MICROBIOLOGÍA I

PRÁCTICAS DE
LABORATORIO
Curso 2022 – 2023

Profesores: Cruz Santos

Olga Zafra

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ÍNDICE:

- Organigrama por días (trabajo autónomo, tutorías previas y prácticas en

laboratorio)
- Introducción al trabajo en el laboratorio
- Normas generales y específicas en laboratorios de microbiología
- PRÁCTICA 1. Preparación de medios de cultivo
- PRÁCTICA 2. Siembra de microorganismos
- PRÁCTICA 3. Manejo del microscopio y observación de microorganismos
Observación macroscópica
Observación microscópica
Visualización de bacterias y levaduras in vivo
Tinciones
Tinción simple positiva
Tinción simple negativa
Tinción Gram
Tinción de esporas
Tinción de hongos filamentosos
- PRÁCTICA 4. Efecto de las altas temperaturas sobre los microorganismos
Cálculo del tiempo de reducción decimal
Cuantificación de esporas de B. cereus
- PRÁCTICA 5. Antibiosis
CMI en placa
- PRÁCTICA 6. Crecimiento y control microbiano
Tiempo de generación
Efecto de antibióticos bacteriostáticos y bacteriolíticos

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ORGANIGRAMA DE LAS PRÁCTICAS:

- Trabajo autónomo del alumno previo a las sesiones de prácticas

En este tiempo el alumno debe leer el guion y ver los videos asociados con el
objetivo de entender por qué y cómo se van a hacer las distintas prácticas de
laboratorio. Los profesores pueden preguntar aleatoriamente a los alumnos
sobre la información suministrada en estos recursos y la respuesta se tendrá en
cuenta a la hora de evaluar las prácticas.

- Trabajo en el laboratorio de prácticas (guiado por profesores)

Los alumnos accederán al laboratorio docente para hacer directamente los
experimentos siguiendo el organigrama indicado. Para entrar en el laboratorio
de prácticas y, por tanto, realizar las prácticas obligatorias, será
imprescindible llevar bata. Recordad también que se considerará que no se
asiste a una sesión práctica si se llega más de 30 minutos tarde o en dos
días distintos se llega 15 minutos tarde. La no asistencia a una práctica sin
justificación conlleva el suspenso de la asignatura en la convocatoria
ordinaria.

• Día 1
- Protocolo de preparación de medio LB líquido y sólido.
- Siembra de bacterias y levaduras
- Diluciones decimales seriadas de cultivos bacterianos líquidos
- Observación macroscópica de los microorganismos de la colección

• Día 2
- Experimento para calcular el tiempo de reducción decimal de la bacteria de
cada pareja.
- Cultivo líquido (preinóculo) de la bacteria correspondiente de cada pareja para
trabajar el día 3.
- Observación microscópica de bacterias in vivo (motilidad)
- Tinción Gram, tinción negativa (cápsula) y visualización de levaduras, mohos y
Streptomyces.

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 • Día 3
- Experimento para cálculo de esporas en Bacillus cereus en cultivo de 48 horas
- Recoger los datos de los experimentos del día anterior
- Preparar un cultivo líquido (preinóculo) de Escherichia coli para el día 4.
- Antibiograma: cálculo de CMI por método Kirby-Bauer
- Microscopía: tinción de esporas de B. cereus

• Día 4
- Realización de curva de crecimiento con E. coli y efecto de antibióticos
- Recoger datos de los experimentos del día anterior y hacer los cálculos
correspondientes que no se hayan hecho todavía.
- Si no hubiera dado tiempo a hacer alguna de las tinciones, durante los tiempos
de incubación se puede aprovechar para hacerlas.
- Puesta en común de resultados y resolución de dudas por parte del equipo
docente.
- Realización y entrega de un ejercicio individual que será parte de la nota del
bloque de prácticas de la asignatura.

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INTRODUCCIÓN A LAS PRÁCTICAS DE LA ASIGNATURA “MICROBIOLOGÍA I”

Objetivos

• Adquirir destreza en el manejo y desarrollo de técnicas básicas propias de un

laboratorio de microbiología.
• Desarrollar capacidades de observación, organización, aplicación práctica de
los conceptos teóricos y evaluación de resultados.
• Desarrollar hábitos de trabajo seguros y una correcta gestión de residuos
biológicos.

Antes de empezar

• Antes de empezar la primera práctica, el alumno debe leer estas normas,

aprender el nombre del material de laboratorio y conocer las normas de
seguridad.
• El material necesario para la asistencia a las clases prácticas es: bata de
laboratorio (imprescindible para poder acceder al laboratorio de prácticas),
guion de prácticas, calculadora, cuaderno, rotuladores de vidrio y bolígrafos.
Sería deseable traer también mechero.
La Tablet se permitirá únicamente para consultar guion y, como otros objetos
personales, se utilizará con las medidas higiénicas y de seguridad adecuadas
para que no resulte contaminada. Deberá estar con batería suficiente pues no
se permite la carga de dispositivos en los laboratorios docentes
• Antes de empezar cada práctica el alumno debe leer el guion y comprender
el fundamento teórico de la práctica que se va a realizar, así como tener claros
los pasos a dar en el laboratorio.

Durante las sesiones

• El alumno debe ser puntual y no ausentarse nunca sin el permiso del profesor.
• Los enseres personales que no sean imprescindibles para el desarrollo de la
práctica deben guardarse en las taquillas o en un lugar limpio del mismo que

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 indique el profesor. Sobre la mesa de trabajo debe haber el mínimo de objetos
personales, sólo los esenciales para la práctica.
• La limpieza es fundamental. Se debe mantener la mesa de trabajo limpia en
todo momento (sin libros, carpetas, abrigos o cualquier otro material
innecesario para la realización del trabajo del laboratorio). No dejar basura
sobre las mesas, fregaderos o áreas comunes (puntas de micropipeta
utilizadas, resto de soluciones, papeles...).
• No se permite el uso de móviles durante las sesiones de laboratorio. Se podrá
usar para fotografiar resultados, siempre que el profesor lo autorice y se sigan
las normas higiénicas para no contaminar ningún objeto de uso cotidiano

Al finalizar

• El alumno debe limpiar su mesa y todo el material que haya utilizado.

• Los materiales quedarán ordenados al terminar el trabajo y las llaves de agua,
gas y electricidad cerradas.
• Las áreas de trabajo comunes (balanzas, fregaderos, etc.) deben quedar
limpias antes de salir del laboratorio.
• El alumno se lavará las manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio
y recoger sus enseres personales. Así como cada vez que salga del
laboratorio y/o coja algún objeto personal.

CUADERNO DE LABORATORIO

Durante la realización de trabajos prácticos es fundamental la utilización del cuaderno

de laboratorio, en el que se anotarán los protocolos a realizar y completándolo con la
información recibida durante las prácticas, no se debe confiar nunca a la memoria la
retención de un dato u observación. Hay detalles que aparentemente no tienen
importancia, pero que pueden ser cruciales en la interpretación final de los resultados.
Cada alumno deberá mantener su cuaderno de laboratorio actualizado durante la
realización de las prácticas (ya sea en este mismo guion o en un cuaderno). En el
cuaderno deben recogerse todas las preguntas que se realizan en la práctica, así como
otras que el alumno estime de interés, así como los cálculos, la discusión de los
resultados y sus errores.

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En esta asignatura, el cuaderno de prácticas no será objeto de evaluación, pero es una
herramienta de estudio muy interesante y algo que los alumnos de Biotecnología deben
acostumbrarse a llevar en el laboratorio.

EVALUACIÓN

• La asistencia a todas las sesiones prácticas es obligatoria. La no asistencia a

alguna de las sesiones prácticas sin justificación será condición suficiente
para suspender las prácticas y, por tanto, la asignatura.
Es responsabilidad del alumno comprobar que puede asistir al turno asignado
y, si detecta alguna incompatibilidad justificada, gestionar con tiempo un
posible cambio.
Ante la impuntualidad injustificada y/o repetida de un alumno (un día media
hora tarde o dos días 15 minutos de retraso), el profesor puede no aceptarle
en la sesión práctica, con las consecuencias que ello conlleva.
• Los alumnos pueden consultar la guía docente de la asignatura para
comprobar la evaluación de la asignatura. Según esta guía, el bloque de
prácticas representa el 20% de la nota final de la asignatura y tiene que
aprobarse con, al menos, un cinco sobre diez.
• La evaluación de este bloque de prácticas se hará como se explica a
continuación
1. Aprovechamiento e interés mostrado en el trabajo autónomo previo y
durante las prácticas: se evaluará por una rúbrica que evaluará tanto el
manejo en el laboratorio como el comportamiento, gestión de residuos y
trabajo en esterilidad que muestre el alumno, así como el trabajo previo y
grado de comprensión de cada práctica (15%)
2. Entrega de un informe y/o ejercicios escritos sobre una de las prácticas (el
profesor lo anunciará el último día) (25%)
3. Examen final de prácticas que se realizará el mismo día que el examen
final de teoría y que evaluará la comprensión de las prácticas (60%). Es
obligatorio superar este examen con, al menos, el 50% de la nota para aplicar
el resto de los porcentajes.

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NORMATIVA GENERAL PARA ALUMNOS EN LOS LABORATORIOS DOCENTES

1. En la pizarra del hall de los sofás se indicará el laboratorio asignado a cada

asignatura y grupo.

2. No se puede acceder al laboratorio si no está el profesor.

3. El alumno debe traer su bata y rotulador, y dejar el resto de material en las

taquillas colocadas en cada laboratorio. La taquilla debe quedar vacía al finalizar la
práctica.

4. Está prohibido tener comida y bebida en el laboratorio, así como masticar chicle.

5. No se pueden cargar los móviles en los puestos de laboratorio.

6. En cada laboratorio hay una zona común destinada a:

a. Guantes.

b. Pipetas Pasteur.

c. Tubos Falcon.

Todo este material se encuentra a libre disposición del alumno.

7. En cada laboratorio hay una zona de profesor, delimitada con cinta de color. El
alumno no podrá tocar el material y/o reactivos que se encuentre en esa zona.

8. Cada puesto de laboratorio estará preparado con el material necesario para la

práctica. Además, en la primera balda se encuentra, a disposición del alumno, material
de uso frecuente (micropipetas, puntas, gradillas…), que al finalizar la práctica debe
quedar en el mismo sitio. No se puede tocar el material que se encuentre en la segunda
balda.

9. Cuando se trabaje con material biológico, las puntas se descartarán en un vaso

de precipitados con lejía que se vaciará al final de la práctica.

10. Al finalizar la práctica, todo el material debe quedar limpio y sin rotular en el
puesto de trabajo, excepto las pipetas de vidrio que quedarán en los pipeteros de las
pilas. Las basuras de puntas deben quedar vacías. Todos los equipos se dejarán
desenchufados, tal cual estaban al comienzo de la sesión.

11. Deben quedar limpias y recogidas también las zonas comunes, incluyendo las
vitrinas de gases.

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12. Los taburetes deben dejarse debajo de las mesas y no ocupando los pasillos por
motivos de seguridad.

13. Los siguientes equipos requieren un cuidado especial, y deberán seguirse las
siguientes normas para su limpieza:

a. pHmetros: revisar que el electrodo quede sumergido en suficiente

cantidad de solución de electrolito y bien cerrado. Los tubos de los patrones de
pH deben quedar rellenos hasta la marca, aunque no es necesario cambiar la
solución cada vez que se usen, sólo rellenar.

b. Espectrofotómetros: se deben apagar primero y luego desenchufar.

Revisar que no quede dentro la cubeta de muestra.

c. Microscopios: limpiar cada uno de los objetivos con una toallita de tela
impregnada en una solución de etanol:acetona que proporcionará el profesor, con
especial atención a los de 40X y 100X. Si se usa aceite de inmersión, limpiar el
aceite con esa misma solución nada más terminar de utilizarlo. El microscopio
primero se apaga y después de desenchufa. Antes de salir, el microscopio debe
quedar sin muestra, con la platina bajada y con el objetivo de 4X.

d. Buretas: deben lavarse bien y dejarse colocadas boca abajo en el

soporte, con la llave abierta.

14.- Los alumnos deberán utilizar siempre la bata así como los equipos de protección
que se ponen a su disposición (guantes, gafas, mascarillas, etc).
15.- Los alumnos serán responsables de la correcta utilización del material de
laboratorio, preguntando siempre antes al profesor en caso de duda y avisando en el
caso de que ocurra algún problema.

NORMAS PARA EL ALUMNO DIRIGIDAS AL MANEJO DE MICROORGANISMOS

El laboratorio de microbiología no es necesariamente un lugar peligroso si se toman las

precauciones debidas y se realizan adecuadamente todas las operaciones. Las normas
más importantes para estas prácticas se resumen a continuación:

1. Cualquier alumno que sufra alguna alteración de sus defensas o

inmunocompetencia debe comunicarlo al profesor antes de comenzar las
prácticas.

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2. Es obligatorio utilizar batas abrochadas siempre que se esté trabajando en el
laboratorio. Durante el periodo de prácticas, la bata no debe utilizarse fuera del
laboratorio.
3. Debe respetarse la prohibición de beber, comer, masticar chicle o fumar en el
laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca ningún objeto (bolígrafos...) o
tocarse los ojos, nariz y boca.
4. No está permitido tener objetos personales en la mesa de trabajo salvo aquellos
objetos que se necesiten durante el desarrollo práctico.
5. Está prohibido realizar experimentos diferentes a los indicados en el guion de
prácticas sin consultar primero al profesor.
6. Está prohibida la entrada en el laboratorio de prácticas de personas ajenas a
éstas.
7. Antes de usar por primera vez un reactivo leer siempre la etiqueta. Observar los
símbolos y frases de seguridad que señalan los riesgos más importantes
derivados de su uso y las precauciones que hay que adoptar para su utilización.
En caso de duda, preguntar al profesor.
8. Nunca se debe pipetear con la boca: utilizar los pipeteadores o las micropipetas
disponibles en el laboratorio.
9. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben
evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio.
10. Se deben usar los mecheros Bunsen con precaución, no dejando material
inflamable cerca y evitando el posible contacto con pelo y ropas. Se comprobará
que se ha apagado el gas al finalizar el experimento y al abandonar el
laboratorio.
11. Nunca debe sacarse ninguna muestra del laboratorio.
12. Deposite el vidrio roto en un contenedor para vidrio, no en una papelera, tras una
desinfección con etanol al 70%.
13. Deposite las placas y el material sólido contaminado en un contenedor de
residuos biológicos adecuado
14. Inactive con lejía al 10% los cultivos y los líquidos contaminados con
microorganismos
15. Para deshacernos del material contaminado utilizaremos los recipientes
adecuados. Todos los materiales de desecho que hayan entrado en contacto
con microorganismos (como pipetas usadas, placas petri o tubos), deben
colocarse en bolsas de autoclave preparadas para tal efecto y proceder
posteriormente a su esterilización. Las pipetas Pasteur de cristal y los cubres y
portas usados se colocarán en un recipiente especial para vidrio. Nunca se debe

10
 tirar nada por el fregadero o la basura común, salvo indicación del profesor
responsable. En caso de duda habrá que aplicar el principio de prudencia y
descartar el material como si estuviera contaminado
16. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como
espectrofotómetros, micropipetas, microscopios,…, deben manejarse con
cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos.
17. No utilizar ningún aparato eléctrico por primera vez sin atender a las indicaciones
previas del profesor. Si un aparato eléctrico da señales de comportamiento
anormal, avisar inmediatamente al profesor.
18. Ante cualquier incidente, duda o problema (ruptura de material, derramamiento
de microorganismos,..) se comunicará inmediatamente al profesor.
19. Se deben lavar las manos con jabón antiséptico ante cualquier sospecha de
contaminación y siempre antes de salir del laboratorio.

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PRÁCTICA 1. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

1.1 Introducción

El medio de cultivo es la solución de nutrientes utilizada para crecer los

microorganismos en el laboratorio. Según las necesidades de cada microorganismo
(autótrofo, heterótrofo, protótrofo, auxótrofo,...) y nuestros objetivos, elegiremos una
mezcla de nutrientes u otros. De forma externa se les dará la temperatura y oxigenación
necesaria mediante estufas y agitación.

¡ATENCIÓN! RELACIONA ESTA PRÁCTICA CON LOS TEMAS DE TEORÍA

RELATIVOS A LA NUTRICIÓN Y AL CRECIMIENTO DE LOS
MICROORGANISMOS EN EL LABORATORIO

Para empezar a trabajar en cualquier laboratorio de Microbiología se requiere disponer

de una serie de medios de cultivo estériles. Esto es imprescindible para realizar los
experimentos con el microorganismo que deseamos en cultivo puro (axénico) y no tener
resultados confusos debidos a contaminaciones con microorganismos ambientales. Por
tanto, resulta necesario conocer los métodos de preparación de medios y esterilización
utilizados habitualmente en el laboratorio.

¡ATENCIÓN! TAMBIÉN ES IMPORTANTE QUE LO RELACIONES CON EL

TEMA DE TEORÍA RELATIVO AL CONTROL DEL CRECIMIENTO
MICROBIANO.

1.2 Medios de cultivo

Según la cantidad de fuentes de carbono distintas que aportemos en el medio de cultivo,

podemos clasificarlos en:
- Medio Mineral o Basal: sólo contiene sales inorgánicas y no hay ninguna fuente de
carbono orgánica. Este medio sólo se utilizará para crecer microorganismos autótrofos

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- Medio Mínimo o Simple: contiene una única fuente de carbono orgánica y el resto
son componentes inorgánicos que aportan minerales necesarios.
- Medio Rico o Complejo: son medios que aportan dos o más fuentes de carbono
orgánico distintas. Son medios que permiten el crecimiento de la mayoría de los
microorganismos heterótrofos al aportar la gran mayoría de sus requerimientos
nutricionales. Sin embargo, no existen los medios universales.
Los medios ricos podemos clasificarlos en dos tipos:
Un medio rico definido o artificial es aquel cuya composición exacta conocemos
(podemos especificar la cantidad precisa de todos los compuestos que lo forman)
Un medio rico indefinido o natural es aquel que podemos sintetizar, porque tenemos
una receta para hacerlo, pero que porta extractos nutritivos o sustancias cuya
composición química exacta desconocemos (por ejemplo si se añade extracto de
levadura, peptona bacteriológica, ...). Uno de los medios de cultivo más utilizado en las
prácticas, es el LB (Luria Bertani), en su versión líquida o solidificada con agar al 1,5%,
que porta extracto de levadura y triptona por lo que es el típico ejemplo de medio rico
indefinido. El LB es un medio que permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias
que se van a utilizar en estas prácticas, pero no es un medio universal. El medio YPD
que usamos para levaduras también es un medio rico indefinido que contiene sustratos
que favorecen el crecimiento de levaduras.

En los laboratorios de Microbiología también se emplean otros medios. Por ejemplo, los
medios selectivos que contienen inhibidores semi-específicos como el agar de
McConkey, cuyas sales biliares inhiben el crecimiento de la mayoría de las bacterias
Gram positivas. En algunos casos, se utilizarán medios diferenciales, es decir, que
contienen componentes tales como indicadores de pH que cambian de color cuando el
microorganismo realiza una actividad metabólica preferente sobre substratos concretos
(ej. fermentación) y nos informan sobre diferentes grupos metabólicos. Por último, se
pueden usar medios enriquecidos que son medios complejos sobre los que se añaden
nutrientes adicionales para favorecer el crecimiento de microorganismos con grandes
requerimientos (denominados “fastidiosos”), el ejemplo más usual de medio
enriquecido es el agar sangre. Hay muchos tipos de medios que se usan en
microbiología y la gran mayoría son de varios tipos a la vez, por ejemplo el agar
McConkey no solo es selectivo por las sales biliares sino que también es diferencial

13
porque nos va a informar de si el microorganismo fermenta o no lactosa gracias a un
indicador de pH.

TIENES MÁS INFORMACIÓN CON RESPECTO AL CRECIMIENTO DE LOS

MICROORGANISMOS EN EL LABORATORIO (CLASIFICACIÓN Y
FUNCIONES DE LOS DISTINTOS MEDIOS) EN EL TEMA
CORRESPONDIENTE DE TEORÍA

Todos los medios de microbiología pueden ser líquidos o solidificarse mediante la

adición de agar al 1,5% (polisacárido complejo que actúa de gelificante).
Los medios sólidos nos servirán para inmovilizar las bacterias y visualizar colonias. Las
COLONIAS son masas visibles a simple vista que proceden del crecimiento acumulado
de una sola bacteria inicial inmovilizada en ese punto.
La observación de colonias aisladas es importante para:
- Ayudar en la identificación de una bacteria
- Chequear si todas las colonias de una placa son iguales o no, e identificar posibles
contaminaciones
- Iniciar un experimento con un cultivo isogénico a partir de una colonia aislada
- La cuantificación del cultivo (determinación del nº ufc/mL) cuando se realiza siembra
por extensión de una suspensión bacteriana

ES IMPORTANTE QUE TENGAS CLARA LA DIFERENCIA ENTRE UNA

BACTERIA Y UNA COLONIA
TAMBIÉN ES IMPORTANTE QUE TENGAS CLARO CON QUÉ TÉCNICA
DE SIEMBRA PUEDES CUANTIFICAR O NO (PRÁCTICA 2)

1.3 Esterilidad

La presencia de microorganismos en todos los ambientes hace imprescindible que,

para estudiar una bacteria determinada, sea necesario destruir todas aquellas que
pudieran encontrarse contaminando los medios o los instrumentos de trabajo. Esto se
consigue mediante la ESTERILIZACIÓN, consistente en la destrucción de todo
microorganismo.

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En estas prácticas vamos a utilizar fundamentalmente el calor como método de
esterilización, aunque tal y como se ha explicado en las clases teóricas, existen otros
modos de esterilizar. Los medios con contenido acuoso que no sean termosensibles
han de ser esterilizados en el AUTOCLAVE mediante calor húmedo, obtenido por
calentamiento de agua en un depósito hermético del que previamente ha sido evacuado
el aire, con el fin de limitar las oxidaciones. En este sistema el vapor de agua
sobrecalentado a 121ºC (2 atm) o 111ºC (1.5 atm) difunde muy rápidamente, haciendo
que los elementos termosensibles de las células se desnaturalicen, especialmente sus
enzimas.

Por lo tanto, una vez preparados los medios de cultivo hay que proceder a su
esterilización en autoclave, realizada habitualmente a 1 atm de sobrepresión (121ºC)
durante 15 o 20 min., salvo en el caso de medios cuyos componentes sufran
alteraciones tales que los hagan inadecuados para el posterior crecimiento de
microorganismos. Este es el caso de los azúcares utilizados en los ensayos de
fermentación, que se suelen esterilizar a menor presión [0.5 atm. de sobrepresión
(111ºC)] para evitar su "caramelización", una modificación consistente en su oxidación
y consecuente conversión en formas tóxicas para el metabolismo de las bacterias, o en
el caso de la urea, que conviene esterilizarla independientemente por filtración.
Cuando deseamos realizar placas de medio sólido, tras esterilizar el medio con el agar,
y antes de que se enfríe totalmente, se homogeneizará y se verterá sobre placas Petri
en un ambiente estéril, de forma que solidifique en la placa y se mantenga estéril. La
técnica para distribuir el medio en esterilidad se explica en la práctica de siembra de
microorganismos.

PARA PREPARAR UN MEDIO DE CULTIVO LÍQUIDO Y, SOBRE TODO,

UNO SÓLIDO, HAY UNA SECUENCIA LÓGICA PARA QUE QUEDE
ESTERILIZADO Y UTILIZABLE.
PIENSA EL PROTOCOLO DETENIDAMENTE ¿POR QUÉ EL PASO DE
ESTERILIZACIÓN ESTÁ EN ESE PUNTO EXACTO? ¿QUÉ PASARÍA SI
FUERA ANTES O DESPUÉS?

Por otra parte, todo el material de vidrio se esteriliza mediante calor húmedo en el
autoclave o bien calor seco en el Horno Pasteur. Una vez limpio, el material se envuelve

15
en aluminio o se introduce en un contenedor (ej. pipetas en pipetero) y se mantiene en
el horno durante dos horas a 160ºC o en el autoclave en el programa de esterilización.
En el caso de los portainóculos (asas de siembra) que se están utilizando
constantemente, se utiliza el calor directo del mechero, que también sirve para flamear
los bordes de tubos, matraces, pipetas, etc.

1.4 Objetivo de la práctica

Aprender a preparar medios de cultivo (líquido y sólido) para el crecimiento de

microorganismos. Especialmente, adquirir consciencia de la necesidad de esterilización
y en qué momento del protocolo se realiza.

1.5 Procedimiento/Protocolo

El medio LB (Luria-Bertani) es un medio rico en nutrientes y es el caldo común para

crecimiento de bacterias. Su composición por litro es la siguiente:
Bactotriptona (10 g)
Extracto de levadura (5 g)
NaCl (10 g)
1 L de agua destilada
Para la preparación del medio de cultivo LB, se pesan los distintos componentes y se
añaden a un vaso de precipitados. A continuación, se disuelven en agua, se ajusta el
pH a 7.2-7.4 (en nuestro caso no es necesario porque el pH queda ajustado
directamente) y se lleva al volumen final correspondiente utilizando una probeta.
Posteriormente, el medio se reparte en matraces, botellas o tubos de ensayo según
convenga. Los recipientes se aíslan con tapones metálicos o de algodón graso envuelto
en gasa y se esterilizan a 1 atmósfera de sobrepresión durante 20 minutos.
Para preparar medio LB sólido, al LB líquido se le añade, ANTES DE ESTERILIZAR,
15 g. de agar por litro (1,5%), disolviéndolo durante la esterilización. Tras ésta, cuando
aún está caliente, se agita para hacer la disolución de agar homogénea y se extiende
en placas Petri (a 45-50 °C) con cuidado de hacerlo en esterilidad.

• Por parejas preparad medio LB sólido y líquido siguiendo el protocolo:

16
1.- Inicialmente se prepararán 200 ml de medio LB líquido. Para ello, hay que calcular
las cantidades proporcionales de cada componente, pesarlas, disolverlas y enrasar al
volumen final.
2.- Esos 200 ml se dividirán en dos botellas con 100 ml cada una.
3.- Una de las botellas con 100 ml se rotulará (en el cristal) con el nombre de la pareja
y el concepto “LB líquido” y se dejará tal cual.
4.- A la otra botella con los otros 100 ml de LB líquido se le añadirá la cantidad
correspondiente de agar bacteriológico para que quede a 1,5%. Calcula cuánto hay que
pesar y añádelo, no hace falta que esperes a que se disuelva porque esto sucede
durante la esterilización. Rotula la botella (en el cristal) con el nombre de la pareja y el
concepto “LB sólido”.
5.- Todas las botellas se llevarán a esterilizar en el autoclave
6.- Tras la esterilización, la botella con “LB líquido” se reservará en la mesa para que
se enfríe y se utilizará el último día de prácticas.
7.- La botella con “LB sólido” se dejará enfriar hasta unos 50ºC (que podamos
manipularlo sin quemarnos pero que no empiece la solidificación del agar) y, EN
CONDICIONES DE ESTERILIDAD, se repartirá en cuatro placas Petri estériles
(rotuladas previamente en la mitad profunda con el nombre de la pareja). Ahí se dejará
solidificar y se reservarán para utilizarlas otro día durante las prácticas.
¿ENTIENDES TODOS LOS PASOS Y SU SECUENCIA?
SI TIENES DUDAS PREGUNTA AL EQUIPO DOCENTE; CUANDO
LLEGUES AL LABORATORIO TIENES QUE TENER CLARO EL
PROTOCOLO PARA PONERTE A HACERLO

17
PRÁCTICA 2. SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

2.1 Introducción

En Microbiología se entiende como SIEMBRA, el proceso mediante el cual se lleva una

porción de una población de microorganismos, denominada entonces INÓCULO, de un
cultivo crecido a un medio nutritivo y estéril para su crecimiento. Para ello, se utilizan
cabinas estériles (con flujo de aire y luz ultravioleta). Cuando no se dispone de ellas, se
recurre al mechero Bunsen que, debido a las corrientes de convección que se crean: el
aire caliente asciende en vertical y, cuando se enfría baja, creando un ambiente estéril
en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama (radio aproximado 20cm), de
forma que los riesgos de contaminación disminuyen considerablemente. Por tanto, se
debe trabajar siempre próximo a la llama del mechero, flameando las bocas de los tubos
de ensayo, matraces, pipeta, etc. antes y después de su utilización, a pesar de estar
esterilizados previamente. En el caso de material plástico se debe flamear con una
pasada rápida para no fundirlo.

18
Como instrumento portainóculos más frecuente se utiliza el asa de siembra (mango de
Kolle), con el que se puede tomar inóculo a partir de colonias o de medio líquido, debido
a que mantiene un pequeño volumen de agua por tensión superficial. Para depositar el
inóculo en líquido basta con introducir el extremo en el medio y agitar ligeramente.
Sobre medio sólido se puede hacer un recorrido largo sobre la superficie o también se
puede inocular picando en profundidad, como por ejemplo para observar reacciones
metabólicas en anaerobiosis.
También se pueden utilizar pipetas para transportar volúmenes grandes de inóculos
como haremos en la práctica de crecimiento bacteriano.
Para trabajar en condiciones de esterilidad debes trabajar en el entorno del mechero
Bunsen, evitando el contacto con superficies no estériles. Recuerda también que, al
finalizar de trabajar o para trasladar material estéril, éste se debe cerrar antes de
abandonar el entorno del mechero Bunsen. A continuación, se incluye una descripción
más detallada de varios procedimientos de siembra.

SABER TRABAJAR EN CONDICIONES DE ESTERILIDAD Y MANEJAR

CORRECTAMENTE LOS MICROORGANISMOS, ASÍ COMO GESTIONAR LOS
RESIDUOS BIOLÓGICOS, SE DENOMINA “TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS
ADECUADAS” Y SON LOS REQUERIMIENTOS MÍNIMOS PARA QUE UNA
PERSONA PUEDA TRABAJAR EN UN LABORATORIO DE BIOSEGURIDAD-1 O DE
BIOSEGURIDAD-2
ADEMÁS, LOS LABORATORIOS DEBEN CUMPLIR UNA INFRAESTRUCTURA
ADECUADA... INVESTIGA UN POCO MÁS SOBRE RIESGOS BIOLÓGICOS... ¿HAS
COMPROBADO QUÉ NIVEL DE BIOSEGURIDAD TIENEN LOS LABORATORIOS
DE PRÁCTICAS DONDE ESTUDIAS? ¿HAS LEÍDO LOS DOCUMENTOS QUE SE
ENCUENTRAN AL LADO DE LA PUERTA DE LOS LABORATORIOS?

19
2.2 Siembra en placa (siembra en medio sólido)

Existen varios tipos de siembra en placa, los más habituales son la siembra por
agotamiento y la siembra por extensión. Normalmente, el objetivo de la siembra en
placa es el aislamiento e inmovilización de bacterias individuales que, tras un tiempo
de crecimiento, desarrollarán una colonia visible a simple vista y derivada originalmente
de una única bacteria.

¿TE ACUERDAS DE LA DIFERENCIA ENTRE BACTERIA Y COLONIA? ¿Y

DE POR QUÉ ERA IMPORTANTE TENER COLONIAS AISLADAS?
AHORA ESTUDIARÁS COMO CONSEGUIR COLONIAS AISLADAS EN
MEDIO SÓLIDO Y QUÉ MÉTODO TE PERMITE UNA CUANTIFICACIÓN DE
BACTERIAS DE UN CULTIVO LÍQUIDO PREVIO

El aislamiento de colonias por agotamiento se trata de un método rápido y simple

de agotamiento progresivo y continuo del inóculo sobre un medio sólido contenido en
una placa. Este método está basado en arrastrar, mediante un asa de siembra, un
número cada vez más pequeño de células, haciendo el máximo recorrido en zig-zag.
Debido a la dificultad de este método cuando se realiza por primera vez, se suele hacer
un agotamiento por estrías solapantes (estrías escocesas). En este método se toma el
inóculo con el asa de siembra (ya sea desde cultivo líquido o sólido) y se realiza un
pequeño zig-zag en un cuadrante de la placa. Es muy importante esterilizar con la llama
el asa de siembra y enfriarla. Se realizará una segunda estría solapando un poco con
la primera (el inóculo es la primera estría). Tras volver a esterilizar el asa de siembra y
enfriarla, se continuarán haciendo estrías solapantes hasta 5 veces (el inóculo siempre
es la estría anterior).
El objetivo de la siembra por agotamiento es aislar colonias para hacer una observación
macroscópica, chequear que no haya contaminaciones y/o tomarlas como inóculo. No
se usa para cuantificar bacterias pues no se conoce el factor de dilución que ocurre en
cada paso de solapamiento.

20
La siembra por extensión consiste en inocular un volumen determinado (100-200 µl)
de cultivo sobre la placa de manera uniforme. Para ello se usará el asa de Drigalsky (el
profesor te enseñará a hacer una con una pipeta Pasteur larga), que se habrá
esterilizado previamente por inmersión en etanol y flameado. Hay que tener cuidado de
situar siempre el etanol lejos del mechero Bunsen y no introducir el asa con llama en
él.
El objetivo de este tipo de siembra es la distribución uniforme de una solución líquida
en un medio sólido. El propósito de esta extensión puede variar, desde el recuento de
microorganismos (cuantificación por extensión de diluciones seriadas) hasta la
obtención de un crecimiento homogéneo de microorganismos para la realización de
determinadas pruebas (por ejemplo, un antibiograma).

21
El método de las diluciones seriadas se utiliza para cuantificar un cultivo microbiano.
Debido a los grandes números que alcanzan las poblaciones bacterianas, no se puede
extender un volumen de cultivo en una placa y esperar que cada bacteria quede
inmovilizada de forma aislada y uniforme. En condiciones estériles y usando como
diluyente LB líquido se preparará una primera dilución 1/10 (normalmente en un
volumen final de 1ml). Tras homogeneizarla, esta primera dilución servirá como muestra
para volver a diluir 1/10 y así sucesivamente tantas veces como te indique el profesor.
Algunas de estas diluciones se extenderán en placa con el asa de Drigalsky y se dejarán
crecer a la temperatura óptima de la bacteria. Tras una noche, en algunas placas se
encontrarán colonias aisladas. Dado que cada colonia procede de una bacteria inicial,
contando colonias y teniendo en cuenta el volumen plaqueado y la dilución, se podrá
determinar la concentración bacteriana en el cultivo inicial en ufc/ml (unidades
formadoras de colonia por mililitro).

UNA SIEMBRA POR EXTENSIÓN DE DILUCIONES DECIMALES

SERIADAS DE UN CULTIVO ES EL ÚNICO MÉTODO DE SIEMBRA QUE
TE PERMITE CUANTIFICAR ESE CULTIVO EN UFC/ML
REFLEXIONA POR QUÉ HAY QUE HACER DILUCIONES DECIMALES
SERIADAS...

22
2.3 Siembra en medio líquido

Se introduce el asa de siembra esterilizada (mango Kolle) en la placa con cultivo crecido
y se toma una colonia que se lleva al tubo estéril con medio líquido (agitándola en el
seno del medio), tomando las precauciones para trabajar en esterilidad mencionadas
anteriormente.
Si se desea hacer una siembra en líquido desde un cultivo líquido, también es posible
portar un pequeño volumen de líquido con el asa de siembra por tensión superficial. Si
se quiere portar volúmenes mayores se usan micropipetas de precisión con puntas
estériles.
23
2. 4 Objetivo
o

Adquirir la destreza manual para la siembra de microorganismos en condiciones de

esterilidad.
Conocer los métodos de trabajo en esterilidad.
Practicar las técnicas microbiológicas adecuadas.

2.5 Procedimiento

Las bacterias y levaduras de la colección y sus temperaturas de crecimiento son:

Bacterias:
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Bacillus cereus
Levaduras:
Saccharomyces cerevisiae
37ºC Gram negativa
37ºC Gram negativa
37ºC Gram positiva
37ºC Gram positiva
30ºC Levadura

(además, tendremos otras bacterias y hongos para determinadas prácticas o

para comparar)

Las placas de agar serán inoculadas al objeto de obtener colonias aisladas por siembra
y esterilización entre recorridos solapantes, según las explicaciones de los monitores.
Una vez inoculado, incubar los microorganismos a su temperatura óptima de

24
crecimiento y no olvidarse de marcar el nombre de la bacteria o levadura y la clave de
pareja de prácticas.

Las placas se mantendrán con la mitad que porta el medio sólido hacia arriba con el
objeto de evitar la condensación de gotas y su caída sobre el cultivo, lo que echaría a
perder la inmovilización de las bacterias aisladas.
En el caso de cultivo líquido en tubos que se cierren con rosca, no hay que apretar la
rosca hasta el máximo, sino que se le deja un cuarto de rosca abierta para permitir el
intercambio de gases con el interior.

En esta práctica se inocularán todas las bacterias y levaduras de la colección en tubos

de caldo y en placas con los medios de cultivo adecuados (LB para bacterias e YPD
para levaduras).

SIEMBRAS A REALIZAR:
En esterilidad y usando las técnicas microbiológicas adecuadas.
Desde placas de LB agar donde se han aislado colonias de las bacterias de la colección
o desde una placa de YPD agar donde se ha aislado colonias de una levadura, cada
estudiante debe hacer las siguientes siembras:
- Desde una placa con bacteria (cada pareja tendrá asignada una en concreto):
- Hacer un inóculo en LB líquido (3ml en un falcon estéril de 15 ml)
- Hacer un aislamiento de colonia por estrías solapantes en una placa de LBagar
- Desde una placa con la levadura Saccharomyces cerevisiae
- Hacer un aislamiento de colonia por estrías solapantes den una placa de
YPDagar
Desde cultivos líquidos bien crecidos de alguna de las bacterias de la colección, cada
estudiante debe hacer seis diluciones decimales seriadas en LB (volumen final de 1ml)
y extender 100 microlitros de las diluciones 10-5 y 10-6 en sendas placas de LB agar
para cuantificar dicho cultivo.

25
PRÁCTICA 3. MANEJO DEL MICROSCOPIO Y OBSERVACIÓN DE
MICROORGANISMOS.

3.1. Observación macroscópica de microorganismos

3.1.1 Introducción

El tamaño de las bacterias y levaduras impide verlas a simple vista. Sin embargo, las
colonias que forman sobre medios sólidos sí son visibles, y en ellas se puede estudiar
una serie de características que nos ayudan a su identificación. A nivel morfológico,
podemos estudiar la forma de las colonias, su tamaño, aspecto del borde (liso, rugoso,
ondulado, ramificado, etc.), presencia de brillo, color, etc. Incluso sobre medio líquido,
algunos microorganismos producen modificaciones de interés para su clasificación y
que tienen que ver esencialmente con las características de su metabolismo. Así se
observa si la turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona
superficial, si producen pigmentos, etc.

3.1.2 Objetivo

Aprender a describir correctamente las características macroscópicas de colonias de

microorganismos.

3.1.3 Procedimiento

Para realizar esta práctica se utilizarán como material las placas iniciales de
microorganismos de la colección, así como las distintas siembras que cada alumno hizo
y placas de otros microorganismos que el equipo docente estime oportuno.

En primer lugar, observar y describir diversas características como el color y el borde

de las colonias de bacterias y levaduras crecidas en el agar, así como el olor y la
turbidez del medio (en cultivos crecidos), ya que, en algunos casos, suelen ser típicos
de un determinado tipo de microorganismo y pueden servir de ayuda a la hora de su
identificación.

26
Mira todas las bacterias y levaduras presentes en el laboratorio y compara las
características macroscópicas de todas ellas.

Aspectos más comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio sólido

RECUERDA QUE EN ESTA PRÁCTICA ESTÁS OBSERVANDO COLONIAS

O CULTIVOS CRECIDOS (POBLACIONES); NO TE CONFUNDAS CON LA
OBSERVACIÓN DEL MICROORGANISMO MEDIANTE MICROSCOPÍA
REVISA SIEMPRE TUS AISLAMIENTOS PARA VER SI TODAS LAS
COLONIAS SON HOMOGÉNEAS (CULTIVO PURO) O HAY
CONTAMINACIONES
CUANDO TRABAJAS CON UNAS BACTERIAS CONCRETAS EN
LABORATORIO, TERMINAS CONOCIENDO SUS COLONIAS. FÍJATE EN
LAS BACTERIAS DE LA COLECCIÓN... ¿CUÁL O CUALES PUEDES
IDENTIFICAR POR SU COLOR? ¿CUÁL POR LO GRANDE QUE ES?
¿CUÁL POR LO PEQUEÑA QUE ES?...

27
3.2. Manejo del microscopio óptico

A continuación, se adjunta un breve resumen de conceptos que ya conoces del

microscopio óptico y que tendrás más ampliados en el temario de teoría de Microbiología
I

28
Las lentes permiten una magnificación de la imagen. La magnificación puede
incrementarse sin ningún límite al contrario que la resolución de la imagen.
La resolución es la habilidad para distinguir dos objetos adyacentes como distintos y
separados. Es una función de las propiedades físicas de la luz. Es el parámetro
limitante. La microscopía óptica tiene una resolución aproximada de 0,2 micras.

El microscopio compuesto posee dos lentes: el objetivo y el ocular. El aumento es la

combinación (multiplicación) de ambas.
• Lente del ocular 10X
• Imagen intermedia (invertida)
• Lente del objetivo 10X; 40X; 100X
• Espécimen
• Lente del condensador (sin magnificación)
• Fuente de luz

29
La resolución es una función de la longitud de onda de la luz que se utiliza. En este
caso la luz visible. La apertura numérica de una lente del objetivo es una medida de su
habilidad para dispersar la luz. A mayor apertura numérica, mayor magnificación.
El diámetro del menor objeto que puede resolverse es (0.5λ/apertura numérica), donde
λ es la longitud de onda de la luz que se utiliza
La luz azul es la que tiene la longitud de onda más corta, por ello muchos microscopios
ópticos tienen un filtro azul sobre el condensador.

El aceite de inmersión, que se usa únicamente en el ocular 100X, tiene el mismo índice
de refracción que la lente y, al contrario que ésta, se encuentra en contacto directo con
la muestra. Esto permite que algunos rayos de luz que emergen del espécimen en
ángulos hacia el exterior pueden recogerse y aprovecharse en la visión.

Para una correcta visualización de los objetos, es necesario que haya un contraste
suficiente entre los distintos objetos o con el medio que los rodea. El problema de
visualizar microorganismos es que el contraste comparado con el medio en el que se
encuentran es muy poco. Las formas de incrementar el contraste con respecto al medio
manteniendo los microorganismos vivos son el contraste de fases y el campo oscuro.
En estas prácticas sólo usaremos contraste de fases.

30
También se puede incrementar el contraste respecto al medio mediante tinción. Para
ello se necesita una preparación fijada (células muertas).

A la hora de enfocar la muestra es más sencillo enfocar con los objetivos de menor
magnificación. Enfoca con el objetivo 40x (o 60X dependiendo de los microscopios)
directamente, ya que con el de 10x no es posible enfocar bacterias. Una vez que hayas
conseguido el foco, sin mover la muestra ni la platina, cambia al objetivo 100x. Antes
de situarlo añade una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la muestra y termina
de ajustar el objetivo. Con una pequeña corrección con el micrométrico podrás enfocar
la muestra.

Ten cuidado porque una vez que la muestra tiene aceite de inmersión no podrás usar
ningún otro objetivo. Si se desenfoca, habría que enfocarlo directamente con el objetivo
100x. El objetivo 100x es el único preparado para contactar con el aceite de inmersión,
ten mucho cuidado en no manchar el resto de los objetivos con aceite.

En cualquier caso, siempre que lo necesites y al final de la práctica, limpia todos los
objetivos y el ocular de tu microscopio con un papel suave o paño de algodón especial
impregnado en etanol al 70%. Recuerda que es un aparato delicado así que, si tienes
que trasladarlo, hazlo con cuidado y agarrándolo por el brazo y el pie. Además, cuando
termines, siempre déjalo desenchufado y cubierto, sin ninguna muestra en la platina.

31
3.3. Observación microscópica de microorganismos: preparación húmeda

3.3.1 Introducción

La disponibilidad de sistemas de contraste de fases permite observar a las bacterias

vivas y determinar algunas características tales como su movimiento.

El contraste de fases es una técnica microscópica basada en el principio de que las

células difieren en su índice refractivo con respecto a su medio. El índice refractivo es
un factor mediante el cual la luz se desacelera cuando pasa a través de un material.
Esta pequeña diferencia es amplificada mediante una herramienta en el objetivo: la
lente de contraste de fases (anillo de fase), que permite amplificar la variación en la
fase.
Permite ver los microorganismos vivos, por lo que se puede distinguir si son móviles y
qué tipo de movimiento realizan (flagelación polar o perítrica). Hay que tener cuidado
no confundirse con las corrientes propias del líquido.

3.3.2 Objetivo

Determinar la capacidad de movimiento de las bacterias de la colección. Recordar el

uso del contraste de fases en un microscopio óptico

3.3.3 Procedimiento

Para realizar esta práctica se utilizará como material los microorganismos de la

colección crecidos en cultivo líquido.

Se realizará una preparación húmeda. Para ello, hay que disponer una gota de cultivo
líquido, previamente agitado, sobre un portaobjetos y taparlo con un cubreobjetos de
forma que se establezca una delgada película entre ambos cristales. Posteriormente,
se observa con el objetivo de contraste de 40x (¡ojo!, tiene una banda roja y no todos
los microscopios disponen de él) y el condensador anular (se desplaza horizontalmente
y con suavidad hasta alcanzar su posición en el camino óptico). Con este sistema se

32
deben de poder distinguir aquellas bacterias con flagelación polar, que se mueven en
zig-zags muy rápidos, de la perítricas, de movimientos más suaves y ondulados.
Las bacterias sin flagelos se pueden ver desplazamientos sincrónicos por las corrientes
y vibraciones en el medio de observación.

NO TE ASUSTES SI AL PRINCIPIO NO VES NADA. LAS BACTERIAS SON,

DE MEDIA, DIEZ VECES MÁS PEQUEÑAS QUE UNA CÉLULA
EUCARIOTA Y, SI USAS EL OBJETIVO DE 40X, APENAS NOS VERÁS
COMO PUNTITOS EN MOVIMIENTO.
TAMBIÉN TEN EN CUENTA QUE LA LUZ DEL MICROSCOPIO CALIENTA
RÁPIDAMENTE EL LÍQUIDO DE LA MUESTRA Y ESO AFECTA LA
VIABILIDAD (Y POR TANTO AL MOVIMIENTO) DE LA BACTERIA.
EL OBJETIVO ES QUE DEDUZCAS EL MOVIMIENTO DE LA BACTERIA
DE LA COLECCIÓN QUE TE HA TOCADO (SI ES QUE ES MÓVIL). ¿POR
QUÉ NO PUEDES INCREMENTAR MÁS EL CONTRASTE UTILIZANDO
UNA TINCIÓN?

33
3.4. Observación microscópica de bacterias: preparación fijada y tinciones

3.4.1 Introducción

Puesto que la inmensa mayoría de las bacterias son incoloras, la única forma de
observarlas bien en el microscopio óptico consiste en incrementar su contraste con
respecto al medio. Esto se consigue mediante la disposición de una óptica especial de
contraste, generalmente de fases, en el microscopio, o bien, mediante su teñido con
colorantes.
Para observar las bacterias teñidas, hay que proceder previamente a su fijación.
Inicialmente se prepara un frotis a partir de medio líquido o dispersando en una gota de
agua una porción de células crecidas en sólido. Posteriormente se deshidrata el frotis
por calentamiento suave utilizando el reverso de la mano como control de temperatura
tras pasar repetidamente el portaobjetos sobre la llama del mechero. Tras la fijación por
calor se procede a la tinción.

CUIDADO CON LA FIJACIÓN POR CALOR. PROCURA QUE SEA UNA

EVAPORACIÓN SUAVE Y QUE NUNCA LLEGUE A QUEMAR EL PORTA
CON LA MUESTRA.
SI QUEMAS LA MUESTRA NO VERÁS BACTERIAS O TENDRÁN FORMAS
ARTIFICIALES

- Los colorantes pueden ser de distintos tipos:

Catiónicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las
células y las tiñen. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina.
Aniónicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no
tiñen las células, sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos:
Eosina, Nigrosina.
Liposolubles. Se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen. Ejemplo: Negro sudán.

- Por otro lado, las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos métodos:

Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una
composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan

34
de forma diferente frente a un colorante. El colorante tiñe las células (Azul de metileno,
Safranina) o no (Nigrosina).
Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta
composición química, y por lo tanto, reaccionan de forma diferente frente a una tinción,
lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad
de tinción. En este apartado están dos tinciones de importancia taxonómica y médica:
la tinción de Gram y la ácido-alcohol resistente o tinción de Ziehl-Neelsen.
Las tinciones diferenciales también se basan en el hecho de que distintas estructuras
celulares tienen distinta composición química, de modo que es posible teñir
selectivamente determinados orgánulos con ciertos colorantes. Así la tinción de
esporas, flagelos, ...
Por lo general, las tinciones diferenciales utilizan más de un colorante.

3.4.2 Objetivo

Comprender el fundamento de las diferentes técnicas de tinción de microorganismos.

Adquirir la destreza manual necesaria para el correcto uso del microscopio óptico.
Determinar características de las bacterias de la colección mediante distintas técnicas
de tinción.
Para realizar esta práctica se utilizarán los microorganismos de la colección que los
alumnos crecieron previamente.

3.4.3 Procedimientos

CUIDADO CUANDO HAGAS LOS FROTIS... RECUERDA QUE SI COGES

UNA COLONIA O UN PEQUEÑO VOLUMEN DE CULTIVO CRECIDO,
SOMOS MILES DE MILLONES DE BACTERIAS LAS QUE VAMOS... SI
COGES DEMASIADA MUESTRA NO CONSEGUIRÁS UNA CAPA FINA DE
BACTERIAS ESPACIADAS Y TUS PREPARACIONES NO QUEDARÁN
BONITAS.

35
- Tinción de Gram (tinción diferencial).

El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos:

las bacterias Gram positivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared,
mientras que las bacterias Gram negativas tienen una capa de peptidoglicano más fina
y una membrana externa con una capa de lipopolisacáridos.
Además, esta tinción te permitirá ver bien la morfología de las bacterias con las que
estés trabajando

RECUERDA QUE NO ES LO MISMO HABLAR DE LA MORFOLOGÍA DE

LA BACTERIA QUE LA MORFOLOGÍA DE LA COLONIA

36
 ES IMPORTANTE QUE TENGAS CLARO CÓMO ES LA ESTRUCTURA DE
LA PARED CELULAR DE UNA BACTERIA GRAM POSITIVA Y DE UNA
BACTERIA GRAM NEGATIVA, PUES LAS CARACTERISTICAS
ESTRUCTURALES SON LAS QUE EXPLICAN QUE LA TINCIÓN GRAM
ESTABLEZCA UNA DIFERENCIACIÓN

El protocolo de tinción de Gram requiere ser muy estricto en determinados pasos y, la

primera vez que se realiza, puede dar resultados confusos. Para poder concluir si una
bacteria es gran positiva o negativa hay que realizar bien la tinción, pero además se
puede hacer un frotis mixto en el que se incluye la bacteria desconocida con otra que
sabemos si es Gram positiva o Gram negativa. De este modo en función del resultado
podemos deducir el tipo de pared de la bacteria problema. El protocolo de la tinción
Gram se explica a continuación:
1. Hacer una mezcla a nivel de frotis (en el portaobjetos) de una bacteria Gram(+)
conocida y una bacteria Gram(-) conocida de la colección de bacterias de las prácticas.
Así, si todo va como debe, en una de las mezclas bacterianas debemos observar
bacterias teñidas de azul-violáceo y otras de color rosa, y podremos contrastar los
colores en caso de un resultado poco claro.

37
2. Cubrir con cristal violeta durante 2 minutos. En este paso todas las células quedan
teñidas por el colorante.
3. Eliminar el cristal violeta volcando el portaobjetos y tratar con lugol durante 1 minuto.
De esta forma se refuerza la interacción entre el colorante y la pared celular. El lugol no
es un colorante, sino que forma un complejo insoluble con el cristal violeta, lo que hace
que la tinción sea un poco más resistente.
4. Lavar con una mezcla de acetona y alcohol por goteo continuado durante 20
segundos. Añadir inmediatamente agua para evitar el arrastre completo de todo el
colorante.
En esta fase se produce la decoloración diferencial de las Gram negativas. Mientras
que las Gram positivas, al tener una pared celular con una gruesa capa de
peptidoglicano, en este tiempo tan breve no se decoloran.
Es muy importante ser precisos con el goteo, el tiempo y el lavado con agua para evitar
un exceso o defecto de lavado que hará que las coloraciones finales no sean las
esperadas.
5. Tratar con safranina durante 1 minuto como colorante de contraste.
La safranina se introduce en el interior de todas las células procariotas, pero sólo las
que se han decolorado diferencialmente se verán rojas. En esta fase las Gram
negativas adquirirán el color rojo de la safranina mientras que las Gram positivas
continuarán con el color azul propio del primer colorante.
6. Lavar con agua abundante para retirar el exceso de colorante, secar al aire y observar
con el objetivo de inmersión (100X).

38
 HAZ EL EJERCICIO DE EXPLICAR EL PROTOCOLO TENIENDO EN CUENTA LO
QUE OCURRE EN CADA TIPO DE BACTERIA Y POR QUÉ. ADEMÁS, ES
IMPORTANTE QUE TENGAS CLARO CUÁL ES EL PASO DIFERENCIAL Y PARA
QUÉ SIRVE CADA COLORANTE O PRODUCTO.
¿QUÉ SUCEDERÍA SI, EN EL PASO DIFERENCIAL, ESTAMOS MENOS TIEMPO
DEL INDICADO? ¿Y SI ESTAMOS MÁS TIEMPO DEL INDICADO?
¿CÓMO HA SALIDO TU TINCIÓN? ¿TIENES UN CONTRASTE CORRECTO ENTRE
AZUL Y ROSA O HAY COLORES MEZCLADOS (TONOS DE VIOLETA)? EN ESTE
ÚTLIMO CASO... ¿PODRÍAS DEDUCIR DÓNDE HA ESTADO EL ERROR?
SI ADEMÁS TE FIJAS EN LA MORFOLOGÍA PODRÁS IDENTIFICAR QUÉ
BACTERIA ES CUAL DE LAS DOS QUE HAS MEZCLADO Y COMPROBAR QUE LA
TINCIÓN QUE TE SALE ES LA QUE SABES QUE DEBE TENER CADA UNA

- Tinción simple negativa (tinción de cápsula)

La cápsula se puede definir como una estructura de superficie que presentan algunas
bacterias en sus ambientes naturales y que consiste en una acumulación de material
mucoso y viscoso situado en la parte externa de la pared celular (principalmente
exosacáridos y glicoproteínas). Estas cápsulas son estructuras “inertes” y por ello no
tienen actividad metabólica, pero le confiere a las bacterias propiedades importantes
como son la adhesión a otras células, la adhesión a sustratos inertes o vivos y la
protección frente a agentes antibacterianos, deshidratación y evasión del sistema
inmune.
La observación de cápsulas con el microscopio óptico en fresco es difícil, ya que su
índice de refracción es similar al del medio. Para observar las cápsulas se recurre a la
tinción negativa con nigrosina o tinta china. La tinción debe hacerse en condiciones
húmedas pues la fijación disgrega la cápsula.

Intentaremos ver la cápsula de Streptococcus mutants (suministrado por el profesor)

y/o de Pseudomonas aeruginosa (bacteria de la colección de prácticas); será más
sencillo en este último caso ya que es una bacteria más grande. El protocolo se explica
a continuación:

1. Colocar una gota del medio con la bacteria en un portaobjetos, añadir una gota de
tinta china y mezclar bien. Igual es mejor que coloquen una gota de tinta china y sobre

39
esta gota hagan un frotis e las bacterias tomadas con el asa de siembra a partir de una
placa, así no se diluye la tinta china y se ve mas oscuro.
2. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre la suspensión de células con tinta china.
Evitar que se formen burbujas.
3. Colocar los portaobjetos con los cubreojetos entre dos papeles absorbentes.
Presionar con los dedos sobre el portaobjetos. El exceso de suspensión será absorbido
por los papeles
4. Observar al microscopio. Trabajar con el diafragma del condensador cerrado para
aumentar el contraste de las células.
Observa que el medio se verá de un color gris violáceo y la cápsula, al no estar teñida,
se verá refringente.

TENIENDO EN CUENTA EL TIPO DE COLORANTE QUE ES LA

NIGROSINA O TINTA CHINA Y LA COMPOSICIÓN DE LA CÁPSULA ¿POR
QUÉ CREES QUE EL COLORANTE SE QUEDA EN EL MEDIO EXTERNO
SIN ENTRAR EN LA BACTERIA?

- Tinción de esporas (tinción diferencial)

Existen microorganismos capaces de formar estructuras de resistencia conocidas como

esporas. Las endosporas bacterianas son características de algunos Gram positivos
del filo Firmicutes (por ejemplo, los géneros Bacillus y Clostridium), se forma sólo una
por célula (inicialmente en su interior pero la célula madre lisa y finalmente la endospora
llega al medio externo) y poseen varias capas concéntricas protegiendo una copia de
genoma (se forman durante la esporulación). Estas esporas pueden resistir la
destrucción en un medio hostil o desfavorable: resistencia contra la desecación,
40
escasez de nutrientes, frío, calor, radiación (UV, X, γ), sal, oxidantes, desinfectantes,
pH extremo, etc. debido a su cubierta dura e impermeable. Es un estado
metabólicamente inactivo en el que no hay reacciones anabólicas ni catabólicas por lo
que la bacteria no crece ni se reproduce. Su activación en condiciones favorables se
denomina germinación. Hay varios tipos de endosporas bacterianas según se formen
en el centro de la bacteria o apical.
Otras bacterias pueden tener esporas que no son endosporas y se suelen denominar
exosporas. Es característica de algunas Actinobacterias y se forma externamente por
gemación de un micelio filamentoso bacteriano, como en Actinomyces y Streptomyces,
análogamente a los conidios de los hongos. Son menos resistentes al calor que las
endosporas y su estructura también es muy diferente.

En estas prácticas vamos a centrarnos en las endosporas, concretamente las de

Bacillus cereus. Para la observación de las esporas es necesario llevar a cabo una
tinción especial de la muestra que tiña únicamente las endosporas y después la
observación al microscopio óptico. El protocolo es el siguiente:

1. Hacer un frotis de cultivos procedentes de medio sólido envejecido de Bacillus cereus

y fijarlo por calor.
2. Coloca el trípode sobre la llama de forma que no incida directamente en él o, si eso
es imposible, colócalo en un lateral.
3. Cubre la preparación con tres papeles de filtro recortados a la medida de la muestra,
de forma que no sobresalgan y coloca el portaobjetos con los papeles sobre el trípode.
4. Inmediatamente añade verde malaquita hasta que los papeles queden empapados y
pegados a los frotis. Manteniendo siempre la muestra húmeda en la solución de verde
malaquita, dejar que el mechero Bunsen caliente lentamente las preparaciones hasta
que estas empiecen a emitir un vapor blanquecino (detectable mejor sobre fondo
negro). Mantener esa emisión con el mechero durante 5-7 minutos sin dejar que se
sequen las muestras (ir añadiendo colorante). En esta fase se tiñen tanto las formas
vegetativas como las esporas.
Al ser una tinción a muy altas temperaturas la membrana de las esporas permite que el
colorante se internalice, de otro modo sería imposible (debido a su impermeabilidad) y
sólo podría entrar en la célula madre. Mantener la muestra con los papeles
impregnados en verde malaquita evita la calcinación de las células vegetativas.

41
5. Coger las preparaciones con pinzas (¡queman!) y lavarlas intensamente con agua a
temperatura ambiente hasta que se observe muy poca coloración.
Durante este lavado diferencial el agua (a una temperatura muy inferior) arrastra el
colorante de las formas vegetativas en las que la fluidez de membrana sigue siendo
adecuada a temperatura ambiente, mientras que el colorante incluido en las esporas se
mantiene en el interior debido al enfriamiento de las envolturas, que se vuelven de esta
forma mucho menos permeables.
6. Teñir con un colorante de contraste como la safranina, ahora a temperatura
ambiente, durante 1 minuto. Este sólo teñirá las formas vegetativas, mientras que las
esporas permanecerán refractarias a su entrada.
7. Lavar el exceso de colorante con agua fría. Secar al aire y observar con el objetivo
100X.

ESTA TINCIÓN TAMBIÉN ES DE TIPO DIFERENCIAL ASÍ QUE ES

IMPORTANTE QUE SEPAS EXPLICAR LO QUE SUCEDE EN CADA PASO
EN LA CÉLULA MADRE Y EN LA ESPORA, EN BASE A LAS
CARACTERÍSTICAS DE SUS ENVOLTURAS.
¿ERES CAPAZ DE EXPLICAR PARA QUÉ SIRVE CADA PRODUCTO QUE
SE USA? ¿Y DE IDENTIFICAR EL PASO DIFERENCIAL? ¿QUÉ
IMPORTANCIA CREES QUE TIENE LA TEMPERATURA? ¿QUÉ PASARÍA
SI NO ALCANZAS LA TEMPERATURA ADECUADA DURANTE LA TINCIÓN
CON VERDE MALAQUITA?
¿QUÉ TAL TE HA SALIDO LA TINCIÓN? SI NO HA SALIDO BIEN...
¿PUEDES IDENTIFICAR DÓNDE HA SIDO EL ERROR?

42
3.5. Observación microscópica de hongos: mohos y levaduras

3.5.1 Introducción.

Los hongos, a diferencia de las bacterias son organismos eucariotas; es decir, su

material genético se encuentra aislado del resto de los orgánulos celulares por una
membrana nuclear. La mayoría poseen un metabolismo respiratorio, aunque hay
excepciones. Aunque hay otros grupos de hongos, en las prácticas vamos a utilizar
Ascomycetes. A grandes rasgos, podemos clasificar los hongos ascomicetos en dos
grupos: aquellos que desarrollan estructura miceliares filamentosas (que denominamos
comúnmente mohos) y aquellos que son unicelulares durante todo su ciclo de vida
(denominados comúnmente levaduras).
En cuanto a su ubicación éstos pueden encontrarse en el suelo, el agua y, sus esporas,
también en el aire. En este caso, las esporas pueden ser formas de resistencia (no tan
resistentes como las esporas bacterianas) pero muy usualmente son formas
reproductivas.

RECUERDA QUE HAY MICROORGANISMOS DE ESTRUCTURA

CELULAR PROCARIOTA Y DE ESTRUCTURA CELULAR EUCARIOTA.
SON ESTRUCTURAS MUY DIFERENTES Y LO QUE DETERMINA SU
NOMBRE ES LA PRESENCIA O NO DE UN NÚCLEO VERDADERO.
PERO TAMBIÉN SON MUY DISTINTOS EN TAMAÑO... CUANDO LOS
OBSERVES MICROORGANISMOS EUCARIOTAS AL MICROSCOPIO,
FÍJATE EL OBJETIVO QUE ESTÁS USANDO Y COMPARALO A LO QUE
VERÍAS SI FUERAN BACTERIAS

HONGOS FILAMENTOSOS O MOHOS.

Se le da el nombre de mohos a los hongos filamentosos cuyo crecimiento sobre
superficies de alimentos se reconoce fácilmente como su aspecto aterciopelado y
algodonoso. La morfología macro y microscópica de los mohos sirve de base para su
identificación y clasificación.
La observación macroscópica de los hongos a veces es suficiente para indicar el género
al que pertenece, así observando el aspecto y el color se puede tener una orientación

43
para la identificación del hongo. Sin embargo, es la observación microscópica la que
nos aporta gran información para la identificación de las distintas especies de hongos.
Una de las características en las que se basa la clasificación es en la estructura de los
filamentos ramificados, conocidos como hifas y cuyo conjunto constituyen el MICELIO.
Las hifas pueden ser septadas (con tabiques transversales que dividen la hifa en varias
celdillas) y no septadas (hifas sin tabiques), éstas últimas poseen núcleos diseminados
en toda su longitud, por lo que pueden confundirse con multicelulares.

HONGOS UNICELULARES O LEVADURAS.

Por su parte las levaduras deben observarse microscópicamente ya que a simple vista
las colonias que forman son difíciles de distinguir de las colonias bacterianas. Si
observamos las levaduras al microscopio veremos que éstas pueden ser esféricas,
ovoides, alimonadas, piriformes, cilíndricas o incluso alargadas, pero no forman hifas.
Durante el examen microscópico se puede observar la pared celular, el citoplasma,
vacuolas acuosas, glóbulos de grasa y gránulos metacromáticos. Para poner de
manifiesto el núcleo son necesarias tinciones especiales. La mayoría se reproducen
asexualmente por gemación polar o multilateral, proceso durante el cual se forma en la
periferia de la célula una protuberancia (yema) que aumenta de tamaño hasta que
finalmente se desprende de la pared celular. Unas pocas especies se multiplican por
escisión.

3.5.2 Objetivos.

Determinar la forma de los hongos y observar las diferencias morfológicas entre mohos
y levaduras. Comparar tamaño con microorganismos de estructura procariota

3.5.3 Procedimiento

- Observación de mohos.
El profesor dará al grupo una placa con un moho crecido que suele provenir de mohos
que crecen en alimentos de los géneros Aspergillus o Penicillium.
Con la técnica que se explica a continuación, seremos capaces de observar las
estructuras reproductivas de estos microorganismos eucariotas, pues al tomar la

44
muestra ésta es exclusivamente aérea (parte reproductora), quedándose la parte
vegetativa (micelio) en el interior del agar.

1- Colocar una pequeña gota de azul de lactofenol sobre el portaobjetos.

El azul de lactofenol es una solución que contiene: azul de algodón como colorante,
ácido láctico para estabilizar la estructura del hongo y fenol para inhibir el crecimiento
bacteriano.
2- Tocar ligeramente con la mitad pegajosa de una tira de cinta adhesiva, la parte apical
del micelio del moho, procurando no romper las hifas o alterándolas lo menos posible.
Te saldrá mejor si tanto la presión como la eliminación de la tira adhesiva, la haces lo
más vertical posible.
45
3- Adherir la cinta al portaobjetos con la gota de azul de lactofenol y esperar dos
minutos.
4- Lavar el porta con agua para eliminar el colorante que sobra y secarlo bien. Sujeta
bien la cinta adhesiva porque es ahí donde se encuentra la muestra.
No hará falta usar cubreobjetos ya que la propia cinta adhesiva realiza esa función
5- Colocar la preparación en el microscopio y observarla con los objetivos de 10 y 40X.

Atención, porque puedes comparar un micelio de Streptomyces y un micelio de

Aspergillus. A simple vista podrían parecer lo mismo, pero si intentas verlo en el
microscopio rápidamente te darás cuenta de que el tamaño es muy diferente, ya que
Streptomyces es una bacteria y Aspergillus un hongo.
También podrás ver hifas de Agaricus bisporus (champiñón) que es un Basidiomycete.
Acuérdate que estás viendo hifas vegetativas y no el cuerpo fructífero (seta).

- Observación de levaduras
Haremos una preparación húmeda para ver la morfología de S. cerevisiae, así como
algunas células en reproducción (es bastante fácil encontrar alguna célula con la gema
todavía unida a la célula madre). Partiremos de las placas que cada pareja del grupo
hizo de la levadura de la colección.

1- Colocar una pequeña gota de agua sobre el portaobjetos

2- Coger un pequeño inóculo del cultivo sólido con el asa de siembra estéril y extenderlo
bien en la gota
3- Colocar un cubreobjetos encima procurando que no queden burbujas
4- Observar al microscopio con el objetivo de 10X y a continuación con el de 40X.

46
PRÁCTICA 4. EFECTO DE LAS ALTAS TEMPERATURAS SOBRE LOS
MICROORGANISMOS.

4.1. Determinación del tiempo de reducción decimal a una temperatura

4.1.1 Introducción.

Las altas temperaturas provocan efectos letales o subletales sobre los

microorganismos. Una bacteria sometida a una temperatura superior a la que
normalmente crece, sufre, en primer lugar, daños en sus proteínas y ácidos nucleicos.
Estos primeros daños impiden que la bacteria se reproduzca y, por consiguiente, forme
una colonia sobre un medio de cultivo adecuado. Sin embargo, si el tratamiento es corto
en duración y se efectúa a una temperatura no excesivamente alta, los daños que la
bacteria sufre son reparables y, por eso, se habla de efectos subletales. Cuando el
tratamiento es más fuerte, en temperatura o duración, los daños se hacen irreparables
y la bacteria pierde de forma irreversible su capacidad de formar colonias, se habla
entonces de efecto letal.
La muerte bacteriana producida por calor sigue una cinética exponencial en el tiempo.
Se puede calcular un valor, llamado DT (tiempo de reducción decimal a la temperatura
T), que determina el tiempo que una población de N bacterias debe ser sometida a un
tratamiento a una temperatura T para que el número de supervivientes sea N/10. El
valor de D depende de un gran número de factores como la especie bacteriana, la
temperatura de tratamiento, el medio en el que se encuentre la bacteria, la cantidad de
agua disponible, etc. El tiempo de reducción decimal es muy importante para poder
diseñar tratamientos de esterilización de alimentos.

EN TEORÍA PUEDES ENCONTRAR UN TEMA DEDICADO AL CONTROL

DEL CRECIMIENTO MICROBIANO DONDE PODRÁS APRENDER MÁS
PARÁMETROS IMPORTANTES COMO EL VALOR Z Y DONDE
APRENDERÁS A CALCULAR ESTOS PARÁMETROS DESDE DATOS
MATEMÁTICOS.
SIN EMBARGO, EN EL LABORATORIO, VAMOS A CALCULAR DT
EXPERIMENTALMENTE. ES LA FORMA DE TENER ALGÚN DATO
MATEMÁTICO CON LOS QUE APLICAR LAS FÓRMULAS TEÓRICAS Y
DEDUCIR OTROS PARÁMETROS

47
4.1.2 Objetivo.

Determinar experimentalmente el tiempo de reducción decimal para una bacteria

problema a una temperatura dada.

4.1.3 Procedimiento

Cada pareja realizará este experimento con la bacteria de la colección que le ha sido
asignada, de forma que, entre todos, podamos conocer el tiempo de reducción decimal
a 60ºC de todas las bacterias de la colección (en medio LB).

Un día antes de la realización de la práctica debe ponerse un cultivo líquido de cada

bacteria de la colección (5 ml de LB en un tubo falcon de 15ml estéril, usar la técnica
adecuada en condiciones estériles y dejarlo crecer toda la noche a su temperatura
óptima).

El día del experimento, el protocolo será:

1- Marcar 4 placas de LB agar con el nombre de la bacteria y los tiempos 0, 20, 40 y 60
minutos. En este experimento usaremos las cuatro placas de LB agar que cada pareja
hizo el primer día de prácticas
2- Tomar, con una punta estéril: 100 µl del cultivo, hacer seis diluciones decimales
seriadas (LB estéril como diluyente y volumen final de 1ml) y extender 100 µl de la
dilución 10-6 en la superficie de la placa de LB agar de tiempo t=0 con una asa de vidrio.

48
3- Colocar el resto del cultivo en un baño a 60ºC y controlar el tiempo con un
cronómetro.
4- A tiempo 20, 40 y 60 tomar sendas muestras de 100 µl, realizar las diluciones
seriadas indicadas a continuación (LB estéril como diluyente y volumen final 1ml) y
extender 100 µl de la ultima dilución sobre las placas correspondientes.
20 minutos: cuatro diluciones decimales seriadas
40 minutos: dos diluciones decimales seriadas
60 minutos: sembrar directamente (sin diluir) 100 µl del cultivo
5- Incubar las 4 placas a la temperatura óptima de la bacteria durante toda la noche.
6- Al día siguiente hay que hacer un recuento de las colonias a los diferentes tiempos
(0, 20, 40 y 60 minutos).
Hay que calcular las células bacterianas que continúan siendo viables tras el
tratamiento a 60ºC (ufc/ml a los diferentes tiempos de incubación). Para calcularlo hay
que contar el número de colonias crecidas en las placas al día siguientes, deshacer las
diluciones y tener en cuenta el volumen que se puso en la placa. De esta forma
tendremos una tabla con los datos: tiempo tratamiento vs ufc/ml.
Después, hay que representar el logaritmo del número de colonias frente al tiempo de
tratamiento, para calcular el valor D a la temperatura utilizada (D60) para la bacteria
correspondiente. Para no tener que calcular el logaritmo de cada número se utiliza un
papel semilogarítmico.
El papel semilogarítmico tiene dos ejes, uno de ellos es lineal y el otro logarítmico. El
profesor te recordará la forma de representar en el eje logarítmico si lo necesitas.
En el caso que nos ocupa se situará en el eje lineal el tiempo de tratamiento (min) y en
el logarítmico las ufc/ml del cultivo a cada tiempo. Dado que la definición de tiempo de
reducción decimal es la siguiente: “tiempo en el que una población bacteriana de N
ufc/ml pasa a ser N/10 a una temperatura T”, para calcular la D de la bacteria que nos
han asignado a 60ºC, buscaremos el tiempo para una población de N (cualquier ufc/ml
que cada uno desee elegir) y el tiempo en el que la población pase a ser N/10 (10 veces
menos del tamaño de población que hemos elegido). La diferencia entre estos tiempos
será el tiempo de reducción decimal para esa bacteria a 60ºC
Es posible que no tengas colonias en todos los tiempos con las diluciones que se te
indican porque cada bacteria de la colección es distinta, con que tengas 2 ó 3 datos es
suficiente para nuestros propósitos.

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52
4.2. Determinar la termorresistencia de esporas de Bacillus cereus.

4.2.1 Introducción

Es importante que recuerdes que las células vegetativas de B. cereus tienen una
muerte determinada por su tiempo de reducción decimal a cada temperatura (calculado
en la práctica anterior): comprueba con los datos conjuntos de toda la clase el valor D
correspondiente a B. cereus a 60ºC. Un tratamiento prolongado a esa temperatura
matará a las células vegetativas de B.cereus, pero no a sus endosporas que son
extremadamente termorresistentes.
B. cereus sólo genera endosporas en una situación de estrés ambiental y no durante
un crecimiento exponencial normal; uno de los estreses más comunes que controlan el
comienzo de la esporulación es la falta de nutrientes en el medio de cultivo, por ejemplo
la entrada en fase estacionaria. Realizaremos esta práctica con un cultivo de B. cereus
en fase estacionaria, un cultivo que ha estado creciendo durante 48h en medio LB a la
temperatura óptima, para asegurarnos que un porcentaje de la población, debido al
estrés nutricional, haya comenzado a formar esporas.

Durante el protocolo se va a aplicar un tratamiento a 60ºC durante 20 minutos, de tal

forma que, tras el tratamiento con calor, sólo sobreviven las esporas que pueden
germinar y formar colonias si se siembran el medio rico como el LB agar; las células
vegetativas, por el contrario, mueren debido a la temperatura. Es importante que te des
cuenta de que las endosporas deben estar sintetizadas previamente porque el calor va
a hacer que mueran las células vegetativas, sin darles tiempo a desarrollar ninguna
estructura de resistencia. Observa que el estrés que inicia la síntesis de esporas es la
falta de nutrientes en la fase estacionaria y que el calor que aplicamos en el protocolo
sólo sirve para matar las células vegetativas y revelar cuantas esporas había en el
cultivo previamente sintetizadas.
Para llevar a cabo este análisis hemos de ver el porcentaje de células con espora
(alícuota tratada con temperatura) frente al número total de células viables (alícuota
control sin tratar).

53
 REFLEXIONA SOBRE EL PROTOCOLO QUE VAS A HACER... ¿PARA QUÉ
UTILIZAS EL TRATAMIENTO A 60ºC?
POR OTRA PARTE... ¿QUÉ ESTÍMULO ES EL QUE DESENCADENA LA
SÍNTESIS DE ENDOSPORAS EN B.cereus?
LA SÍNTESIS DE UNA ENDOSPORA ES UN PROCESO COMPLEJO QUE
PUEDE LLEGAR A TOMAR HASTA 10 HORAS... ¿CREES QUE EL
TRATAMIENTO A 60ºC SIRVE PARA GENERAR LAS ENDOSPORAS?
ENTONCES... ¿CUÁNDO SE GENERAN Y POR QUÉ?

4.2.2 Objetivo

El objetivo de esta parte de la práctica es determinar el número de esporas de un cultivo

estacionario de Bacillus cereus basándonos en su gran resistencia al calor.

4.2.3 Procedimiento

- Primer día del ensayo

1- Utilizando un cultivo de B. cereus suministrado por el profesor y crecido hasta fase
estacionaria en LB (48h), se tomarán 2 alicuotas de 100 µl. Una de las muestras se
incubará a 60 ºC durante 30 minutos y la otra no (control).
2- Mientras se incuba la muestra a 60ºC, se harán seis diluciones decimales seriadas
(con LB como diluyente y un volumen final de 1ml) y se sembrarán en placa de LB agar
100 µl de una dilución 10-6 de la muestra control.
3- Tras la incubación de media hora a 60ºC, la muestra tratada con calor se diluye dos
diluciones decimales seriadas (con LB como diluyente y un volumen final de 1ml) y se
siembran 100 µl de una dilución 10-2 en una placa de LB agar y otros 100 µl de una
dilución 10-1 en la segunda placa de LB agar
4- Las placas se incubarán a 37ºC durante toda la noche

- Segundo día del ensayo

1- A partir de las placas sembradas el día anterior, contar el número de colonias
crecidas, calcular ufc/ml de población total y de población de endosporas y calcular el
porcentaje población que forma esporas a las 48h

54
PARA CALCULAR EL PORCENTAJE DE POBLACIÓN QUE HA
SINTETIZADO ENDOSPORAS NECESITAS SABER LA POBLACIÓN
TOTAL Y LA POBLACIÓN QUE HA SINTETIZADO ENDOSPORAS.
REFLEXIONA SOBRE QUÉ REPRESENTA LA MUESTRA CONTROL Y
QUÉ CALCULAS EN LA MUESTRA QUE SOMETES A TRATAMIENTO CON
CALOR.
CUANDO TENGAS CLARO ESTO SERÁ SENCILLO APLICAR UN
PORCENTAJE PARA HACER EL CÁLCULO

55
PRÁCTICA 5. ANTIBIOSIS: CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA
(MÉTODO KIRBY-BAUER)

5.1 Introducción

Existen diferentes técnicas para estudiar la actividad de los antibióticos frente a distintos
microorganismos. En clínica se suelen utilizar pruebas esencialmente cualitativas,
aunque en muchos casos se requieren determinaciones cuantitativas. En estas
prácticas vamos a efectuar ensayos cuantitativos utilizando cultivos en sólido de
distintas bacterias. El método en concreto se llama Kirby-Bauer y puedes aprender más
buscando en los libros y apuntes de teoría.

La actividad antimicrobiana se mide al determinar la cantidad más pequeña de agente

necesario para inhibir el crecimiento de un microorganismo. MIC (Minimun Inhibitory
Concentration) o CMI (Concentración Mínima Inhibitoria). Hay dos formas de determinar
la CMI de un antibiótico para una bacteria: técnica de dilución en tubo y técnica de
difusión en placa (método Kirby-Bauer). En esta última, se siembra una placa Petri con
un cultivo bacteriano sin diluir extendiendo el inóculo por toda la superficie de la placa
con un asa de extensión, de tal forma que las colonias llegan a crecer en confluencia,
pero antes de incubar las placas a la temperatura óptima de crecimiento, se añaden
cantidades conocidas del agente antimicrobiano en discos de papel sobre el agar.
Durante la incubación, el antibiótico difunde desde el disco por el agar, estableciendo
un gradiente de concentración. Cuanto más lejos difunde el químico menor
concentración posee y las bacterias sembradas previamente en la placa crecerán
durante su incubación allí donde la concentración del antibiótico sea suficientemente
baja para no impedírselo. Los límites de concentración de antibiótico que afectan al
crecimiento suelen ser muy estrechos por lo que se producen halos de inhibición
definidos. La zona de inhibición (halo) se crea con un diámetro proporcional a la
cantidad del agente antimicrobiano, su solubilidad, coeficiente de difusión… Dado que
para un mismo antibiótico los parámetros de solubilidad y difusión son constantes, se
puede decir que, en este caso, el halo de inhibición depende de la concentración de
antibiótico que había en el disco y la sensibilidad a éste de la bacteria.

56
5.2 Objetivo

Determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de dos antibióticos (ampicilina y

estreptomicina) frente a la bacteria ensayada utilizando el método Kirby-Bauer

57
5.3 Procedimiento

- Día 1 (preparación)
1- Cada pareja pondrá a crecer un cultivo líquido de la bacteria con la que esté
trabajando.

- Día 2
1- Cada pareja va a averiguar la CMI de dos antibióticos por lo que necesita sembrar la
bacteria en dos placas de LB. Una placa servirá para exposiciones a distintas
cantidades de ampicilina y la otra para la estreptomicina. Cada persona de la pareja
llevará el experimento con uno de los antibióticos. En el caso de la estreptomicina cada
pareja trabajará con la bacteria que le haya tocado y, en el caso de la ampicilina, sólo
es posible hacerlo con E. coli o E. faecalis, así, los alumnos que tengan otras bacterias
utilizarán estas especies prestadas por sus compañeros.
2- Para sembrar a confluencia (césped), cada pareja sembrará 200 µl del cultivo de
bacteria sin diluir, mediante la técnica de extensión en placa.
3- A continuación se prepararán las diluciones de los antibióticos según las siguientes
instrucciones
Concentraciones de los stock suministrados:
Ampicilina: 100 mg/ml
Estreptomicina: 100 mg/ml

Concentración 1: según la bacteria y el antibiótico, consultando en la siguiente tabla

(hacer un volumen final de 100 µl, usando agua estéril como diluyente)
Ampicilina Estreptomicina

E. coli 10mg/ml 50mg/ml

E. faecalis 2.5 mg/ml 50mg/ml

S. aureus R 50mg/ml

P. aeruginosa R 50mg/ml

B. cereus R 50mg/ml

R (resistente).

58
Concentración 2: dilución ½ de la concentración 1 en agua estéril (hacer un volumen
final de 100 µl)
Concentración 3: dilución ½ de la concentración 2 en agua estéril (hacer un volumen
final de 100 µl)
Concentración 4: dilución 1/10 de la concentración 3 en agua estéril (hacer un volumen
final de 100 µl)
Concentración 5: dilución 1/10 de la concentración 4 en agua estéril (hacer un volumen
final de 100 µl)

PARA CALCULAR CÓMO PREPARAR LA PRIMERA CONCENTRACIÓN

(DISCO 1) DESDE EL STOCK SUMINISTRADO, ACUÉRDATE DE ESTA
FÓRMULA: C0.V0=CF.VF
(si no te acuerdas del fundamento de la misma repasa tus apuntes de
Química General)
PARA PASAR DE LA PRIMERA CONCENTRACIÓN A LAS SIGUIENTES SE
TE ESPECIFICA LA SERIE DE DILUCIONES QUE DEBES APLICAR.
TENIENDO EN CUENTA LA CONCENTRACIÓN DEL PRIMER TUBO Y
SABIENDO LAS DILUCIONES QUE HACES, PUEDES CALCULAR LA
CONCENTRACIÓN EN TODOS LOS TUBOS (DISCOS)

4- A continuación, en cada placa previamente sembrada, se colocarán cinco discos de

papel estéril intentando situarlos equidistantes entre ellos y con el borde de la placa
Petri. Puesto que los discos no están marcados, es imprescindible indicar el número o
la concentración correspondiente debajo de la placa. Sin clavar el disco en el agar es
recomendable apretarlo un poco para que quede bien adsorbido al medio sólido.
5- En cada placa y a cada disco ya situado se le añadirán 10 µl de la concentración del
antibiótico correspondiente. De tal forma que, en la placa de ampicilina, en el disco 1
se añadan 10 µl de la concentración 1 de ampicilina y así sucesivamente. Lo mismo
para la estreptomicina en la placa correspondiente con las concentraciones
correspondientes
6- Tras unos minutos para que el disco absorba el antibiótico, las placas se incuban en
posición invertida durante toda la noche a la temperatura óptima de crecimiento de la
bacteria que se esté utilizando.

59
- Día 3
1- A la mañana siguiente hay que medir el diámetro de los halos de inhibición y
anotarlos en el cuaderno.
2- Construir, para cada antibiótico, una tabla en la que se relacionen las
concentraciones de los discos y el diámetro del halo en milímetros.
3- Representarlo en un papel semilogarítmico: el diámetro del halo se situará en el eje
lineal y la concentración de antibiótico en el logarítmico.
4- Para averiguar la CMI de la bacteria para el antibiótico correspondiente se aplicará
el criterio internacional sobre resistencias a antibióticos
La bacteria es sensible (S) si el diámetro del halo es mayor de 15 mm
La bacteria es resistente (R) si el diámetro del halo es menor de 13 mm
Intermedio (R/S) si el diámetro del halo está comprendido entre ambos
5- Dado que una bacteria es sensible si tenemos un diámetro mínimo de halo de 15mm,
la CMI será aquella que nos produzca un halo de esa medida. Extrapolar de la gráfica
la CMI de cada bacteria para cada antibiótico.

¿POR QUÉ SE SITUA LA CONCENTRACIÓN DE ANTIBIÓTICO EN EL EJE

LOGARÍTMICO Y EL DIÁMETRO DEL HALO EN EL DECIMAL?
PISTA... LA FÓRMULA QUE DETERMINA LA CONCENTRACIÓN DEL
ANTIBIÓTICO EN CADA PUNTO EN UNA DIFUSIÓN, ADEMÁS DE OTROS
PARÁMETROS, DEPENDE DEL CUADRADO DE LA DISTANCIA AL
PUNTO INICIAL.

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PRÁCTICA 6. CRECIMIENTO BACTERIANO Y EFECTO DE
ANTIBACTERIANOS.

6.1 Introducción.

En esta práctica seguiremos el crecimiento de un cultivo líquido en agitación de E. coli

y observaremos el efecto producido sobre éste por algunos agentes antibacterianos de
uso habitual en medicina como la Ampicilina y la Estreptomicina.

Curva de crecimiento bacteriana

El crecimiento se define como el incremento en el número de células. Las especies

bacterianas se mantienen como resultado de su crecimiento continuado. Cuando una
célula se separa para formar dos, decimos que ha pasado una generación. El tiempo
que se necesita para este proceso se denomina tiempo de generación. Durante un
tiempo de generación se duplica tanto el número total de células como su masa. El
tiempo de generación es diferente según cada microorganismo y también depende del
medio de cultivo y las condiciones de incubación.

Un microorganismo creciendo en un recipiente cerrado no puede crecer

exponencialmente de manera indefinida pues los nutrientes se agotan. La curva de
crecimiento describe un ciclo completo que incluye una fase de latencia, exponencial,
estacionaria y de muerte.
FASE DE LATENCIA. Es el intervalo que necesita el cultivo para volver al crecimiento
activo tras el inóculo. Su duración depende de cómo se haya hecho el inóculo, las

63
condiciones de crecimiento, etc. Durante este periodo se sintetizan los componentes
esenciales, se reparan daños, se expresa otro conjunto de enzimas que se necesiten
para las nuevas condiciones, etc.
FASE EXPONENCIAL. El número de bacterias se duplica a máxima velocidad y de
forma constante (que no quiere decir que las bacterias estén sincronizadas). Si
representamos el crecimiento en un eje aritmético frente al tiempo se verá una curva
con un incremento constante de la pendiente, mientras que si lo representamos en una
escala logarítmica los puntos dibujan una línea recta debido a que la población se dobla
en un intervalo de tiempo constante. Los gráficos semilogarítmicos se usan para estimar
el tiempo de generación de un cultivo microbiano desde datos de su crecimiento: el
tiempo de generación se lee directamente de la zona exponencial del gráfico de
población vs tiempo.

Recuerda las ecuaciones que definen este tipo de crecimiento (en el temario de teoría
lo encontrarás más desarrollado)
N=No2n
N es el número final de células
No es el número inicial de células
n es el número de generaciones en un periodo de tiempo.
Llamamos “g” al tiempo de generación. Si la población crece exponencialmente es igual
a t/n; siendo t la duración del crecimiento exponencial
Si se conoce el número inicial y final de células se puede calcular el número de
generaciones (n). Sabiendo “n” y el tiempo se puede calcular “g”
N=No2n
logN=log No + nlog2
n=3.3 (logN-logNo)
g=t/n
pendiente=velocidad de división o tasa de división (k)=0.301/g=0.301n/t
k=tasa de división=1/g (recíproco del tiempo de generación)
“g” es el tipo que le toma a una población duplicar su número y “k” es el número de
generaciones por unidad de tiempo en un cultivo en crecimiento exponencial. De forma
práctica, “g” puede calcularse de la pendiente de la línea recta obtenida en la
representación semilogarítmica del crecimiento exponencial

64
 EN LOS LIBROS Y APUNTES DE TEORÍA PUEDES APRENDER MÁS DE
LAS FÓRMULAS QUE DESCRIBEN EL CRECIMIENTO BACTERIANO EN
FASE EXPONENCIAL
SIN EMBARGO, EN ESTA PRÁCTICA, EL TIEMPO DE GENERACIÓN LO
VAMOS A CALCULAR DE FORMA EXPERIMENTAL, DIRECTAMENTE
DESDE LA GRÁFICA DE CRECIMIENTO BACTERIANO.

FASE ESTACIONARIA. En un cultivo cerrado, el crecimiento exponencial se limita,

debido a que se ha consumido un nutriente esencial y/o que se ha acumulado un
producto de desecho que inhibe el crecimiento. Durante la fase estacionaria no hay un
incremento o disminución neta del número de células por lo que la tasa de crecimiento
es cero, la población no crece. No obstante, las células individuales pueden continuar
con su metabolismo, pero sin que haya incremento en el número de células (crecimiento
críptico): algunas células del cultivo crecen y otras mueren, y ambos procesos se
equilibran.
FASE DE MUERTE. También es una función exponencial pero normalmente la tasa de
muerte es menor que la de crecimiento exponencial. En algunos casos la muerte se
acompaña de lisis celular.

NO TE PREOCUPES SI EN TU EXPERIMENTO DE CRECIMIENTO

BACTERIANO NO VES LA FASE ESTACIONARIA (O, COMO MUCHO, SU
INICIO) Y MUCHO MENOS LA DE MUERTE. EN EL TIEMPO QUE TOMA
EL EXPERIMENTO TODAVÍA NO SE HAN AGOTADO LOS NUTRIENTES
DEL MEDIO, HABRÍA QUE SEGUIR EL CRECIMIENTO MÁS HORAS.
POR OTRA PARTE, TENIENDO EN CUENTA QUE VAMOS A TOMAR
MUESTRA CADA 45 MINUTOS, TAMPOCO VAS A VER LA FASE DE
LATENCIA, REFLEXIONA POR QUÉ Y CÓMO DEBERÍAS PLANTEAR EL
EXPERIMENTO PARA QUE QUEDE REGISTRADA EN LA
REPRESENTACIÓN GRÁFICA

---------------------------------------

Para seguir el crecimiento microbiano durante este experimento necesitaremos una

medida de las bacterias en el cultivo. Hay distintas formas de hacerlo, la más usual es
el empleo de un espectrofotómetro a 550nm (método turbidométrico)

65
CONTEO DE VIABLES. Una célula viable es aquella que es capaz de dividirse y formar
descendencia. Se cuentan, por tanto, las células capaces de formar colonias (conteo
en placa) unidades formadoras de colonia (ufc) ó “colony forming units (cfu)”. Se diluye
el cultivo antes de plaquear (diluciones decimales seriadas) en LB agar y se cuantifica
la muestra que se toma.
MÉTODOS TURBIDOMÉTRICOS. Debido a que las células son objetos con masa que
pueden dispersar la luz un método rápido y útil para estimar el número de células
gracias a esta propiedad es la turbidez. La ley de Lambert-Beer establece una relación
exponencial directa entre la transmisión de luz a través de una sustancia y su
concentración. En el caso de cultivos de microorganismos, cuantas más células estén
presentes más luz se dispersa y más turbia se ve la suspensión. Lo que se mide en
realidad mediante la turbidez es la masa celular total que es proporcional al número de
células.
El espectrofotómetro es un instrumento que emite un haz de luz a través de la
suspensión y mide la cantidad de luz que emerge, que pasa la suspensión, luz
transmitida que no se ha dispersado. La unidad de la turbidez es la densidad óptica o
absorbancia a una longitud de onda concreta. Pero hay que saber que la absorbancia
es la luz absorbida o dispersada por la muestra, o sea que es la inversa de la
transmitancia que es lo que mide el espectrofotómetro.
En cultivos con gran concentración celular la luz dispersada por una célula individual
puede redireccionarse al incidir en otra célula. Por ello, cuando la densidad óptica sea
superior a 1, la muestra se ha de diluir en medio estéril y a la densidad óptica del cultivo
se calculará aplicando el factor de dilución al valor de absorbancia obtenido.
Debido a que distintos microorganismos difieren en tamaño y forma, un número igual
de células de dos especies bacterianas no necesariamente van a dar la misma
densidad óptica. Es por tanto una medida relativa pero muy útil en experimentación.
También hay que tener en cuenta que, dado que sólo se detecta masa bacteriana, no
podemos deducir nada de su viabilidad.
MÉTODOS BIOQUÍMICOS. Es necesario seguir la evolución en la concentración de un
metabolito que se consuma o produzca de forma proporcional al crecimiento bacteriano.
Es un método indirecto que no se suele aplicar.

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CONTROL ANTIMICROBIANO
Un agente antimicrobiano es un químico natural o sintético que mata o inhibe el
crecimiento de los microorganismos. Se pueden clasificar en bacteriostáticos,
bactericidas y bacteriolíticos según el efecto en el cultivo bacteriano (en crecimiento
exponencial).
• Los agentes bacteriostáticos son inhibidores del crecimiento. Si el agente se
elimina del cultivo dentro de un plazo no muy largo, las bacterias pueden volver a crecer
(reflexiona sobre la importancia de seguir con el tratamiento antibiótico todo el tiempo
necesario para que no vuelva a crecer el microorganismo cuando se usan antibióticos
con este efecto). Tras su adición en un cultivo en crecimiento exponencial el conteo
total (densidad óptica) y el conteo de viables (ufc/ml) adquieren una pendiente cero.
• Los agentes bactericidas se unen fuertemente a sus dianas celulares y no se
pueden eliminar por dilución. Matan a la célula pero la estructura celular no se destruye.
Tras su adición en un cultivo en crecimiento exponencial el conteo total (densidad
óptica) adquiere una pendiente cero y el de viables (ufc/ml) una pendiente negativa.
• Algunos agentes bactericidas son también bacteriolíticos, es decir que matan las
células por lisis y eliminación del contenido citoplasmático. En este caso el conteo total
(densidad óptica) y el de viables (ufc/ml) adquieren pendiente negativa.

PARA DISTINGUIR EL EFECTO DE UN NUEVO AGENTE SE PUEDEN

APLICAR ESTAS DIFERENCIAS. REFLEXIONA CÓMO PLANTEAR UN
EXPERIMENTO PARA AVERIGUAR EL EFECTO SOBRE LAS BACTERIAS
DE UN NUEVO AGENTE ¿EN QUÉ SE BASA TU EXPERIMENTO?
PISTA... YA SABES QUE HAY DISTINTAS FORMAS DE SEGUIR EL
CRECIMIENTO BACTERIANO, UNAS SE BASAN EN DETECTAR UNA
MASA Y OTRAS EN DETECTAR VIABILIDAD

Los antibióticos que se van a usar en la práctica son:

Ampicilina: antibiótico betalactámico que inhibe la síntesis de peptidoglicano. Su efecto
es bacteriolítico.
Estreptomicina: antibiótico aminoglucósido que afecta a la subunidad 30S del ribosoma
y detiene la síntesis proteica. Su efecto es bacteriostático.

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Es importante añadir los antibióticos en la fase de crecimiento exponencial. Si la célula
no está creciendo activamente los antibióticos no afectan eficientemente a sus dianas.

6.2 Objetivo.

Obtener la curva de crecimiento de un microorganismo mediante medidas

turbidométricas.
Comprobar el efecto que distintos agentes antimicrobianos (ampicilina y
estreptomicina) tienen sobre el crecimiento microbiano cuando éste se sigue mediante
espectrometría.
Calcular el tiempo de generación de una bacteria de forma práctica.
Comprobar, mediante medida de pH, que el crecimiento también se puede seguir por
métodos químicos aunque no son tan sensibles comparados con otros métodos

6.3 Procedimiento.

- Día 1
1- Cada pareja pondrá un preinóculo de E. coli desde una placa en 5ml de LB estéril y
lo dejará crecer a su temperatura óptima hasta el día siguiente.

- Día 2
1- A partir de un cultivo crecido el día anterior (preinóculo), inocular en condiciones de
esterilidad 5 ml de éste en un matraz de 100 ml que contenga 40 ml de caldo común
enriquecido con 0’2% (p/v) de glucosa. Agitar bien para que el preinóculo se disperse
en el volumen total.
Debes calcular cuanta glucosa añadir teniendo en cuenta que el stock que se te
suministra está al 20%. Esto igual es mejor eliminarlo y directamente preparar nosotros
el medio con la glucosa para ir mas rápidos ya que aquí el tiempo es importante
2- A continuación, tomar de la mezcla 2 ml con una pipeta estéril, reservarlos en un
tubo e introducir inmediatamente el matraz en el baño de incubación a 37ºC y con
agitación para que se oxigene. El protector de aluminio del matraz se elimina para
permitir el intercambio gaseoso con el exterior (el tapón es poroso por lo que permite
intercambio de gases sin entrada de bacterias ambientales).

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3- Apuntar la hora a la que se empezó a incubar el cultivo, que será considerada como
tiempo 0.
4- Con los 2 ml de la muestra hay que efectuar medidas de pH y turbidez a 550 nm.
El pH se mide para valorar la producción de ácido como consecuencia de la
fermentación de la glucosa con la que se enriqueció el medio de cultivo. Va a ser una
medida indirecta del metabolismo bacteriano, y por tanto, del crecimiento. Después se
mide la turbidez o densidad óptica en un espectrofotómetro a una longitud de onda de
550 nm. Este valor refleja un parámetro proporcional a la concentración de masa celular
por lo que será nuestra medida de crecimiento.
Acuérdate que tendrás que utilizar un blanco para la comparación de turbidez.
5- A partir del tiempo considerado como 0 se seguirán tomando muestras de 2 ml cada
45 min en las que se medirá el pH y la turbidez para reflejarlo con posterioridad en una
gráfica. Atención, cuando al medir la densidad óptica obtengamos un valor superior a 1
se procederá a la dilución 1/5 con medio de cultivo, de forma que el valor que se
obtenga, multiplicado por el factor de dilución (5x), mantenga la proporcionalidad con la
concentración de la masa bacteriana.
6- Dividiremos las parejas de clase en varios grupos para estudiar también el efecto de
la ampicilina y la estreptomicina sobre el crecimiento bacteriano.
Los grupos que tengan que añadir antibiótico lo harán cuando su cultivo llegue a una
densidad óptica entre 0,4-0,6 (crecimiento exponencial)
Parejas A: añadirán a su cultivo ampicilina a 100 μg/ml
Parejas B: añadirán a su cultivo estreptomicina a 100 μg /ml
Parejas C: añadirán a su cultivo ampicilina a 100 μg/ml y estreptomicina a 100 μg /ml
al tiempo.
Parejas D: control sin antibiótico. El tiempo de generación se calculará sobre estos
datos independientemente del grupo que nos haya tocado.
El stock de antibióticos en ambos casos está a 100 mg/ml y el volumen final donde se
añadirá dependerá del momento en que haya que añadirlo.
Ya estén en un grupo u otro, todos los alumnos deben saber calcular la cantidad de
antibiótico que habría que añadir y ser conscientes de la necesidad de diluir el cultivo
cuando el crecimiento sobrepasa la densidad óptica de 1.
7- Todos los alumnos anotarán sus datos en una tabla en la pizarra para compartir.
Todos deberán representar la población bacteriana en función del tiempo en un papel
semilogarítmico en todos los casos y llegar a:

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- Ver una curva de crecimiento microbiano (recuerda que la fase de latencia en las
condiciones en que hacemos el experimento no se va a ver y por el tiempo que dura la
práctica sólo llegaremos a una entrada en fase estacionaria temprana)
- Calcular el tiempo de generación de E. coli a 37ºC, en LB
- Ver el efecto de un antibiótico bacteriostático
- Ver el efecto de un antibiótico bacteriolítico
- Ver el efecto de ambos antibióticos añadidos a la vez
8- No es necesario representar el pH en función del tiempo, pero observa su evolución
y reflexiona sobre su utilidad como método para seguir el crecimiento bacteriano
comparado con el método turbidométrico.

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1

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1

73
 UTILIZA LA BIBLIOGRAFÍA
RECOMENDADA DEL CURSO
PARA CONSULTAR DUDAS Y
AMPLIAR CONOCIMIENTOS

RECUERDA QUE DEBES

COMPRENDER Y SABER QUÉ SE
VA A HACER ANTES DE ENTRAR
EN EL LABORATORIO DE
PRÁCTICAS

UTILIZA LOS RECURSOS QUE EL EQUIPO DOCENTE PONE A TU DISPOSICIÓN Y PREGUNTA

LAS DUDAS QUE TENGAS EN SESIONES DE TUTORÍAS
EL OBJETIVO ES QUE APROVECHES ADECUADAMENTE LAS PRÁCTICAS
COMPRENDIÉNDOLAS CON ANTELACIÓN Y QUE AHORRES TIEMPO TENIENDO CLAROS LOS
PROTOCOLOS

ESPERAMOS QUE TE HAYAN GUSTADO LAS PRÁCTICAS Y LAS CONSIDERES ÚTILES

GRACIAS

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