la
maduración nuclear (Sirard y col., 1992), aunque inicialmente retarden el
reinicio meiótico.

 Se ha demostrado el efecto positivo de la adición de factores del

crecimiento epidermal (EGF) en los medios de maduración ovocitaria (Park
y Lin, 1993).

 Los ovocitos bovinos reinician la meiosis en una gran variedad de medios

desde una solución salina simple (Leibfried y col., 1989), hasta el medio 199
(TCM199), se han obtenido, en comparación a otros medios, mejores
porcentajes de maduración y desarrollo posterior in vitro (Bavister y col.,
1992; Rose y Bavister, 1992).
SUPLEMENTOS DEL MEDIO DE MIV
 La suplementación del medio con gonadotrofinas y estradiol ha probado
tener un favorable efecto, especialmente en lo que se refiere al desarrollo
post maduración (Xu y col., 1986; Younis y col., 1989).

 La LH mejora las condiciones de maduración in vitro, modificando el

ambiente nutricional ya que aumenta la energía disponible para el
ovocito; este efecto metabólico se debería al incremento de la glicólisis
mediante la oxidación de la glucosa mitocondrial (Zuelke y Brackett,
1992). La LH además, impide los efectos inhibitorios que actúan sobre
el gameto, logrando de ese modo la ruptura de la vesícula germinal
(Downs, 1993).
 La FSH, por otra parte, induce in vitro la expansión de las células de
cúmulo en bovinos, a través de la síntesis de piruvato y ácido
hialurónico (Ball y col., 1983, 1984). Se ha sugerido además que la FSH
y el estradiol participarían en el bloqueo a la poliespermía durante la
fecundación, a través de la síntesis previa de los gránulos corticales
(Karlach, 1987).
 Ovocitos madurados sin estradiol disminuirían su capacidad de
segmentarse normalmente y lograr un desarrollo posterior (Sirotkin, 1992).
Cultivo de ovocitos

MedioTCM-199 + 5% CS
Volumen de gota 100μl
No. de ovocitos 20
Medio/ovocito 5μl/oocyte
Periodo de cultivo 20-22 h
Atmósfera 5% CO2

Lavar los ovocitos 2 veces en el medio, luego transferir los ovocitos a una
gota. 26

K.Imai, NLBC
 Maduración

Petri lavado Petri lavado Gotas 100 µl

https://www.youtube.com/watch?v=1glI1uhE0Zg
27
Maduración de ovocitos (IVM)
Medio: TCM199 + 5% CS + antibioticos

Suplemento: FSH, LH, E2, EGF,IGF-I,

cysteamine,
ß-mercaptoethanol
Gota 600 µl Aceite
mineral Gotas 600 µl : 80 ovocitos
Gotas 100 µl: 20 ovocitos

Incubación: 20-22 h a 38.5° , 5% CO2

Gotas 100 µl
28
Factores que afectan IVM
1. Medio (TCM199 es mejor que CR1aa)
2. Suplemento (FSH, E2, LH, EGF, IGF-I etc.)
3. Lavado de ovocitos
4. Densidad de ovocitos
5. Co-cultivo con células de la granulosa
6. Tiempo entre beneficio e inicio del cultivo (8 h)
7. Temperatura de transporte de ovarios (25, no a 37°)

29
Factores que influyen en Maduración de ovocitos
 La temperatura utilizada en los cultivos de células mamíferas es 37°C.
En los cultivos de gametos bovinos, en cambio, se ha utilizado
rutinariamente 39°C, por ser ésta la temperatura corporal de la especie y por
haber probado mejorar significativamente los porcentajes de fecundación in
vitro, en comparación a otras temperaturas (Lenz y col., 1983).
 La duración óptima del tiempo de maduración, se ha estandarizado a un
período de 22-26 horas debido a que en ese lapso se lograría completar
satisfactoriamente la maduración hasta metafase II, obteniéndose, además,
mayores tasas de segmentación posterior. (Xu y col., 1986; Lim y col.,
1992); no obstante, hay autores que señalan que no existirían diferencias
notables al disminuir este tiempo a 18 horas (Prokojiev y col., 1992).

https://www.youtube.com/watch?v=1glI1uhE0Zg
Manipulación y Calidad
de ovocitos
 Competencia meiótica = Maduración meiótica

Calidad del ovocito

(competencia) = Competencia para desarrollar un embrión = Maduración citoplasmática
potencial de desarrollo

Fertilización y Desarrollo embrionario exitosos

 Definición de “Ovocito ideal” ( Buena calidad)

 Estructura de las células del cumulus dento del COC

Criterio
morfológico –  Morfología del citoplasma del ovocito: color, inclusiones (vacuolas)
y granulidad; estructuras extracitoplasmáticas como zona
pelúcida, primer cuerpo polar, espacio perivitelino.
tradicional https://www.youtube.com/watch?v=UDbzx9FypqY

 Se debe hacer para evaluar sistemas de cultivo de ovocitos in vitro

.
Clasificación de ovocitos
DE ACUERDO AL CUMULUS OOPHRURUS:

 Tipo I
Presencia de corona radiada y varias capas compactas de células cúmulo.

 Tipo II
Presencia de corona radiada y 2-3 capas compactas de células cúmulo.

 Tipo III
Corona radiada y capas celulares incompletas del cúmulo.

 Tipo IV
Cúmulo activado expandido / disociado. Ovocito desnudo
35
 Clase 1 Clase 3
Ovocitos de
alpaca
colectados
Clase 4
Clase 2
 Ovocitos de gata clasificados como aptos para maduración in vitro
(categorías I y II, según Wood y Wild, 1997).

37
 Ovocitos de gata clasificados como no aptos para maduración in vitro
(categorías III y IV, según Wood y Wild, 1997).

38
 Definición de “Ovocito ideal” ( Buena calidad)

 Maduración in vitro (IVM)

 Expansión y mucificación de las células del cúmulus

Criterio  Apariencia del ovocito (presencia de estructuras normales, tamaño del cuerpo polar,
morfológico – espacio perivitelino, gránulos citoplasmáticos)

tradicional
 Determinación de la capacidad para reinicia la meiosis.

 LA MADURACIÓN NUCLEAR NO GARANTIZA LA MADURACIÓN

CITOPLASMÁTICA
Cúmulo compacto (A): Células firmemente unidas al ovocito con superficie
regular y suave sobre el COC.

Cúmulo expandidos (B): Células separadas del ovocito con matrix visible
entre células del cúmulus.
40
Celular y
Bioquímico
Tinción Hoechst
Tinción de ADN

Glinger y De Felici, (2002)

Celular y
Bioquímico
Tinción Hoechst
Tinción de ADN

Toustani et al 2013
Evaluación
Molecular
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
CONGELACIÓN Y VITRIFICACIÓN DE Mg MV Luisa Echevarría Cureé
OVOCITOS
CRIOPRESERVACIÓN DE OVOCITOS
Técnica que permite mantener intactas las células para su uso posterior a
través del uso de Crioprotectores y sometiéndolas a temperaturas de -196 C
del Nitrógeno líquido.

La congelación y la vitrificación de ovocitos, embriones y espermatozoides

son dos técnicas distintas empleadas en la Biotecnología Reproductiva y
Reproducción asistida.
CRIOPROTECTORES
Los crioprotectores son sustancias utilizadas en todos los protocolos de congelación de
óvulos, ya que consiguen protegerlos de todos los efectos lesivos del procedimiento.
En función de su capacidad para penetrar en el interior celular, los crioprotectores se
clasifican en:
Permeables
Sustituyen el líquido acuoso del interior del óvulo, impiden la formación de cristales de hielo y
ayudan a contrarrestar el efecto de las altas concentraciones de solutos. Los más utilizados
son el glicerol, el dimetilsulfóxido (DMSO), el propanodiol (PROH) y el etilen-glicol (EG).
No permeables
Favorecen la deshidratación celular controlada, lo cual también impide la formación de
cristales de hielo y el colapso celular. Los más utilizados son la polivinilpirrolidona (PVP),
dextranos, albúmina y azúcares como la sacarosa y la glucosa.
Normalmente, los crioprotectores permeables y no permeables se utilizan de forma conjunta
para lograr una mayor eficacia.
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA CONGELACIÓN
El ovocito tiene un tamaño de 0.14 mm y un alto contenido en agua. Además, antes de su
fecundación, se encuentra en un estadio conocido como metafase II, en el que la división de su
material genético se encuentra detenida.

Las bajas temperaturas pueden provocar la despolimerización de los microtúbulos, lo cual

conlleva la desorganización y dispersión de los cromosomas.

Por otra parte, el alto contenido en agua aumenta la probabilidad de que se formen cristales
de hielo, los cuales provocarían daños en las estructuras internas del óvulo y en su
membrana celular.
Por último, la deshidratación excesiva del óvulo durante la congelación también puede dar lugar al llamado efecto
soluto (aumento en la concentración de sales intracelulares) y a la teoría del mínimo volumen, los cuales pueden llevar al
colapso irreversible y muerte celular.

Se debe controlar los siguientes factores:

La tasa o velocidad de enfriamiento

La deshidratación y el destino del agua intracelular
La relación superficie/volumen del óvulo
El uso de agentes crioprotectores
MÉTODOS DE CRIOPRESERVACIÓN
Congelación lenta de óvulos
Consiste en hacer que la temperatura descienda poco a poco, al mismo tiempo que se
deshidrata la célula con el uso de los crioprotectores, para minimizar la formación de cristales
de hielo, aunque puede haber un efecto tóxico debido al tiempo de exposición prolongado a
los crioprotectores.

Para llevar a cabo el proceso se necesita un congelador programable en el que la

temperatura descenderá de forma gradual hasta una temperatura comprendida entre los -40
y los -70 °C. A continuación, se sumergirán los óvulos en nitrógeno líquido, donde alcanzarán
rápidamente los -196 °C.

Para la descongelación de los ovocitos, se extraen del nitrógeno líquido las pajuelas donde
están contenidos, se mantienen 30 segundos a temperatura ambiente y se sumergen en un
baño a 31 °C, donde se liberarán los óvulos del interior de la pajuela.

Los óvulos se rehidratan de forma secuencial en diferentes medios de cultivo, se eliminan los
restos del crioprotector y finalmente recuperan su estructura normal.
MÉTODOS DE CRIOPRESERVACIÓN
Vitrificación de ovocitos
La vitrificación es una técnica de congelación ultra rápida, con una velocidad de enfriamiento
de hasta 23.000 °C/min.
El agua que hay en el interior celular no tiene tiempo a cristalizar, pasa de un estado líquido a
un estado vítreo, un sólido amorfo similar a una gelatina dura.

La vitrificación requiere una alta concentración de crioprotectores para tener éxito.

No obstante, para evitar su toxicidad, se han llevado a cabo dos estrategias:

Reducir al máximo el tiempo de exposición

Utilizar el mínimo volumen de medio para vitrificar

Estas estrategias permiten que sea posible aumentar la velocidad de enfriamiento

y evitar los posibles daños a los óvulos.
VITRIFICACIÓN DE OVOCITOS
Durante el proceso de la vitrificación, se pasan los óvulos por unos medios de equilibrado con
concentraciones crecientes de crioprotectores. Así se deshidratan los óvulos para,
seguidamente, colocarlos en un suporte de vitrificación con el menor volumen de medio
posible.

Por último, se introducen los óvulos directamente en nitrógeno líquido a -196 °C, por lo que la
congelación es inmediata.

La técnica de desvitrificación también sigue el mismo procedimiento de pasar los óvulos por
medios de equilibrado para rehidratar la célula y eliminar los crioprotectores.
VITRIFICACIÓN DE OVOCITOS
 CRYOTOP

KIT A SATO ®
Vitrificación y desvitrificación de blastocisto
expandido humano después de
procedimiento. Blastocisto expandido
humano ( a ) Antes del procedimiento, ( b )
during artificial crenación, 140 m m en
diámetro, ( c ) durante la crenación artificial
, 120 m m in diameter, ( d ) after de la
crenación artificial, ( e ) colocado en el
cryotop with solución crioprotectora, and ( f
) 3 h después de desvitrificación.
Vitrificación
https://www.youtube.com/watch?v=smSSxXuCWiM
Desvitrificación
https://www.youtube.com/watch?v=8cpmQRRKni0