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PRACTICAS DE BIOQUIMICA

Licenciatura en Ciencias Ambientales

Dpto. de Ciencias de la Salud III


rea de Bioqumica y Biologa Molecular

Universidad Rey Juan Carlos

Prcticas de Bioqumica

Prcticas de Bioqumica: ndice.


NORMAS GENERALES DE LABORATORIO. INTRODUCCIN A LAS PRCTICAS EVALUACIN DE LAS PRCTICAS 05 06 07

PRACTICA N 1: PRECIPITACIN Y CUANTIFICACIN DE PROTEINAS. 08


1.1 PRECIPITACION FRACCIONADA DE PROTEINAS. 2.1.1 MATERIAL Y REACTIVOS. 2.1.2 MTODO. 1.2 DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTENAS. 2.2.1 MATERIAL Y REACTIVOS. 2.2.2 MTODO. 1.3 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 1.

08 09 09 11 12 12 14

1.4 EJERCICIO: DETERMINACIN DEL PESO MOLECULAR DE LAS CADENAS LIGERA Y 18 PESADA DE LAS INMUNOGLOBULINAS.

PRACTICA N 2: DETERMINACIN DE LA Km DE LA FOSFATASA CIDA PARA EL p-NITROFENILFOSFATO Y DE LA Ki PARA LA INHIBICIN POR FOSFATO MONOPOTSICO. 23
2.1 DILUCIONES SERIADAS DEL SUSTRATO 2.1.1 MATERIAL Y REACTIVOS. 2.1.2 MTODO. .

28 28 28 29 29 29 34

2.2 ENSAYOS ENZIMTICOS EN AUSENCIA Y EN PRESENCIA DEL INHIBIDOR 2.2.1 MATERIAL Y REACTIVOS. 4.2.2 MTODO. 2.3 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 2.

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PRCTICA N 3: PURIFICACION VIRTUAL DE PROTEINAS CON ACTIVIDAD ENZIMATICA 39


3.1 PRESENTACIN DEL PROGRAMA INFORMTICO 3.1.1 DESCRIPCIN DEL PROGRAMA 3.1.2 MTODO. .

39 39 42 42 45 46 47 47 49 52

3.2 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 3.

PRCTICA N 4: TCNICAS CROMATOGRFICAS.


4.1. CROMATOGRAFA EN PAPEL. 4.1.1 MATERIAL Y REACTIVOS. 4.1.2 MTODO. 4.2. DEMOSTRACIN: CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN. 4.3 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 4.

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LABORATORIO DE PRCTICAS: UBICACIN.


Laboratorio 006. Planta baja del Edificio Polivalente I. Campus de Mstoles U.REY JUAN CARLOS. C/ Tulipn s/n 28933 Mstoles Madrid.

NORMAS GENERALES DE LABORATORIO


Antes de la realizacin de las prcticas: 1. Estudiar cuidadosamente el guin que corresponda antes del comienzo de cada prctica. Las posibles dudas se resolvern brevemente al inicio de la prctica. 2. Se pasar lista para comprobar la asistencia a la prctica, por lo que se pide puntualidad. Durante la realizacin de las prcticas: 1. El uso de bata y guantes es obligatorio, as como cualquier otro material de proteccin que indiquen los profesores. 2. Est absolutamente prohibido fumar o comer en el laboratorio. 3. Est absolutamente prohibido pipetear con la boca. 4. Mantener limpio el puesto de trabajo durante el desarrollo de las prcticas, y una vez acabadas limpiarlo completamente. Despus de la realizacin de las prcticas en el laboratorio: 1. Completar el cuaderno de prcticas y entregarlo al final de las mismas cuando el profesor lo indique.

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INTRODUCCIN A LAS PRCTICAS


Las clases prcticas del laboratorio de Bioqumica pretenden proporcionar al estudiante una primera aproximacin experimental a las tcnicas bsicas empleadas habitualmente en un laboratorio de Bioqumica, lo cual le permitir aprender posteriormente tcnicas ms complejas con mayor facilidad.

Cada prctica presenta una breve introduccin terica que centra al alumno sobre los objetivos de la misma. A continuacin, se detallan los reactivos, materiales y mtodos que el alumno deber utilizar en el desarrollo de la misma. Por ltimo, se plantean cuestiones relacionadas que el alumno deber responder razonadamente. En el cuaderno de laboratorio deber anotar los resultados experimentales obtenidos, realizar el trabajo indicado con esos resultados, anotar las incidencias que hubieran podido ocurrir y responder a las preguntas planteadas en el laboratorio, en ste guin de prcticas y en el propio cuaderno.

El trabajo de laboratorio se concreta en cuatro prcticas, a realizar en cuatro sesiones. Las primera prctica introduce al estudiante en las tcnicas ms utilizadas en el estudio de protenas: precipitacin y cuantificacin. Tambin se har un ejercicio de determinacin del peso molecular de una protena. En la segunda prctica avanzamos en la actividad biolgica de las protenas, caracterizando los parmetros cinticos de un enzima. En la tercera prctica se utilizar un programa de ordenador que permite disear la mejor estrategia para la purificacin de una protena con actividad enzimtica. En la cuarta prctica se realizar una cromatografa en papel y adicionalmente se realizar una demostracin de la tcnica de cromatografa de exclusin.

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EVALUACIN DE LAS PRCTICAS DE BIOQUMICA


La asignatura de Bioqumica consta de dos partes, terica y prctica. Ambas partes deben ser aprobadas de forma independiente para ser considerado apto en la asignatura. Las prcticas tendrn calificacin de apto o no apto, siendo requisito indispensable superar las mismas para aprobar la asignatura. En la evaluacin de la parte prctica se consideran requisitos indispensables: A.- Asistencia: la realizacin de todas las prcticas es obligatoria. La no asistencia implica declarar las prcticas suspensas, incluso en el caso de que se aprobara el examen de prcticas. B.- Cuaderno: Su entrega es obligatoria. Se entregar un solo cuaderno por cada equipo de trabajo. En el cuaderno de laboratorio debe constar: 1) Objetivo de cada prctica y desarrollo. 2) Incidencias durante la realizacin de la prctica. 3) Todos los resultados obtenidos. 4) Respuesta a las cuestiones planteadas en cada prctica. 5.) Resolucin de los problemas planteados. Todas las grficas deben presentarse hechas a mano en papel milimetrado original y pasadas a tinta (no a lpiz).Es normativo que el cuaderno se entregue en la fecha indicada por los profesores de prcticas y debidamente encuadernado en espiral. En caso contrario, el cuaderno no ser admitido y se computar como suspenso. La calificacin obtenida en l se tendr en cuenta en la nota final. Una vez evaluados, los cuadernos se podrn recoger en la conserjera del edificio polivalente o en la conserjera del aulario. C.- Examen: En caso de suspender el cuaderno de laboratorio, se exigir un examen prctico, que consta de dos partes: C.1.-Test. Cada pregunta tendr cuatro opciones de respuesta, de las cuales slo una es la correcta. Las preguntas se correspondern con los aspectos tanto tericos como experimentales de las prcticas realizadas. Las respuestas incorrectas no puntan negativamente. C.2.-Problemas. Resolucin de 1 2 problemas que incluyan conceptos y planteamientos experimentales tratados en una o varias prcticas. El examen de prcticas se convoca conjuntamente con el examen de teora, teniendo lugar en la misma fecha, hora y lugar que ste. El alumno que slo quiera examinarse de prcticas debe indicarlo al principio del examen. De lo contrario se considerar que se presenta a ambos y correr convocatoria. Una vez aprobadas las prcticas, la calificacin de la parte prctica se conservar hasta aprobar la parte terica. As pues, en caso de repetir la asignatura NO se realizarn de nuevo las prcticas si stas fueron aprobadas previamente.

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PRACTICA N 1. PRECIPITADO Y CUANTIFICACIN DE PROTEINAS.

El objetivo de esta prctica es el desarrollo de un protocolo para el fraccionamiento de una protena, utilizando la tcnica del salting-out. En concreto, se pretende enriquecer una muestra en anticuerpos, usando como material de partida suero fetal bovino. Los anticuerpos pertenecen a un grupo de protenas llamadas -globulinas

inmunoglobulinas,

que

estn

compuestas por dos cadenas pesadas (de peso molecular 55.000 Da cada una) y dos cadenas ligeras (de peso molecular 24.000 Da cada una) unidas entre s por puentes disulfuro (Figura 1). Estas protenas son muy abundantes en la circulacin sangunea. Un cierto nmero de tcnicas ampliamente utilizadas en los laboratorios de bioqumica y biologa molecular requieren la utilizacin de inmunoglobulinas purificadas.

En la primera parte de esta prctica realizaremos la precipitacin fraccionada de las protenas de suero de ternera con sulfato amnico, por lo tanto, no estaremos purificando totalmente las inmunoglobulinas sino obteniendo fracciones enriquecidas en estas. En la segunda parte se analizar el resultado obtenido mediante valoracin cuantitativa.

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1.1 PRECIPITACION FRACCIONADA DE PROTEINAS.


Cuando una sal se aade a una disolucin de protenas, se produce un incremento de la solubilidad de las mismas (solubilizacin por salado o salting in). Este aumento inicial en la solubilidad se debe a la estabilizacin en solucin de la protena por la disminucin de los coeficientes de actividad de los grupos ionizables. A medida que la fuerza inica se eleva, por aumento en la concentracin en la sal, se alcanza un mximo de solubilidad seguido de una disminucin hasta que las protenas precipitan (precipitacin por salado o salting out; Figura 2). Durante la precipitacin probablemente existe una competencia por las molculas de agua de solvatacin entre la protena y la sal por lo que las interacciones protena-protena se hacen ms importantes producindose su precipitacin. El sulfato amnico, (NH4)2SO4, tiene una gran solubilidad (por encima de 700 g/l) y es la sal ms utilizada para el fraccionamiento de protenas.

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1.1.1 MATERIAL Y REACTIVOS.


- Suero de ternera (ST) Disolucin saturada de (NH4)2SO4 (100% de saturacin) - Agua destilada. - Tubos de plstico de centrfuga de 12 ml con tapn. - Tubo graduado de vidrio Corex lamo. - Pipetas de vidrio y propipetas de plstico. - Centrfuga de rotor basculante para tubos de 12 ml.

1.1.2 METODO.
1. Realizar una dilucin 1/5 del ST en H2O destilada. Preparar un volumen final de 6 ml. Aplicar la frmula: Concentracininicial
x

Volumeninicial = Concentracinfinal (Ci


x

Volumenfinal.

Vi = Cf

Vf.)

2. 5 ml de esta dilucin se llevan hasta un 30 % de saturacin con la disolucin de (NH4)2SO4, saturada aplicando la siguente frmula:

Vsal=V [(S2-S1)/1-S2]
Vsal= volumen que hay que aadir de la disolucin saturada de sal a la muestra. V= volumen de muestra que se tiene. S2= tanto por uno de la concentracin de sal a la que se quiere llevar la muestra. S1= tanto por uno de la concentracin inicial de sal en la muestra

Se mezcla lentamente en fro, se incuba 10 minutos en hielo y se centrifuga a 4000 r.p.m. (revoluciones por minuto) durante 10 minutos a 4C. 3. Se pasa el sobrenadante a un tubo graduado y se mide el volumen. El precipitado se disuelve en 6 ml de H2O destilada (fraccin 1). 4. El sobrenadante obtenido en el paso anterior se lleva a un 40% de saturacin con el (NH4)2SO4 saturado. Se mezcla, se incuba 10 minutos en hielo y se centrifuga a 4000 r.p.m. durante 10 minutos a 4C. Se pasa el sobrenadante a

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un tubo graduado y se mide su volumen. El precipitado se disuelve en 6 ml de H2O destilada (fraccin 2). 5. El sobrenadante obtenido se lleva a un 60% de saturacin con el (NH4)2SO4 saturado. Se procesa del mismo modo que en los pasos anteriores. El precipitado se disuelve en 6 ml de H2O destilada (fraccin 3). 6. Con las tres fracciones obtenidas y la ST(1/5) se realizarn las siguientes diluciones (en volumen/volumen): - ST (diluido 1/5): - Fraccin 1 - Fraccin 2 - Fraccin 3 dilucin 1/450 y dilucin 1/900. dilucin 1/12 y dilucin 1/24. dilucin 1/90 y dilucin 1/180. dilucin 1/90 y dilucin 1/180.

Para preparar cada dilucin, aplicar la frmula: Concentracininicial x Volumeninicial = Concentracinfinal x Volumenfinal. (Ci
x

Vi = Cf

Vf.)

considerando que el volumen final de las diluciones a preparar es de 900 microlitros (l), que la concentracin inicial es siempre de valor 1 en este tipo de diluciones y que la concentracin final es el valor de la dilucin que se desea obtener (1/12, 1/24, etc). Para diluir se utilizar agua destilada. Estas diluciones sern necesarias para determinar la concentracin de protena de cada fraccin obtenida.

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1.2 DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTEINAS.


El objetivo de la prctica es calcular la cantidad total de protena contenida en una disolucin. En un ensayo tpico de cuantificacin de protenas la tcnica a utilizar ser la colorimetra. En sta tcnica se aade un agente qumico colorante a una muestra de protena, provocando un cambio de color en la muestra. El color obtenido ser ms intenso cuanto mayor sea la concentracin de protenas en la muestra analizada. Este cambio de color es cuantificable mediante el uso de un aparato denominado colormetro, que analiza la intensidad del color y le asigna un valor correspondiente de absorbancia (energa retenida por la muestra). El anlisis del colormetro consiste en hacer pasas a travs de la muestra un haz de luz de longitud de onda correspondiente al color adquirido por la muestra y determinar cunta energa de ese haz de luz queda retenida por la muestra. Cuanto ms intenso sea el color de la muestra, ms energa retiene (mayor absorbancia). Para determinar la concentracin de protena presente en una muestra problema, se diluye la muestra, se pone en presencia del agente colorante y se mide su absorbancia. Este valor de absorbancia obtenido se compara con una recta patrn realizada previamente en la que se hacen reaccionar concentraciones conocidas de una protena control con el agente colorante. La cantidad de protena de la muestra problema puede ser deducida entonces interpolando su absorbancia en la recta patrn.

Colormetro y diagrama de funcionamiento.

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El ensayo que vamos a realizar, denominado ensayo de Bradford, est basado en el cambio de color que se produce en la muestra al poner en presencia de protena al colorante llamado Coomassie brilliant blue G-250, principio activo del reactivo de Bradford. El colorante se une a residuos aminoacdicos bsicos (especialmente la arginina) y aromticos.

1.2.1 MATERIAL Y REACTIVOS.


1.- Sero albmina bovina diluida a 1 mg/ml en agua destilada. 2.- Agua destilada. 3.- Tubos eppendorf de 1.5 ml (microtubos). 4.- Micropipetas y puntas de micropipetas. 5.- Diluciones de las fracciones obtenidas. 6.- Reactivo de Bradford. 7.- Colormetro y cubetas de plstico de colorimetra.

1.2.2 METODO.
1.- A partir de una disolucin de albmina a concentracin 1 mg/ml (1000 g/ml) y usando agua destilada como diluyente, preparar 6 diluciones con volumen final de 1 ml (1000 l), cada una con concentraciones finales de 5, 10, 25, 50, 75 y 100 g/ml. Realizar las diluciones en tubos eppendorf de 1.5 ml con tapa, tambin denominados microtubos. Mezclar bien cada dilucin. 2.- Recoger una alcuota de 200 l de cada una de las diluciones preparadas de BSA (includo el blanco) y depositarlos en una nueva batera de microtubos. 3.- Aadir 600 l del reactivo de Bradford a cada alcuota de 200 ml de cada dilucin (includo el blanco) y mezclar manualmente por inversin. Aadir el reactivo por orden desde la concentracin ms baja a la ms alta. 4.- Programar el colormetro a 595 nm de longitud de onda. Calibrar el colormetro a cero de absorbancia con el blanco. Medir la absorbancia de cada una de las muestras anotando el resultado obtenido en cada caso. Por

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ltimo, medir el blanco COMO SI FUERA UNA MUESTRA MS (sin reajustar a cero) para comprobar el error en la medida de las muestras. Para medir, seguir ESTRICTAMENTE el mismo orden de concentracin ms baja a ms alta que se sigui para aadir el reactivo de Bradford. 5.- Representar la recta patrn relacionando la absorbancia obtenida para cada dilucin con la concentracin de esa dilucin de BSA. Ajustar la recta grficamente. 6.- Recoger una alcuota de 200 l de cada una de las diluciones de las fracciones obtenidas en la prctica anterior (includo el blanco) y depositarlos en una nueva batera de microtubos. 7. Aadir 600 l del reactivo de Bradford a cada alcuota de 200 ml de cada dilucin de las fracciones (inclur un nuevo blanco) y mezclar manualmente por inversin. Aadir el reactivo por orden desde la concentracin ms baja a la ms alta, desde Fraccin 1 hasta ST(1/5). 8. Calibrar el colormetro a cero de absorbancia con el blanco. Medir la absorbancia de cada una de las muestras anotando el resultado obtenido en cada caso. Por ltimo, medir el blanco COMO SI FUERA UNA MUESTRA MS (sin reajustar a cero) para comprobar el error en la medida de las muestras. 9. Interpolar en la recta patrn los valores de absorbancia obtenidos para cada dilucin de fraccin analizada, y deducir su concentracin. Es muy importante seguir un orden a la hora de aadir el reactivo de Bradford para la posterior medida de las muestras. Para que las medidas de absorbancia sean fiables, todos las muestras deben estar, en la medida de lo posible, el mismo tiempo en contacto con el reactivo de Bradford.

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1.3 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 1.


Precipitacin fraccionada con sulfato de amonio 1.- Clculo de la dilucin 1/5 del Suero de Ternera (ST) en H2O destilada. Ci Ci Vi ml
x

Vi = Cf

Vf. Cf Vf ml

.......... ml ST + .......... ml H2O = 6 ml ST 1/5.

2.- Clculo de los volmenes de solucin saturada de sal [(NH4)2SO4] necesarios para obtener fracciones al 30%, 40% y 60% de sal. Vsal=V [(S2-S1)/1-S2]
% Sal (peso/volumen) S2 (tanto por uno) S1 (tanto por uno) Volumen solucin saturada de sal (Vsal)

30 % 40% 60%

ml ml ml

Determinacin cuantitativa de protenas 1.- Inserta aqu los resultados de los clculos de cada dilucin de BSA
Dilucin Volumen inicial BSA 1mg/ml Volumen de agua

100 g/ml 75 g/ml 50 g/ml 25 g/ml 10 g/ml 5 g/ml Blanco

l l l l l l 0 l

l l l l l l 1000 l

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2.- Inserta aqu los resultados de los clculos de cada dilucin de las fracciones.
Fraccin Dilucin Volumen de fraccin Volumen de agua

ST (diluido 1/5)

dilucin 1/450 dilucin 1/900

l l l l l l l l 0 l

l l l l l l l l 900 l

Fraccin 1

dilucin 1/12 dilucin 1/24

Fraccin 2

dilucin 1/90 dilucin 1/180

Fraccin 3

dilucin 1/90 dilucin 1/180

Blanco

----------

3.- Inserta aqu las medidas colorimtricas obtenidas. Diluciones de BSA


100 g/ml 75 g/ml 50 g/ml 25 g/ml 10 g/ml 5 g/ml Blanco (ltima)

Densidad ptica (u.a.)


u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a.

Diluciones de fracciones
Fr1. dilucin 1/24 Fr1 dilucin 1/12 Fr2 dilucin 1/180 Fr2 dilucin 1/90 Fr3 dilucin 1/180 Fr3 dilucin 1/90 St(1/5) dilucin 1/900 St(1/5) dilucin 1/450 Blanco (ltima)

Densidad ptica (u.a.)


u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a.

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4.- Representa grficamente SOBRE PAPEL MILIMETRADO ORIGINAL la recta patrn de sero albumina bovina poniendo en abscisas concentracin de protena y en ordenadas el valor de absorbancia a 595 nm. Una vez obtenida la recta patrn interpolar los resultados de absorbancia obtenidos para cada dilucin de las fracciones. Reflejar en la grfica TODAS las interpolaciones realizadas. Calcular la concentracin de protena que tiene cada dilucin. Diluciones de fracciones Fr1 dilucin 1/24 Fr1 dilucin 1/12 Fr2 dilucin 1/180 Fr2 dilucin 1/90 Fr3 dilucin 1/180 Fr3 dilucin 1/90 St(1/5) dilucin 1/900 St(1/5) dilucin 1/450 Densidad ptica (u.a.) u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. Concentracin de la dilucin (g/ml) g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml

BORRADOR PARA LA GRFICA DE CUANTIFICACIN DE PROTENAS

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5.- A partir de la concentracin de cada dilucin, calcular la concentracin real de protenas del ST (1/5) y de todas las fracciones obtenidas multiplicando la concentracin de cada dilucin por su valor de dilucin. Calcular el valor de concentracin real de la fraccin como el valor medio de concentracin obtenido a partir de cada dilucin. Calcula la cantidad (masa) de protena en ST, ST(1/5) y en las tres fracciones, teniendo en cuenta la concentracin real y el volumen de cada fraccin.

Factor de dilucin

Concentracin de la fraccin (g/ml)

Concentracin media de la fraccin (g/ml)

Masa de protena de la fraccin (en g)

[Fr1. dilucin 1/24] x 24 [Fr1 dilucin 1/12] x 12 [Fr2 dilucin 1/180] x 180 [Fr2 dilucin 1/90] x 90 [Fr3 dilucin 1/180] x 180 [Fr3 dilucin 1/90] x 90 [St1/5 dilucin 1/900] x 900 [St1/5 dilucin 1/450] x 450 [St 1/5] media x 5

g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml

Fr1

g/ml

Fr2

g/ml

Fr3

g/ml

St1/5

g/ml g/ml

g g

St

6.- Ordenar entre s las fracciones obtenidas en funcin de su masa (de menor cantidad a mayor cantidad), y justificar si el orden obtenido es lgico o no y por qu.

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1.4 EJERCICIO: DETERMINACIN DEL PESO MOLECULAR DE LAS CADENAS LIGERA Y PESADA DE LAS INMUNOGLOBULINAS.

La electroforesis se basa en el movimiento que experimenta una partcula cargada cuando se ve sometida a la accin de un campo elctrico. La partcula se desplazar hacia el electrodo de carga opuesta. As pues, una partcula cargada positivamente (catin) se desplazar hacia el ctodo (polo con carga negativa). Una partcula cargada negativamente (anin) se desplazar hacia el nodo (polo con carga positiva). Como conclusin general, en un medio determinado, las partculas se movern ms deprisa cuanto mayor sea su carga, y ms despacio cuanto mayor sea su tamao. En este laboratorio, las partculas sern molculas biolgicas macromolculas. En la separacin de macromolculas, como las protenas, la carga qp es muy baja en relacin a su masa. Para conseguir la migracion habra que aumentar mucho el campo elctrico y se producira la hidrlisis del agua. Se generaran altas concentraciones de OH- en el nodo y H+ en el ctodo, lo que provocara un gradiente de pH que afectara a la carga de la partcula. Tambin habra cambios en la viscosidad del medio debidos a la generacin de calor por una diferencia de potencial muy elevada. Estos problemas pueden ser solucionados realizando la electroforesis en un gran volumen de medio tamponado. An as la relacin carga/masa sigue siendo muy baja y la macromolcula migra muy lentamente con lo que el problema de difusin se hace muy importante. Para aumentar la velocidad de la macromolcula se aumenta la fuerza inica del medio y para evitar la difusin se realiza la electroforesis en soportes slidos inertes denominados geles porosos. La electroforesis es la tcnica ms utilizada en estudios analticos, sobre todo de componentes moleculares, utilizndose frecuentemente en el laboratorio para la separacin de protenas y de cidos nucleicos. La separacin de protenas se realiza habitualmente mediante gel de poliacrilamida en presencia de SDS. El gel se organiza en una red o malla a travs de cuyos poros circulan las
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protenas a separar. Se obtiene mediante la formacin de polmeros de acrilamida y el entrecruzamiento de stos mediado por la bis-acrilamida. El tamao de los poros depende de la concentracin absoluta y de la proporcin de acrilamida y bis-acrilamida del gel. La polimerizacin es promovida por el persulfato amnico y estabilizada por la N-N-NN-TEtraMetilEtilenDiamina (TEMED).

Figura 1: Electroforesis en gel de acrilamida. Polo superior: Ctodo (carga negativa). Polo inferior: nodo (carga positiva).

Los pesos moleculares de las protenas se pueden determinar midiendo su movilidad en geles de poliacrilamida en presencia del detergente dodecilsulfato sdico (SDS). Esto es debido a que la cantidad de SDS (cargado negativamente) que se une a una protena es proporcional al peso molecular del polipptido y es independiente de su secuencia. A saturacin, se une aproximadamente 1.4 g de detergente por gramo de protena. Existe una relacin lineal entre la distancia que una protena recorre en un gel y el logaritmo de su peso molecular. As pues, si tenemos una serie de protenas de las que conocemos su peso molecular podemos utilizarlas como patrn y midiendo la distancia que recorren en el gel, podemos construir una recta que nos permita calcular el peso molecular de nuestras protenas problema interpolando la distancia que han recorrido.
Figura 2: Resultado de una electroforesis de protenas tipo SDS-PAGE. A la izquierda, las bandas del marcador de peso molecular. Los carriles 1 a 8 se corresponden con distintas muestras de protenas. Polo superior: Ctodo (carga negativa). Polo inferior: nodo (carga positiva).

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En este tipo de electroforesis se suele usar un gel discontinuo constituido por el gel de separacin o resolucin (parte inferior) y el gel de concentracin o empaquetamiento (parte superior, con pocillos). La funcin del gel concentrador consiste en concentrar la muestra hasta conseguir idealmente que forme una lnea al inicio del gel resolutivo. Esto es posible gracias a que el paso de malla de este gel es muy grande. El propsito es que todas las muestras de protenas comiencen a resolverse por su tamao desde el inicio del gel resolutivo, y no desde la entrada en el pocillo. Tras la electroforesis, retiramos el gel concentrador y trabajamos slo con el resolutivo, el cual teimos con solucin de Coomasie para revelar las bandas de protenas presentes. En este ejercicio se van a analizar muestras provenientes de la precipitacin fraccionada; 1.- Suero de Ternera diludo 1/5., 2.- Fraccin 1 (precipitado obtenido con 30 % de sulfato amnico); 3.- Fraccin 2 (precipitado obtenido con 40% de sulfato amnico).; 4.- Fraccin 3 (precipitado obtenido con 60% de sulfato amnico). Se incluir tambin un carril con marcadores de peso molecular, que consisten en una mezcla de protenas de peso molecular conocido que nos servirn de referencia:

Bandas del Marcador


Miosina -galactosidasa Albmina de suero bovino Ovoalbmina Anhidrasa carbnica Inhibidor de tripsina de soja Lisozima Aprotinina

Peso molecular
207.000 Daltons 118.000 Daltons 81.000 Daltons 52.500 Daltons 36.200 Daltons 29.900 Daltons 20.700 Daltons 7.100 Daltons

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Prcticas de Bioqumica

Resultado de la Electroforesis: Presentacin.

Se observan las bandas correspondientes a las cadenas pesadas en las tres fracciones. En la ST1/5, debido a la gran cantidad de protena, aparece una mancha en la que no se puede distinguir la banda correspondiente a la cadena pesada. Las cadenas ligeras en la fraccin I y II no se detectan debido a la baja concentracin de protenas. En la fraccin II comienza a detectarse una banda muy tenue, mientras que en la ST1/5 se observa ntidamente pero en forma de mancha en lugar de en forma de banda.

Resultado de la Electroforesis: Ejercicio.

Se mide la distancia migrada en milmetros. Medir la distancia entre el inicio del gel resolutivo y el centro de cada banda, tanto para las bandas del marcador de peso molecular de protenas como para las bandas correspondientes a las cadenas pesadas y ligeras.

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Ejercicio 1.- Inserta aqu las medidas de migracin de las bandas del marcador de peso molecular y de las cadenas ligera (Cl) y pesada (Cp) de las inmunoglobulinas.
Bandas del Marcador Miosina -galactosidasa Albmina de suero bovino Ovoalbmina Anhidrasa carbnica
Inhibidor de tripsina de soja

Peso molecular 207.000 Daltons 118.000 Daltons 81.000 Daltons 52.500 Daltons 36.200 Daltons 29.900 Daltons 20.700 Daltons 7.100 Daltons

Distancia Migrada mm mm mm mm mm mm mm mm

Lisozima Aprotinina

Fracciones Fraccin 1 Fraccin 2 Fraccin 3 ST 1/5 Dilisis Intercambio 1 Intercambio 2 Intercambio 3 Distancia Media Migrada

Distancia migrada Cadena Pesada mm mm mm mm mm mm mm mm CP = mm

Distancia Migrada Cadena Ligera mm mm mm mm mm mm mm mm CL = mm

2.- Construir SOBRE PAPEL MILIMETRADO ORIGINAL la recta patrn que relaciona el logaritmo decimal de la distancia migrada (en mm) DE CADA BANDA DEL MARCADOR con su peso molecular. Sobre esta recta INTERPOLAR la distancia media de migracin de la cadena ligera y la cadena pesada de las inmunoglobulinas para deducir su peso molecular. Representar sobre la grfica ambas interpolaciones. Presentar los pesos moleculares de ambas cadenas.
Peso molecular Cadena Pesada Peso molecular Cadena Ligera

Daltons

Daltons

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BORRADOR PARA LA GRFICA DE LOS PESOS MOLECULARES DE PROTENAS

3.- Qu utilidad tiene la parte concentradora del gel de protenas? 4.- Qu ocurrira si no hubisemos aadido SDS (cargado negativamente) a la muestra de protenas y las sometiramos a electroforesis? PREGUNTA.- Explica razonadamente la siguiente cuestin. Las inmunoglobulinas estn compuestas por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras unidas entre s por puentes disulfuro. Este dato nos indicara que la inmunoglobulina migrara como una nica protena, detectando una sola banda. Sin embargo, en el gel de electroforesis observamos que aparecen dos bandas diferenciadas (cadenas pesada y ligera), y no una nica protena. A qu se debe este hecho?

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PRACTICA N 2. DETERMINACIN DE LA Km DE LA FOSFATASA CIDA PARA EL pNITROFENILFOSFATO Y DE LA Ki PARA LA INHIBICIN POR FOSFATO
La actividad enzimtica se ve afectada entre otros factores, por la concentracin de sustrato inicial en la reaccin [S]inicial. La constante de Michaelis-Menten (Km) se define como la concentracin de sustrato para la cual la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima (Vmx). Permite conocer la concentracin mnima de sustrato a la que hay que realizar los ensayos de actividad enzimtica.

Fig. 1a: Grfica hiperblica Vo frente a [S]; Fig 2b: Grfica tipo Lineweaver-Burk (inversos).

La inhibicin enzimtica se define como la variacin de los parmetros Km o Vmx del enzima provocada por la presencia de sustancias denominadas inhibidores. Kap y Vmx-ap hacen referencia a la Km y Vmx del enzima observados en presencia del inhibidor. Los enzimas pueden inhibirse reversiblemente de manera competitiva y no competitiva. En la inhibicin competitiva, la unin del sustrato y del inhibidor al enzima son mutuamente excluyentes, mientras que en la no competitiva el inhibidor se une a un sitio regulador distinto del centro activo. La inhibicin no competitiva implica la

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disminucin de la velocidad de la reaccin catalizada por un enzima (Vmx-ap es menor que Vmx), manteniendo Km constante. En la inhibicin competitiva Kap es mayor que Km, mientras que Vmx se mantiene constante. En la inhibicin competitiva se observa que al incrementar la concentracin de sustrato en la reaccin, el porcentaje de inhibicin disminuye, mientras que en la no competitiva el porcentaje de inhibicin permanece constante e independiente del incremento en la concentracin de sustrato.

Fig. 2: Grficas hiperblica Vo frente a [S] y representacin de inversos para inhibicin reversible competitiva (A) e inhibicin reversible no competitiva (B).

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La constante de inhibicin (Ki) mide la afinidad del enzima E por el inhibidor I. Se define como:

E+I

EI

Ki =

[E] [I] [EI]

En el caso de una inhibicin no competitiva, Kap ser igual a Km, pero en el caso de una inhibicin competitiva Ki debe deducirse a partir de la Kap la cual se define como Km aparente del enzima en presencia del inhibidor.

Kap = Km {1+ ( [I]inicial / Ki )}

La fosfatasa cida de la levadura Saccharomyces cerevisiae cataliza la siguiente reaccin: p-nitrofenilfosfato + H2O p-nitrofenol + fosfato

Esta enzima, como su nombre indica, tiene un pH ptimo de actividad a pH 4. La determinacin de la actividad de la fosfatasa se realiza midiendo la cantidad de p-nitrofenol liberado por accin del enzima contenido en las clulas de la levadura durante un perodo de tiempo determinado. La reaccin se detiene aadiendo carbonato sdico (Na2CO3) que provoca un cambio brusco de pH alcalinizando el medio. La actividad de la enzima se puede estudiar gracias a que el producto de la reaccin (p-nitrofenol) en solucin alcalina posee un color amarillo caracterstico que posee su mximo de absorbancia a 400 nm (mientras que el sustrato de la reaccin, p-nitrofenil-fosfato, no absorbe a esta longitud de onda).

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Propsito de la prctica: Determinacin de Km, Kap y Ki. La determinacin de la Km de la fosfatasa cida para el p-nitrofenil-fosfato se realiza incubando el enzima (fosfatasa contenida en las clulas de levadura) con diferentes concentraciones de sutrato (p-nitrofenil-fosfato) y midiendo el pnitrofenol liberado en cada caso mediante colorimetra a 400 nm. La determinacin de la Kap de la fosfatasa cida en presencia del fosfato monopotsico (inhibidor) se realiza incubando la enzima en las condiciones anteriores y en presencia de una concentracin constante del inhibidor. Para los inhibidores de tipo competitivo, la determinacin de Ki se realiza a partir de los datos de Km y Kap obtenidos. Para los inhibidores de tipo no competitivo, no es posible hallar Ki a partir de Km y Kap, siendo Kap=Km.

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2.1 DILUCIONES SERIADAS DEL SUSTRATO 2.1.1 MATERIALES Y REACTIVOS.


1.- Dilucin 50 mM PNPP (sustrato). 2.- Tampn Citrato pH 4.0 3.- Pipetas de Vidrio. 4.- Micropipetas y puntas de micropipeta. 5.- Tubos de plstico de 2ml con tapn.

2.1.2 METODO.
Preparar en tubos de 2 ml un banco de diluciones seriadas a partir de una dilucin inicial de PNPP 50 mM. Utilizar la frmula Ci diluyente TAMPN CITRATO pH 4.0. Inserta aqu los resultados de los clculos de cada dilucin.
Dilucin de PNPP Volumen inicial Volumen de Tampn Citrato pH 4.0
x

Vi = Cf

Vf. Utilizar como

50 mM 40 mM 30 mM 20 mM 10 mM 8 mM 4 mM 2 mM

2000 l l del 50 mM l del 40 mM l del 30 mM l del 20 mM l del 10 mM l del 8 mM l del 4 mM

l l l l l l l

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2.2 ENSAYOS ENZIMTICOS EN AUSENCIA Y EN PRESENCIA DEL INHIBIDOR 2.2.1 MATERIALES Y REACTIVOS.
1.- Banco de diluciones de PNPP (sustrato). 2.- Dilucin 15 mM Fosfato monopotsico (Inhibidor). 3.- Tampn Citrato pH 4.0 4.- Carbonto sdico 0.1 M. 5.- Pipetas de Vidrio. 6.- Micropipetas y puntas de micropipeta. 7.- Tubos de plstico de 2m y de 12 ml. 8.- Cultivo lquido de levadura. 9.- Colormetro y cubetas de colormetro. 10.- Estufa a 30 C. 11.- Centrfuga de rotor basculante para tubos de 12 ml.

2.2.2 MTODO.
IMPORTANTE: Realizar primero las reacciones sin inhibidor y medir su absorbancia. Una vez comprobado que los valores obtenidos son aceptables, realizar las reacciones con inhibidor y medir su absorbancia. 1. Numerar los tubos de centrfuga, colocarlos en una gradilla y poner en cada uno de ellos las cantidades de tampn, sustrato e inhibidor que se indica en la tabla. Aadir a cada uno de los tubos (excepto el blanco) 0.2 ml de la suspensin de clulas de Saccharomyces cerevisiae (que contienen fosfatasa cida). Agitar la suspensin de clulas antes de pipetearla. 2. Incubar las reacciones durante 15 minutos a 30C en una estufa o bao.

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Preparacin de las reacciones sin inhibidor (slo sustrato).


nmero de reaccin Volumen de Tampn Citrato pH 4.0 Volumen de sustrato (p-Nitrofenilfosfato) Levadura

1 2 3 4 5 6 7 8 Blanco s

0.6 ml 0.6 ml 0.6 ml 0.6 ml 0.6 ml 0.6 ml 0.6 ml 0.6 ml 0.8 ml

0.2 ml del 2 mM 0.2 ml del 4 mM 0.2 ml del 8 mM 0.2 ml del 10 mM 0.2 ml del 20 mM 0.2 ml del 30 mM 0.2 ml del 40 mM 0.2 ml del 50 mM 0.2 ml del 2 mM

0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml ----------

Preparacin de las reacciones con inhibidor.


nmero de reaccin Volumen de Tampn Citrato pH 4.0 Volumen de sustrato (p-Nitrofenilfosfato) Inhibidor (fosfato monopotsico 15 mM) Levadura

9 10 11 12 13 14 15 16 Blanco i

0.4 ml 0.4 ml 0.4 ml 0.4 ml 0.4 ml 0.4 ml 0.4 ml 0.4 ml 0.6 ml

0.2 ml del 2 mM 0.2 ml del 4 mM 0.2 ml del 8 mM 0.2 ml del 10 mM 0.2 ml del 20 mM 0.2 ml del 30 mM 0.2 ml del 40 mM 0.2 ml del 50 mM 0.2 ml del 2 mM

0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml

0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml ----------

3. Tras incubar las reacciones durante 15 minutos a 30C, detener la reaccin con 3 ml de Carbonato sdico (Na2CO3 ) 0.1 M empezando en el mismo orden en que se aadi la levadura. Aadir tambin 3 ml de carbonato sdico 0.1 M al blanco.

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4. Centrifugar para evitar la turbidez producida por las clulas y conservar los sobrenadantes. 5. Programar el colormetro a 400 nm de longitud de onda. Calibrar el colormetro a cero de absorbancia con el blanco. Medir la absorbancia de cada una de las reacciones anotando el resultado obtenido en cada caso. Por ltimo, medir el blanco COMO SI FUERA UNA MUESTRA MS (sin reajustar a cero) para comprobar el error en la medida de las muestras. Para medir, seguir ESTRICTAMENTE el orden de concentracin ms baja a concentracin ms alta de sustrato. Inserta aqu las medidas colorimtricas obtenidas. Nmero de reaccin 1 2 3 4 5 6 7 8 Blanco s (ltima) 9 10 11 12 13 14 15 16 Blanco i (ltima) Densidad ptica (u.a.) u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a.

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Inserta aqu los valores de concentracin de sustrato e inhibidor INICIALES en cada reaccin (volumen final de la reaccin: 1 ml).
Nmero de reaccin Volumen de sustrato usado en la reaccin [S] inicial en la reaccin Volumen de Inhibidor usado en la reaccin [I] inicial en la reaccin

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

0.2 ml del 2 mM 0.2 ml del 4 mM 0.2 ml del 8 mM 0.2 ml del 10 mM 0.2 ml del 20 mM 0.2 ml del 30 mM 0.2 ml del 40 mM 0.2 ml del 50 mM 0.2 ml del 2 mM 0.2 ml del 4 mM 0.2 ml del 8 mM 0.2 ml del 10 mM 0.2 ml del 20 mM 0.2 ml del 30 mM 0.2 ml del 40 mM 0.2 ml del 50 mM

mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM

------------------------------------------------------------------------0.2 ml del 15 mM 0.2 ml del 15 mM 0.2 ml del 15 mM 0.2 ml del 15 mM 0.2 ml del 15 mM 0.2 ml del 15 mM 0.2 ml del 15 mM 0.2 ml del 15 mM

------------------------------------------------------------------------mM mM mM mM mM mM mM mM

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Inserta aqu los valores de concentracin de sustrato INICIALES y absorbancia en cada reaccin y sus correspondientes inversos. Nmero de reaccin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 [S] inicial mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM 1/[S] inicial 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM 1/mM Vmax (Abs) u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. 1/ Vmax (Abs) 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a. 1/u.a.

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2.3 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 2.

1.- Representa grficamente SOBRE PAPEL MILIMETRADO ORIGINAL las grficas hiperblica y de inversos correspondientes a las reacciones en ausencia y en presencia del inhibidor. La representacin se construye relacionando la absorbancia obtenida para cada reaccin con la concentracin INICIAL de sustrato en esa reaccin. (en abscisas, concentraciones INICIALES de pnitrofenilfosfato ensayadas; en ordenadas, absorbancias a 400 nm). Deducir grficamente Km, Vmx, Kap y Vmx-ap tanto en la representacin hiperblica como en la de inversos.

Inserta aqu los valores de Km, Vmx, Kap y Vmx-ap obtenidos. Grfica Hiperblica Km mM Vmax (Abs) u.a. Kap mM Vmax-ap (Abs) u.a.

Grfica Inversos

-1/Km (mM)-1
Km

1/Vmax (Abs) (u.a.)-1


Vmax (Abs)

-1/Kap (mM)-1
Kap

1/Vmax-ap (Abs) (u.a.)-1


Vmax-ap (Abs)

mM

u.a.

mM

u.a.

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2.- Calcular el % de actividad e inhibicin producido por el fosfato monopotsico para cada concentracin de sustrato INICIAL utilizada. % actividad = (Abs con inhibidor/ Abs sin inhibidor) x 100. % inhibicin = 1- % actividad.

Nmero de reaccin 9 10 11 12 13 14 15 16

[S] inicial mM mM mM mM mM mM mM mM

% actividad % % % % % % % %

% inhibicin % % % % % % % %

3.- Determinar el tipo de inhibicin reversible (competitiva o no competitiva) ejercida por el fosfato monopotsico sobre la fosfatasa cida, considerando: 1) los porcentajes de inhibicin obtenidos; 2) las variaciones entre Kap y Km y entre Vmx ap y Vmx observados en la representacin de inversos. Razona tu respuesta. 4.- En el caso de resultar que el fosfato monopotsico ejerce sobre la fosfatasa cida una inhibicin reversible competitiva, calcular el valor de Ki de la fosfatasa cida. Utilizar los valores de Km y Kap obtenidos mediante la representacin de inversos.

Km mM

Kap mM

[I] inicial mM

Ki mM

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BORRADOR PARA LA GRFICA HIPERBLICA DE ACTIVIDAD E INHIBICIN DE LA FOSFATASA.

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BORRADOR PARA LAS GRFICAS DE TIPO LINEWEAVER-BURK DE ACTIVIDAD E INHIBICIN DE LA FOSFATASA.

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BORRADOR PARA LA REPRESENTACIN GRFICA DEL PORCENTAJE DE ACTIVIDAD DE LA FOSFATASA EN PRESENCIA DEL INHIBIDOR RESPECTO A LA CONCENTRACIN INICIAL DE SUSTRATO.

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PRCTICA N 3 PURIFICACION VIRTUAL DE PROTEINAS CON ACTIVIDAD ENZIMATICA


En esta sesin se utilizar un programa de ordenador, ProtNLab, que simula el proceso de purificacin de un enzima. Este programa ha sido creado por el Dr. A. G. Booth de la Facultad de Bioqumica y Biologa Molecular de la Universidad de Leeds (Reino Unido). Las versiones del programa para distintas plataformas (Windows, Mac y Unix) se encuentra disponible en la pgina web http://home.btconnect.com/agbooth/archive/. La versin para entorno Windows est depositada como material de prcticas en el Campus Virtual de la asignatura y en las pginas web docentes de los profesores del rea de Bioqumica y Biologa Molecular del Departamento de Ciencias de la Salud III Dres. Antonio Coloma (http://docentes.cs.urjc.es/~acoloma) y Oscar de Luis (http://docentes.cs.urjc.es/~odeluis).

3.1 PRESENTACIN DEL PROGRAMA INFORMTICO .


El programa permite simular la purificacin de 20 enzimas diferentes. Cada enzima se identifica con un nmero del 1 al 20. Elegir el nmero deseado. A continuacin nos indican una serie de caractersticas generales del enzima: estabilidad trmica, estabilidad frente al pH, etc. Esta informacin no suele ser til para disear las primeras etapas del proceso de purificacin. Es posible elegir entre las siguientes tcnicas de separacin.

3.1.1 DESCRIPCIN DEL PROGRAMA


1.- Tratamiento con calor. En general es un paso de utilidad limitada debido a que la gran mayora de las protenas son slo estables en un rango de temperatura determinado, generalmente cercano al fisiolgico. 2.- Precipitacin con sulfato amnico. Define el porcentaje de saturacin inicial y final. Prueba tres condiciones para intentar conseguir el mximo de la actividad enzimtica en una de las fracciones (sobrenadante o sedimento) y el mximo posible de protena total en la fraccin opuesta. Para definir nuevos porcentajes de saturacin inicial y final usa la tecla Escape. Si no consigues una buena separacin, utiliza otra tcnica.

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3.- Cromatografa de intercambio de iones. El programa da a escoger entre los siguientes tipos de intercambiadores de iones: MATRIZ DEAE-Celulosa CM-Celulosa Q-Sepharosa S-Sepharosa CARGA NETA POSITIVA NEGATIVA POSITIVA NEGATIVA CONTRAION Anin Catin Anin Catin

La elucin de las protenas en la cromatografa de intercambio de iones se realiza mediante un gradiente lineal de concentracin creciente de sal (ver figura 1). En las fracciones obtenidas se determina la presencia de protenas midiendo la absorbancia de las fracciones a 280 nm y la actividad enzimtica. A continuacin, rene todas las fracciones en las que se detecta actividad enzimtica (pool fractions) y contina con la siguiente etapa del proceso de purificacin. 4.- Cromatografa de filtracin en gel. El programa ofrece la posibilidad de utilizar distintas matrices para cromatografa de exclusin, en funcin del tamao molecular de la protena que pretendemos purificar: MATRIZ Sephadex G50 Sephadex G100 Sephacryl S-200 Ultrogel ACA 54 Ultrogel ACA 44 Ultrogel ACA 34 Biogel P 60 Biogel P 150 Biogel P 300 RANGO DE FRACCIONAMIENTO ( kDa ) 1.5 - 30 4 - 150 5 - 250 5 - 70 10 - 130 20 - 350 3 - 60 15 - 150 60 - 400

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5.- Cromatoenfoque e Isolectroenfoque preparativo: Estas tcnicas permiten separar las protenas por diferencias en su punto isoelctrico (pI). El programa permite estimar el enriquecimiento y el rendimiento obtenido en cada etapa de la purificacin (purification record). Se incluyen los siguientes datos en forma de Tabla: 1.- Enzyme (units). Se refiere a la actividad enzimtica total. 2.- Proteina total (mg). Incluye el enzima que ests purificando y todos los dems enzimas contaminantes. 3.- Rendimiento (yield): (enzyme units FINAL / enzyme units INICIAL ) X 100. El rendimiento estima la prdida de actividad enzimtica a lo largo de la purificacin. Debe ser lo ms prximo posible al 100%. 4.- Enriquecimiento (enrichment factor): actividad especfica FINAL / actividad especfica INICIAL. Actividad especfica = enzyme units / protena total. El enriquecimiento estima el grado de purificacin obtenido. Cuanto mayor sea su valor numrico, mayor ser el grado de pureza. El grado de pureza tambin se puede determinar mediante tcnicas de electroforesis. El programa permite realizar electroforesis monodimensional en condiciones desnaturalizantes y reductoras (SDS-PAGE, ver fundamento en la prctica 3) y bidimensional ( 2D SDS-PAGE ). La electroforesis bidimensional consta de dos electroforesis consecutivas: 1.- Isoelectroenfoque. Destruye la estructura cuaternaria de las protenas (incluyendo los puentes disulfuro), con lo que separa los distintos polipptidos, monmeros o subunidades de un enzima multimrico. Separa los polipptidos por sus puntos isoelctricos en un gel de poliacrilamida en el cual se establece un gradiente de pH utilizando una mezcla de tampones. Los polipptidos se mueven en funcin de su carga neta hasta la zona del gradiente donde el pH es

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igual a su punto isoelctrico (pI), en la cual su carga neta ser cero y por lo tanto su movilidad ser nula. El isoelectroenfoque es la primera dimensin (figura 2). 2.- Electroforesis SDS-PAGE. El gel de isoelectroenfoque se sita perpendicular a la direccin de migracin de la segunda electroforesis en un gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes y reductoras (SDS-PAGE) (figura 2). Las protenas migran en esta segunda dimensin en funcin de su peso molecular y se detectan como manchas discretas en una posicin que se corresponde en la dimensin horizontal con su peso molecular y en la vertical con su punto isoelctrico ( pI ). La electroforesis bidimensional tiene una alta resolucin, permitiendo separar incluso 2000 protenas diferentes en un solo gel.

3.1.2 MTODO.
Nuestro objetivo es purificar a homogeneidad (sin ningn otro enzima contaminante) el enzima contenido en el material de partida. Para ello, a partir de una muestra determinada se irn realizando secuencialmente las pruebas indicadas en la descripcin del programa, variando las condiciones de cada ensayo para optimizar la purificacin de la protena problema.

3.2 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 3.


Purificacin virtual de dos muestras. El profesor la profesora de prcticas asignarn a cada grupo de trabajo el nmero de dos muestras que deben procesar. Se anotarn todos los pasos dados durante la purificacin en su orden correspondiente y las condiciones de cada uno de stos, as como su rendimiento. El resultado final de cada purificacin virtual debe ser una sola mancha en un gel bidimensional (homogeneidad), alcanzar un rendimiento lo ms prximo al 100 % (mnima prdida de actividad enzimtica) y un enriquecimiento lo ms alto posible (alto grado de pureza). Cada purificacin debe ser realizada con el mnimo nmero de pasos posible.

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Problema Se dispone de una mezcla de tres protenas A, B y C que deseamos purificar. La protena A es una enzima, por lo que utilizaremos la medida de su actividad enzimtica para seguir su separacin. En primer lugar, realizamos precipitacin con sulfato amnico hasta saturacin final del 45% y conservamos la fraccin soluble. Teniendo en cuenta los resultados de valorar la mezcla inicial y la fraccin soluble presentados en la tabla, calcular la actividad total y el enriquecimiento de esta fraccin. Como segundo paso del proceso de purificacin, realizamos cromatografa de intercambio de iones en DEAE-Celulosa a pH 8,5 y elucin en un gradiente de Cl Na. Los resultados de valorar la actividad enzimtica y la cantidad de protena en cada una de las fracciones obtenidas se muestran en el siguiente grfico, mientras que las mismas medidas realizadas en una mezcla de las fracciones 4 a 9 se presentan en la tabla. Calcular el rendimiento y el enriquecimiento para este paso.
PROTEINA MG INICIAL Sulfato amnico DEAE-CELULOSA 511 121 19 5.600 ACTIV ENZ UI 6.000 RENDIMIENTO % 100 94 ENRIQUECIMIENTO N 1

0.5

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Nmero de fraccin

_________________Cantidad de protena . . . . . . . . . . . . . . . . . . Actividad enzimtica de A

--------------------Concentracin molar

de Cl Na

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Para purificar las protenas B y C, se juntan las fracciones 35 a 43 y el pool resultante se analiza por electroforesis bidimensional. La separacin en la dimensin horizontal es por isoelectroenfoque. La separacin en la dimensin vertical es por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes y reductoras (SDS-PAGE). El resultado es:
5 kDa 94 68 B 45 C 6 7 pH

Si se sabe que la protena B es un homotrmero cuyas tres cadenas polipeptdicas idnticas estn unidas por puentes disulfuro y la C es un monmero, qu tcnica usaras para separar la protena B de la C? Por qu?

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PRACTICA N 4. TCNICAS CROMATOGRFICAS.


Muchas de las tcnicas que se utilizan en Bioqumica para la separacin de los componentes de una mezcla de molculas biolgicas, se basan en las diferencias que existen en las propiedades fsicas y/o qumicas de sus componentes. Los componentes con propiedades fsico-qumicas muy diferentes son fcilmente separables, sin embargo,si presentan propiedades muy similares, los mtodos de separacin tendrn que ser ms complejos. En todas las cromatografas existen una fase mvil y una fase estacionaria. La velocidad a la que cada componente atraviesa la fase estacionaria depende de la suma de la fuerza de transmisin que produce el movimiento de la fase mvil y de la fuerza de interaccin del componente con la fase estacionaria que tiende a frenar este desplazamiento. La interaccin de los componentes con la fase estacionaria puede consistir en un reparto entre la fase estacionaria y la fase mvil o en una adsorcin a la fase estacionaria. Un tipo particular de cromatografa de reparto lo constituye la cromatografa de filtracin en gel (o tambin denominada de exclusin). Otras cromatografas se basan en la adsorcin, como la cromatografia de intercambio de iones y la cromatografa de afinidad.

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4.1 CROMATOGRAFIA EN PAPEL.


En esta prctica se utilizar la cromatografa en papel para separar por polaridad verde luz, hemoglobina y azul dextrano. Sobre un soporte fsico (papel) embebido en agua (fase estacionaria) depositaremos en la base una muestra de la mezcla de pigmentos. A continuacin pondremos la base del papel en contacto con un disolvente orgnico (fase mvil), permitiendo que ascienda a lo largo del papel por capilaridad. La fase mvil ascender por el papel sin mezclarse con el agua, al tiempo que los pigmentos se irn separando en funcin de su polaridad. Los pigmentos ms polares (hidroflicos) se retendrn ms en la fase estacionaria, mientras que los ms apolares (hidrofbicos) avanzarn ms rpido junto con la fase mvil. La movilidad de cada compuesto respecto al frente del disolvente tiene un valor caracterstico, en unas condiciones experimentales determinadas, que se conoce como coeficiente o factor de reparto (Rf). Aqul pigmento que resulte ms hidrofbico conseguir avanzar ms lejos sobre el soporte slido, consiguiendo un valor de Rf ms alto. Los tres componentes que queremos separar absorben en la regin visible del espectro y ello nos permitir visualizar su separacin a lo largo del papel.
Figura 1: Resultado de una cromatografa en papel.

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4.1.1 MATERIAL Y REACTIVOS.


1.- Tira de papel Whatman. 2.- Placa de Petri. 3.- Fase mvil: disolvente apolar mezcla de ter de petrleo/acetona/benceno en proporcin 85/10/5. 4.- Fase estacionaria: agua destilada. 5.- Mezcla de pigmentos. 6.- Tubo Falcon de 50 ml. 7.- Regla (con escala en milmetros) y lapicero.

4.1.2 MTODO.
1.- Recortar una tira de papel Whatman de 15 cm de largo por 2,5 cm de ancho. Dibujar sobre el papel Whatman 2 lneas con lpiz. Una a 2 cm de uno de los extremos y otra a 6 cm del otro extremo. 2.- Embeber el papel Whatman en fase estacionaria (agua) dentro de la placa petri, procurando eliminar el exceso. 3.- En un tubo Falcon de 50 ml, aadir 3 ml de fase mvil (mezcla de disolvente). Depositar el Falcon cerrado en una gradilla. 4.- Situar la tira de papel embebida en agua sobre la tapa seca de la placa de petri. Sobre la lnea situada a 2 cm del papel de celulosa, depositar un par de muestras de la mezcla de pigmentos. Cada muestra ser de 5 l y deben estar suficientemente separadas entre s. 5.- Abrir el Falcon, tomar la tira de papel con la muestra de pigmentos e Introducirla en el tubo de manera que no toque las paredes y que el disolvente moje el extremo inferior de la tira, pero sin llegar a tocar la muestra. A

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continuacin, doblar el extremo superior por fuera del Falcon (por encima de la marca de 6 cm) y cerrarlo con la tapa. 6.- Esperar a que el disolvente ascienda por capilaridad hasta aproximadamente la marca superior del papel. Sacar la tira del tubo, dejar secar y medir el Rf de cada mancha de pigmento que aparezca.
Figura 2: Medicin de la distancia migrada por cada pigmento

Rf = DA / DS DA= DS= distancia alcanzada por el

pigmento. distancia alcanzada por el disolvente

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4.2 DEMOSTRACIN: CROMATOGRAFIA DE EXCLUSIN.


La cromatografa de filtracin en gel separa molculas por tamao, que es funcin de su peso molecular. La fase estacionaria la forma un gel, que se introduce en una columna. El gel est constituido por esferas con poros de un determinado dimetro (ver figura 1). La fase estacionaria es en realidad la parte de la fase mvil que est en el interior de los poros. Las molculas grandes no entran en los poros de las esferas del gel y por ello son arrastradas (eluyen) muy rpidamente por la parte de la fase mvil exterior a las esferas, el volumen de exclusin de la columna. Las molculas pequeas entran en los poros de las esferas del gel y por ello eluyen ms lentamente. De esta forma, las molculas se separan en funcin de su tamao, eluyendo fuera de la columna en orden decreciente de peso molecular.
Figura 1. Principio de la cromatografa de exclusin A)

B)

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Considerando este modelo, se definen los siguientes parmetros : VE= volumen de elucin de una molcula. Es el volumen de fase mvil que es necesario hacer fluir por la fase estacionaria para que la molcula salga eluida de la columna. Vo = volumen de fase mvil fuera de las esferas del gel o volumen de exclusin Vi = volumen de fase mvil en el interior de los poros del gel. Se determina como diferencia entre el volumen mximo de elucin y el volumen mnimo de elucin volumen de exclusin. VG = volumen de las esferas del gel, menos el volumen de los poros VS = Vi + Vg = volumen de sephadex hodratado. Vt = Vo + Vi + Vg = volumen total de la columna. El coeficiente de distribucin, KD, de una molcula entre la fase estacionaria y la fase mvil representa la fraccin de la fase estacionaria (Vi) que es accesible para la molcula y se define como: Kd = ( Ve Vo ) / Vi. El volumen de exclusin Vo es el volumen de elucin de una molcula de muy alto peso molecular que se excluye de los poros del gel (por ejemplo azul dextrano de peso molecular mayor de 106 Da).. Para esta molcula Ve=Vo, lo que implica que su Kd = 0 y el volumen de elucin es el mnimo posible. Para molculas de peso molecular muy pequeo Ve = Vo + Vi, lo que implica Kd = 1, siendo entonces el volumen de elucin el mximo posible. Por lo tanto, el coeficiente de distribucin Kd est comprendido entre cero y uno. Para protenas globulares existe una relacin lineal entre el logaritmo de sus pesos moleculares y su volmenes de elucin de la forma. log Pm = a b Ve en la que a mayores valores de Pm (y log Pm) correspondern a menores valores de Ve y viceversa. Los trminos a y b son constantes y sus valores dependen del gel y de las dimensiones de la columna. Si separamos varias molculas patrones de pesos moleculares conocidos, la determinacin de sus volumenes de elucin permite establecer una recta patrn del logaritmo del peso molecular frente al volumen de elucin Ve.

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Si queremos determinar el peso molecular de una molcula, bastar con separarla utilizando la misma columna en las mismas condiciones que con los patrones, determinar su volumen de elucin e interpolar en la recta patrn. En esta demostracin se utilizar la cromatografa de filtracin en gel Sephadex G-100, para separar por peso molecular verde luz, hemoglobina y azul dextrano. Los tres componentes que queremos separar absorben en la regin visible del espectro y ello nos permitir visualizar su separacin a lo largo de la columna y en las diferentes fracciones recogidas.

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4.3 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 4.


Cromatografa en papel. 1.- En la cromatografa en papel, identifica qu mancha se corresponde con cada pigmento en el ensayo realizado. Completa el cuadro y calcula la Rf media para cada pigmento. Ordena los pigmentos entre s de mayor a menor hidrofobicidad.

Pigmento Verde Luz

Muestra aplicada Muestra 1 Muestra 2

Valor DA mm mm mm mm mm mm

Valor Rf mm mm mm mm mm mm

Valor medio Rf mm

Azul dextrano

Muestra 1 Muestra 2

mm

Hemoglobina

Muestra 1 Muestra 2

mm

Valor Ds:______________mm 1er Pigmento ms hidroffico: 2do Pigmento ms hidroffico: 3er Pigmento ms hidroffico:

2.- Razona en funcin de la prctica realizada qu factores pueden afectar al Rf. Justifica la incidencia de cada factor propuesto.

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ANOTACIONES

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ANOTACIONES

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ANOTACIONES

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