PRCTICAS DE FISIOLOGA VEGETAL EXTRACCIN DE CLOROPLASTOS Y MEDIDA DE LA REACCIN DE HILL EN CLOROPLASTOS AISLADOS

1. INTRODUCCIN En 1939, Robin Hill y col. encontraron que una suspensin de cloroplastos aislados puede desprender O2 en presencia de luz, si se suministra un compuesto oxidado capaz de aceptar electrones procedentes de la fotolisis del agua. De esta forma, el proceso de desprendimiento de O2 en la fotosntesis pudo ser separado del de la fijacin de CO2. En la hoja intacta, los principales aceptores naturales de electrones son la ferredoxina y el NADP, pero se inactivan durante el proceso de aislamiento de los cloroplastos. in vitro, estos aceptores naturales pueden sustituirse por el 2,6 diclorofenolindofenol (DCPIP). Este compuesto es azul en forma oxidada (quinona) pero se decolora lentamente cuando se reduce (fenol). La reaccin que tiene lugar es la siguiente: Luz DCPIP+ (azul) + H2O Cloroplastos

DCPIP-H (azul plido) + O2

En esta prctica se medir la fotosntesis a travs de la decoloracin del DCPIP mediante un espectrofotmetro. 2. MATERIAL Hojas frescas de espinaca Mortero y mano Papel de filtro Centrfuga y tubos Papel de aluminio Espectrofotmetro y cubeta Parafilm Gradilla con tubos de ensayo pyrex Probeta de 50 ml Erlenmeyer Embudo Varilla de vidrio Pipetas de 2 ml (2) y de 1 ml (1) Vaso de precipitados de 50 ml Solucin de sacarosa 0.5 M Propilenglicol al 10% DCPIP al 0.1% Tampn fosfato 0.1 M pH 6.5 con ClK 0.08 M Foco

3. METODOLOGA Aislamiento de cloroplastos. Pesar 6 g de hojas de espinaca previamente desnerviadas y lavadas dos veces con agua destilada fra. Cortar las hojas en pequeos trozos y macerar en un mortero (si es posible con arena de cuarzo limpia) y 2 ml de sacarosa 0.5 M e ir completando paulatinamente hasta 10 ml con la misma solucin .

Filtrar el homogenado obtenido a travs de papel de filtro y recogerlo sobre un tubo de centrfuga Centrifugar el filtrado durante 10 min a 1000 r.p.m. Eliminar el precipitado y volver a centrifugar el resto de sobrenadante durante 10 min a 2500 r.p.m. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado que contiene los cloroplastos aislados en 6 ml de propilenglicol al 10% agitando con una varilla o un pincel. Tomar 2 ml de esta suspensin de cloroplastos en un tubo de ensayo pyrex y llevarla a ebullicin . Enfriar con agua. Reaccin de Hill. Preparar 3 tubos de ensayo siguiendo el esquema que a continuacin se expone.

Tubo Solucin tampn Suspensin cloroplastos hervidos Suspensin cloroplastos frescos

1 9 ml 0.5 ml

2 9 ml 0.5 ml

3 9 ml 0.5 ml

A continuacin cubrir el tubo 2 con papel de aluminio con objeto de mantenerlo en oscuridad Seleccionar en el espectrofotmetro la longitud de onda de 590 nm (es la longitud de onda a la que absorbe el DCPIP) *Colocar un recipiente con agua a 30 cm del foco luminoso aunque sin encender todava ste. Aadir rpidamente 0.1 ml de la solucin de DCPIP al tubo 1. Agitar, poner una parte de la solucin en la cubeta de espectrofotmetro y medir la absorbancia a 590 nm. Situar el tubo en el recipiente con agua y encender el foco. Mirar la hora, y a partir de este momento, medir la absorbancia a los 3, 6 y 9 min. Apagar el foco. Repetir desde * para los tubos 2 y 3. Apagar el foco Anotar los resultados de absorbancia en el siguiente cuadro:

0 min
Tubo 1 cloroplastos hervidos tubo destapado Tubo 2 cloroplastos frescos tubo tapado Tubo 3 cloroplastos frescos tubo destapado Representa grficamente los resultados

3 min

6 min

9 min