Propiedades químicas de los aa y proteínas

martes, 25 de enero de 2022 17:03

Análisis Cualitativo de aminoácidos

Consiste en exponer una alícuota de un aminoácido a la presencia de compuestos químicos que produzcan una reacción o no, depe ndiendo de los grupos funcionales presentes en el
aminoácido

TEST PROCEDIMIENTO POSITIVO NEGATIVO

Prueba de Ninhidrina • Alícuota de 1 mL + unas gotas de ninhidrina AZUL = aa presente Amarillo = prolina
• Homogenizar
• Baño maria 5 minutos
• Enfriar a T. ambiente
Ácido Xantoproteico • Alícuota de 1 mL + gotas de HNO3 Naranja = aa aromático Amarillo
• Homogenizar
• Hervir en mechero 3-5 min
• Enfriar por contacto con agua FENILALANINA da positivo si agregamos NaOH al HNO3
• Alcalinizar
Diazo de Pauly • Ácido sulfánico + NaNO2 (EN FRÍO) Rojo Incoloro
• Alícuota de aa en frío • Trp (W) e His (H)
• Homogenizar
• Agregar NaCO3
Test de Millon • Agregar muestra Formación de un precipitado No formación de ppt
• Agregar reactivo de millon
• Llevar a la llama Luego de calentar el ppt este se vuelve rojo ladrillo

Determinación espectrofotométrica de aminoácidos

Debido a la estructura aromática de algunos aminoácidos, se puede apreciar absorbancia en el espectro UV. Además de poder emi tir señales detectables bajo efectos de la luz UV

Glicoproteínas
PROTEÍNAS = GLÚCIDOS

• Otra forma de identificar proteínas es mediante la detección de las glúcidos, ya que algunas se encuentran conjugadas
• La identificación de carbohidratos permite, de manera indirecta, identificar proteínas glicosiladas
○ Ej - Proteínas de membrana y algunos anticuerpos

Test Principio Resultado

Reacción de Molisch Deshidratación de carbohidratos, por ácidos fuertes a furfural o derivados, los cuales Halo de color Rojo-Violeta
reaccionan con a-naftol

Análisis Cualitativo de proteínas

Curiosidad: Biuret se puede usar para cuantificar proteínas si se usa espectrofotometría

Test Principio Resultado

Reacciones alcaloidales • Se emplean ácidos que hacen precipitar a los alcaloides Presencia de un ppt
• Se combinan las proteínas cuando tienen cargas +
SE FORMAN ALCALOIDES (ppt) • Medio ácido
• Para garantizar la carga +

Ácido tánico / ácido pícrico / ácido picrolonico

Precipitación con ácidos minerales fuertes • Desnaturalización de proteínas Presencia de un ppt

ES DESNATURALIZACIÓN (ppt)
Biuret • Identificación de enlaces peptídicos en polipéptidos y proteínas Coloración Rosa-violeta
• Formación de un complejo de coordinación entre los iones de Cu 2+ y los pares de
electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos
• Reacción en medio básico

• ABSORBANCIA MÁXIMA A 540 nm

Reacción de Bradford
• El colorante Coomasie brillante G-250 se absorbe en una proteína y transforma su coloración de Rojo a Azul, modificando el espectro de absorción espectrofotometría
• Empleo de espectrofotometría para cuantificación

• LONGITUD DE ONDA ÓPTIMA : 595 nm

• Sensibilidad: 1-10 um
• Cambio: Rojo a Azul

MEDICIÓN DE PROTEÍNAS
Consideraciones Interpretación

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Asegurarse de que no existan muchos interferentes
Inferior al límite de detección
Superior al límite de detección
Confiabilidad
SE SUGIERE Por desviaciones
Para evitar los dos posibles casos
Resumen
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• Se tienen que hacer barridos
• Conocer las características y elementos de la solución
• Conocer las longitudes de onda ideales para trabajar con la solución
• Reconcentrar con N2 gaseoso (evaporación del solvente)
• O desecar y re suspender en solvente de Vol conocido (SI NO SE DESEA CONOCER ESTADO NATIVO),
• Preparación de liofilizado (Conservar su estado nativo)
• MEDIR VOLÚMENES antes y después de concentración (FACTOR DE CONCENTRACIÓN)
• Dilución
• Mismo solvente de obtención de la muestra
• Se asegura con múltiples determinaciones (TRIPLICADO)
• Se sugiere el uso de factor de corrección
• Determinaciones por triplicado sin diluir Vol MP = Vol de muestra proteíca
• Luego de diluir medir por triplicado y multiplicar por factor de dilución
Vol D = Vol de diluyente o solvente con el
• Se reporta el promedio de los 6 valores obtenidos que se va a diluir la solución
• Se puede reportar la desviación estándar x ± s
En dado caso el rango que puede medir una concentración tiene que
estar dentro del rango de la calibración, si se sale hay dos casos:
1. Inferior al límite de detección
2. Superior al límite de detección
Separación de aa y proteínas
martes, 1 de marzo de 2022 17:20

1 estrella

SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS

• Estructura y función de las proteínas es el resultado del estudio de proteínas individuales

• Necesidad de ser separadas de los demás componentes celulares y purificadas
• Análisis en cuanto a su composición de aa, estructura tridimensional, función entre otros

Como se separan:
• Por propiedades
○ Tamaño, carga y propiedades de unión
• Técnicas
○ Salting out, cromatografía, electroforesis etc

2 estrellas

• Método para separar los componentes de una mezcla

• Estis sin separados en una columna absorbente dentro de un sistema fluyente

5 estrellas

6 estrellas

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

• Muestras para análisis se coloca en una capa fina adsorbente

• La muestra se une mediante fuerzas electrostáticas a la fase estacionaria

8 estrellas

Rf - son variables entre cada corrida

9 estrellas

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10 estrellas

11

12

LAB página 4
14 estrellas

LAB página 5
16

LAB página 6
Aislamiento y propiedades de la Hb
viernes, 11 de marzo de 2022 16:49

OBJETIVOS
• Describir las características de los derivados de hemoglobina:
○ Oxihemoglobina
○ Desoxihemoglobina
○ Nitrosilhemoglobina
○ Metahemoglobina
• Explicar la importancia de los derivados de hemoglobina y su implicación de su presencia en los seres humanos
• Determinar el espectro de absorción de
○ Metahemoglobina
○ Oxihemoglobina
○ Desoxihemoglobina
○ Carboxihemoglobina
○ Ciano metahemoglobina
Utilizando un simulador de espectrofotometría

• Explicar la cinética de formación de metahemoglobina a partir de oxihemoglobina utilizando una gráfica de cambios de absorban cia a distintas longitudes de onda por unidad de tiempo

GENERALIDADES
Hemoglobina
• Proteína globular
• Presente en glóbulos rojos
• Transporta O2, CO2 y H+
• Proteína conjugada con PM de 645000 Da
• Dos cadenas alfa y dos beta (dos delta en recién nacidos)
• 4 grupos hemo

La Histidina proximal al grupo Hemo estabiliza el complejo de coordinación entre el hierro

y anillo de protoporfirina IX (4 enlaces de coordinación)

Quinto enlace de coordinación con el N del imidazol de un residuo de histidina proximal

Capacidad de transporte
Por cada litro de sangre hay 150 g de Hb

Cada gramo de Hb se disuelve 1.34 mL de O2, esto equivale a 200 mL 2 de O2 por litro de
sangre

87 veces más de lo que puede transportar el plasma solo

El estado de afinidad de la Hb: el enlace de coordinación con histidina permite el

acoplamiento del O2

El estado T - Es el menos afín al oxígeno

Estado R
El estado R - Tiene mayor afinidad al oxígeno
Los residuos de histidina contribuyen al estado R

El estado T disminuye la posibilidad del enlace de coordinación con el O2, debido a su

posición.

Afinidad de la Hb por el O2

• Una molécula de Hb puede unirse a 4 moléculas de O2

• La unión del primer O2 modifica la conformación de la Hb y favorece la unión de la
siguiente molécula

• Con una pO2 de 20mmHg la afinidad de la Hb por el O2 es de 25%

• Con una pO2 de 40mmHg la afinidad es del 75%

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 • Con una pO2 de 40mmHg la afinidad es del 75%

• Con una pO2 de 100mH la afinidad es del 100%

Derivados de Hb

Desoxihemoglobina: No tiene un O2 unido

Tiene Fe2+
Es fisiológica
Oxihemoglobina: Tiene un O2 unido

Tiene Fe2+
Es fisiológica

Variantes:

Carboxihemoglobina
• Es patológica.
• Tiene Fe2+
• Tiene como ligando CO
• La Hb prefiere a CO, este se une 250 más fuerte que el O2.

Metahemoglobina
• Es patológica
• Es en donde el Fe2+ pasa a ser Fe3+

Nitrosilhemoglobina
• El Fe varía dependiendo del agente biológico
• El óxido nítrico es un mensajero biológico
• Reacciona con
○ OxiHb
○ DesoxiHb
Para formar NitrosilHb

• La NitrosilHb se oxida hasta

○ MetaHb
○ Nitrato

PRINCIPIOS

Espectro de absorción de los derivados de Hb

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Espectro de absorción de los derivados de Hb

lieber

Debido a los cambios de color se puede cuantificar

por medio de la espectrometría

Agente oxidante: la desoxi-Hb para a convertirse a una Meta-Hb (el Fe2+ pasa a Fe3+ = NO PUEDE ACCAREAR OXÍGENO)

• El estado Fe3+ ya no es funcional

• El NADPH pasa el Fe3+ a Fe2+

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 En caso de la Oxy-Hb se elige el segundo pico porque a esa longitud de onda los demás no
tienen relación en cuanto a la absortividad

LAB página 10
Cinética enzimática
martes, 15 de marzo de 2022 17:25

Enzimas Moléculas biológicas con acción catalítica LAS ENZIMAS SOLO AUMENTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN
Catálisis Acelerar una reacción por medio de bajar la demanda energética normal que requiere una reacción
Sitio activo Lugar de la enzima en donde se tiene lugar la reacción catalizada NO AFECTAN EL EQUILIBRIO DE LA REACCION
Sustrato Molécula fijada en el sitio activo y sobre la que actúa la enzima

REACCIÓN SIN
CATALIZAR

MODELO FISCHER (LLAVE

CERRADURA)

Se mencionaba que una enzima era muy específica al sustrato, al encajar perfectamente se llega a una
estabilidad, por lo que no llega a ocurrir nada, la energía no se disminuye, en cambio aumenta, por lo que este
modelo no funciona para la enzimas
MODELO DE ESTADO DE
TRANSICIÓN

El estado de transición pasa muy rápido, este NO ES ESTABLE, por lo que este modelo en vez de ser
específico para el sustrato, es específico para EL ESTADO DE TRANSICIÓN, el cual se rompe y se
convierte en el producto

CATÁLISIS ENZIMÁTICA

• Concentración de sustrato: por lo general está en mmol, se sitúa en el eje X

• Velocidad de reacción: se expresa en uM/min
• Vel máx.: es la velocidad de la reacción cuando la enzima llegue a su punto máximo de
actividad
• Km: Constante de Michaelis-Menten, indica la concentración de sustrato en la cual la
enzima alcanza la mitad de la velocidad máxima

Factores que afectan la velocidad:

• Temperatura
• Sales y aquellos que tienen que ver con la acidez
• Concentración de sustrato

A bajas concentraciones [C], la velocidad de reacción es casi proporcional a la

concentración del sustrato

Mientras más alta [C] del sustrato, la cantidad de sitios activos ocupados de la enzima, por
lo tanto esta se satura hasta alcanzar un máximo. En estas concentraciones se podría
alcanzar la velocidad máxima

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 A bajas concentraciones [C], la velocidad de reacción es casi proporcional a la
concentración del sustrato

Mientras más alta [C] del sustrato, la cantidad de sitios activos ocupados de la enzima, por
lo tanto esta se satura hasta alcanzar un máximo. En estas concentraciones se podría
alcanzar la velocidad máxima

Cinética Michaelis-Menten

• Propuesta en 1913, explica como una reacción catalizada por enzimas posee una V
constante que llegado a cierto punto, disminuye debido a la disminución de sitios
activos disponibles, este punto limitante (Vmax) es virtualmente inalcanzable.

• La ecuación de Michaelis-Menten conocida como la ecuación de velocidad de una

reacción catalizada enzimáticamente con un sustrato

• Es una relación cuantitativa entre Vo, Vmax y [S], relacionados por el Km

Al inicio de la reacción es donde se tiene la pendiente más alta

Transformación de Lineweaver-Burk

LAB página 12
LAB página 13
PQ de carbohidratos
martes, 29 de marzo de 2022 17:18

CARBOHIDRATOS Son polihidroxicetonas o polihidroxialdehídos (lineales o cíclicas) y sus derivados

(CH2O)n
El carbono de la glucosa se toma como centro quiral

El gliceraldehído se usa como molécula de referencia para la configuración relativa de carbohidratos

Estructura Cíclica Enlace covalente con el oxígeno de un hidroxilo presente en la misma cadena generando un nuevo centro quiral

Funciones • Señalización
• Estructura o soporte
• Se oxidan para convertirse en energía

MOLISCH • No detecta exclusivamente glicoproteínas, si no la parte del carbohidrato de este

• Deshidratación con ácido fuerte, que al condensarse con el reactivo de Molisch forma furfural o derivados que reaccionan con a-naftol
• Detecta la presencia de azucares

BENEDICT • Evidencia la presencia de azucares reductores a partir de reducción del ión Cu 2+

• Los azucares reductores (lactosa, maltosa, etc.) - son los que tienen un OH anomérico libre
○ Este proviene de los hemiacetales
• Por esta razón pueden oxidarse

MEDIO: CITRATO

BARFOED Test para monosacáridos

• Está basado en la reducción de Cu 2+ a Cu 1+
• Forma un ppt rojo ladrillo

La maltosa da POSITIVO por el otro OH extra que tiene

Fehling & Tollens Para azúcares reductores

En ambas en general el producto final es un RCOOH

Fehling: Rojo-ladrillo Tollens: Brillo metálico

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FENILHIDRAZONA • Reacción con fenilhidrazina
U OSAZONAS • Forman cristales de diferentes características, llamados osazonas
• Estos identificas propiedades físicas

No se puede diferenciar la fructosa de la glucosa,

porque el resto de la cadena carbonada es igual

También en Carbohidratos análogos

YODO O LUGOL

LAB página 15
Lípidos
martes, 5 de abril de 2022 17:21

• Es el grupo más diverso de biomoléculas estructuralmente (En funciones lo hacen las proteínas)

• Insolubles en agua, pero solubles en disolventes orgánicos

Funciones • Almacenamiento de energía

• Estructurales
•
• Impermeabilizantes
• Señalizadores químicos

ESTRUCTURA DE LÍPIDOS

Componentes de lípidos complejos Ácidos grasos, glicerol, ácido fosfórico, azúcares

Ácidos grasos RCOOH de 14-36 C pueden ser saturados o con insaturaciones específicas
Triglicéridos Se forman al unirse 3 ácidos grasos con glicerol
Anfipáticos Tienen regiones apolares y polares en la misma molécula
Interacciones Pueden interactuar con moléculas hidrofílicas e hidrofóbicas

FUNCIONES - MEMBRANAS DE LOS LÍPIDOS

• Las bicapas proveen la arquitectura fundamental de las membranas biológicas
• Producto de un arreglo macromolecular estabilizados por interacciones no covalentes
• Las membranas biológicas son estructuras muy diversas y complejas, formadas por diversos tipos de proteínas, fosfolípidos, glicolípidos, esteroles, etc.

Características Impermeable a moléculas grandes y cargadas

Función • Delimitación del entorno
• Comunicación
• Transporte selectivo de sustancias
• Transducción de energía

MÉTODOS

Reacción de Lieberman-Burchard
• El anhídrido acéticos se condensa con el -OH del C3 del colesterol
• En presencia de H2SO4 se produce una epimerización y una deshidratación formando un compuesto de color azul-verdoso

Reacción de halogenación de lípidos

Presencia de dobles enlace Se puede usar para cuantificar la presencia de insaturaciones

Diversidad de pruebas
Ataque nucleofílico
Decoloración del halógeno
Existen varios métodos como
• Prueba de Hanus
• Índice de yodo en grasas y aceites
Los halógenos se unen a los átomos de carbono por un ataque nucleofílico
Mientras más dobles enlaces más se decolora el halógeno

LAB página 16
LAB página 17
Aislamiento y separación de AN
martes, 19 de abril de 2022 17:23

LAB página 18
LAB página 19
LAB página 20